CN104530070A - 荸荠甲素的提取方法 - Google Patents

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伍淑婕
罗杨合
方方
李行任
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Abstract

本发明的荸荠甲素的提取方法，特别涉及一种从荸荠皮中提取分离荸荠甲素的方法，属于天然有机化学领域，其特征在于，以丙酮水溶液为溶剂，提取荸荠皮中的荸荠甲素，提取物用乙酸乙酯萃取后，萃取物经中压MCI柱色谱和聚酰胺柱色谱分离，然后用Sephadex LH-20凝胶和RP-18色谱柱纯化，获得含量在95％以上的荸荠甲素甲产品。本发明利用被废弃的荸荠皮为原料提取分离荸荠甲素，分离效果好，产品纯度高，将荸荠皮变废为宝，所选用的层析材料MCI、聚酰胺、凝胶和RP-18均可反复使用，原料易得，资源丰富，生产成本低，可进行规模化生产，具有较好的应用前景。

Description

荸荠甲素的提取方法
技术领域
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种荸荠甲素的提取分离方法，特别是涉及一种从荸荠皮中提取分离荸荠甲素的方法。
背景技术
荸荠甲素(Eleocharin A)，化学名为8-(3,4-二羟基苯基)-5-羟基-2,2-二甲基-2H,6H-苯并[1,2-b:5,4-b′]二吡喃-6-酮，分子式为C20H16O6，分子量为352.0953，为黄色无定形粉末，溶于甲醇、乙醇。该化合物属于黄酮类化合物，为木犀草素的衍生物，该类衍生物具有如抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、消炎、抗过敏等多种药理活性。
荸荠(Eleocharis tuberosa)，又称马蹄，属莎草科多年生浅水草本植物荸荠的地下球茎，我国大部分地区都有栽培。其中，广西荸荠产量占全国70％，贺州荸荠产量占广西70％。据文献报道，荸荠有抗菌、抗肿瘤、防治呼吸道疾病、利肠通便和利尿排淋等作用；临床上可用于治疗咽喉疼痛、痰热咳嗽、热病烦渴、小便不利、痢疾等症。研究表明，荸荠的活性物质主要富集在果皮和果肉之间。在荸荠加工过程中，被丢弃的荸荠皮质量约占新鲜荸荠质量的25％，资源非常丰富。我们在荸荠皮活性成分提取分离研究中发现了荸荠甲素