CN104530069A - 荸荠皮提取荸荠乙素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的荸荠皮提取荸荠乙素的方法，属于天然有机化学领域。其特征在于，以丙酮水溶液为溶剂，粗提物用乙酸乙酯萃取后，经中压MCI柱色谱和聚酰胺柱色谱分离，然后用Sephadex LH-20凝胶和半制备型高效液相色谱制备，重结晶辅助纯化，所得产品含量在95％以上。本发明利用废弃的荸荠皮为原料提取分离得到荸荠乙素，分离效果好，产品纯度高，使荸荠皮变废为宝，所选用的层析材料MCI、聚酰胺、凝胶均可反复使用，原料易得，资源丰富，生产成本低，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种荸荠乙素的提取分离方法，特别是涉及一种从荸荠皮中提取分离荸荠乙素的方法。
背景技术
荸荠(Eleocharis tuberosa)，又称马蹄，属莎草科多年生浅水草本植物荸荠的地下球茎，我国大部分地区都有栽培。其中，广西荸荠产量占全国70％，贺州荸荠产量占广西70％。据文献报道，荸荠有抗菌、抗肿瘤、防治呼吸道疾病、利肠通便和利尿排淋等作用；临床上可用于治疗咽喉疼痛、痰热咳嗽、热病烦渴、小便不利、痢疾等症。研究表明，荸荠的活性物质主要富集在果皮和果肉之间。在荸荠加工过程中，被丢弃的荸荠皮质量约占新鲜荸荠质量的25％，资源非常丰富。我们在荸荠皮活性成分提取分离研究中发现荸荠乙素，属于二氢黄酮化合物。荸荠乙素为圣草酚的衍生物。该化合物具有抗氧化、抗炎、镇痛等多种药理活性以及调节心血管系统、保护神经系统、利尿、改善糖尿病等作用，在食品上常用作饮料、食品和酒类的抗氧化剂。荸荠乙素结构特别，属于圣草酚的苯并吡喃衍生物。该类衍生物因具有显著的抗HIV、抗肿瘤等活性而受到广泛的关注。荸荠乙素存在于莎草科植物荸荠的果皮中。荸荠乙素是从荸荠皮中分离得到新化合物。
目前，未见从荸荠皮中提取分离荸荠乙素的文献报道。经中国公开专利检索，没有发现与本专利申请相同的技术方案。
发明内容
本发明的目的在于：提出一种荸荠皮提取荸荠乙素的方法。
荸荠乙素化学结构式如下：
本发明的荸荠皮提取荸荠乙素的方法，其特征在于:应用常规提取法和MCI、聚酰胺、凝胶以及半制备型高效液相色谱技术从荸荠皮中提取分离荸荠乙素，其具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用；以重量计，称取荸荠皮粉末1份加入提取罐中，每次加入4-10份70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，浸泡3次；过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物；
(2)以重量计，取步骤(1)的提取物1份，分散在5份水中，制成悬浊液，每次加入5-10份乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干,得萃取物；
(3)以重量计，取步骤(2)的萃取物1份，加入甲醇至完全溶解，用2-4份聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，以甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩至干,得粗品A；
(4)以重量计，取步骤(3)的粗品A 1份，加入甲醇至完全溶解，加入2-4份聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入聚酰胺色谱柱进行分离，用体积比为5:1-2:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:49:1的混合液作展开剂，用薄层色谱法检测，收集合并Rf为0.7的洗脱液，减压浓缩至干,得粗品B；
(5)以重量计，取步骤(4)的粗品B 1份，溶于4-8份甲醇中，加入等甲醇体积的水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:49:1的混合液作展开剂，用薄层色谱法检测，收集合并Rf为0.7的洗脱液，减压浓缩，得粗品C；
(6)以重量计，取步骤(5)的粗品C 1份，溶于2-5份甲醇中，以280nm为紫外检测波长，以62-68％体积百分比的甲醇水溶液为流动相，用4.6mm×25cm的Zorbax SB-C18柱进行高效液相色谱分析，用9.4mm×25cm的ZorbaxSB-C18柱进行半制备纯化，按21.38—32.51min的出峰时间，收集色谱峰中阀值不小于20mAU的洗脱液，减压浓缩，即得产品。
所述步骤(3)中的所述的MCI柱规格为70×460mm，填充材料为MCI-gelCHP-20P，柱色谱条件为：柱压为80Psi，流动相流速为50mL/min，检测波长为245nm；所述的流动相为40-100％体积百分比的甲醇水溶液。
所述步骤(4)中所述的聚酰胺规格为200-300目；所用洗脱液为体积比为5:1-3:1的氯仿-甲醇溶液。
所述步骤(6)中的所用色谱柱为Zorbax SB-C18(9.4mm 25cm)柱；所述甲醇浓度范围为62-68％体积百分比。
本发明与现有技术相比其有益效果是：设计科学合理，利用废弃的荸荠皮为原料提取分离得到荸荠乙素，分离效果好，产品纯度高，使荸荠皮变废为宝，所选用的层析材料MCI、聚酰胺、凝胶均可反复使用，原料易得，资源丰富，生产成本低，具有较好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的方法，其特征在于:应用常规提取法和MCI、聚酰胺、凝胶以及半制备型高效液相色谱技术从荸荠皮中提取分离荸荠黄酮单体，其具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用。称取一定质量(g)的荸荠皮粉末加入提取罐中，再加入4-10倍体积(mL)的70％体积百分比的丙酮水溶液，在25o下浸泡24h，浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物。
(2)将提取物(g)分散在5倍体积(mL)的水中制成悬浊液，用1-2倍水体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物。
(3)往萃取物中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍萃取物质量的聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，柱规格为70mm×460mm，填充材料为日本三菱化学公司生产的MCI-gel CHP-20P，柱色谱条件为：柱压为 80Psi，流动相流速为50mL/min，检测波长为254nm，以40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，根据检测峰变化情况调节洗脱液浓度，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A。
(4)往粗品A中加入甲醇至完全溶解，加入2-4倍质量的聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入聚酰胺色谱柱进行分离，用体积比为5:1-2:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测，展开剂为石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:49:1，收集合并Rf为0.7的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B。
(5)将粗品B(g)溶于4-8倍体积(mL)的甲醇中，加入等甲醇体积的水制成悬浊液，用瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司生产的Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，展开剂为石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:49:1，收集合并Rf为0.7的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C。
(6)以重量计，取步骤(5)的粗品C 1份，溶于2-5份甲醇中，以280nm为紫外检测波长，以62-68％体积百分比的甲醇水溶液为流动相，用4.6mm×25cm的Zorbax SB-C18柱进行高效液相色谱分析，用9.4mm×25cm的ZorbaxSB-C18柱进行半制备纯化，按21.38—32.51min的出峰时间，收集色谱峰中阀值不小于20mAU的洗脱液，减压浓缩，即得产品。
具体实验例及检测结果：
(1)将8kg新鲜荸荠皮粉末加入在提取罐中，加入32L 70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，共浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩膏状，获得提取物1.05kg。
(2)将提取物加入5.0L水中制成浑浊液，用5.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，获得萃取物120g。
(3)往萃取物中加入300mL甲醇溶解，用260g聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，用40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A 31g。
(4)将粗品A溶于90mL甲醇中，加入60g聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入聚酰胺柱进行分离，用体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测(展开剂为石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:49:1)，收集合并Rf为0.7的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B 3.2g。
(5)将粗品B溶于15mL的甲醇中，加入15mL水制成悬浊液，用SephadexLH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，展开剂为石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:49:1，收集合并Rf为0.7的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C 0.35g。
(6)将所得粗品C溶于2.0mL的甲醇中，以62-68％体积百分比的甲醇水溶液为流动相，用半制备型高效液相色谱纯化，具体实施方式如表1。
表1半制备型高效液相色谱纯化分离实施方式
(7)所得物质通过1H-NMR、13C-NMR、IR、HREIMS和UV波谱技术进行结构鉴定。波谱数据证实，所提取纯化得到的物质为荸荠乙素，化学结构式如下：
荸荠乙素(Eleocharin B)，黄色无定形粉末，化学名为(-)-(2S)-5,3′,4′-三羟基-6″,6″-二甲基吡喃-[2″,3″:6,7]-二氢黄酮；[α]17D:–10.0(c 1.32,MeOH)；IR(KBr)νmax:3425,2924,1644,1570,1447,1298,1156,1116cm-1；UV(MeOH):λmax(logε)358.0(3.43),272.0(4.60),227.0(4.29),202.0(4.66)nm；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:5.41(dd,J＝12.6,3.0Hz,H-2)，3.26(dd,J＝16.8,12.6Hz,H-3α)，2.70(dd,J＝16.8,3.0Hz,H-3β)，5.92(s，H-8),6.87(s,H-2′),6.74(overlapped,H-5′),6.74(overlapped,H-6′),6.50(d,J＝10.2Hz,H-4″),5.65(d,J＝10.2Hz,H-5″),1.39(s,3H,CH3-6″),1.38(s,3H,CH3-6″),12.48(s,HO-5),9.09(s,HO-3′),9.15(s,HO-4′)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:78.8(d,C-2),42.1(t,C-3),197.3(s,C-4),157.5(s C-5),102.1(s,C-6),161.2(s,C-7),95.7(d,C-8),162.4(s,C-9),102.5(s,C-10),129.2(s,C-1′),114.5(d,C-2′),145.3(s,C-3′),145.9(s,C-4′),115.4(d,C-5′),118.2(d,C-6′),114.6(d,C-4″),127.1(d,C-5″),78.3(s,C-6″),28.0(q,CH3-6″),27.9(q,CH3-6″)；ESIMS(negative-ionmode)m/z 353[M–H]–；HREIMS m/z 354.1091[M]+,分子式C20H18O6的计算值为,354.1103。
Claims (3)
1.一种荸荠皮提取荸荠乙素的方法，包括提取、萃取；其特征在于：其具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用；以重量计，称取荸荠皮粉末1份加入提取罐中，每次加入4-10份70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，浸泡3次；过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物；
(2)以重量计，取步骤(1)的提取物1份，分散在5份水中，制成悬浊液，每次加入5-10份乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干,得萃取物；
(3)以重量计，取步骤(2)的萃取物1份，加入甲醇至完全溶解，用2-4份聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，以甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩至干,得粗品A；
(4)以重量计，取步骤(3)的粗品A1份，加入甲醇至完全溶解，加入2-4份聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入聚酰胺色谱柱进行分离，用体积比为5:1-2:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:49:1的混合液作展开剂，用薄层色谱法检测，收集合并Rf为0.7的洗脱液，减压浓缩至干,得粗品B；
(5)以重量计，取步骤(4)的粗品B1份，溶于4-8份甲醇中，加入等甲醇体积的水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:49:1的混合液作展开剂，用薄层色谱法检测，收集合并Rf为0.7的洗脱液，减压浓缩，得粗品C；
(6)以重量计，取步骤(5)的粗品C1份，溶于2-5份甲醇中，以280nm为紫外检测波长，以62-68％体积百分比的甲醇水溶液为流动相，用4.6mm×25cm的Zorbax SB-C18柱进行高效液相色谱分析，用9.4mm×25cm的Zorbax SB-C18柱进行半制备纯化，按21.38—32.51min的出峰时间，收集色谱峰中阀值不小于20mAU的洗脱液，减压浓缩，即得产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的所述的MCI柱规格为70×460mm，填充材料为MCI-gel CHP-20P，柱色谱条件为：柱压为80Psi，流动相流速为50mL/min，检测波长为245nm；所述的流动相为40-100％体积百分比的甲醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的聚酰胺规格为200-300目；所用洗脱液为体积比为5:1-3:1的氯仿-甲醇溶液。
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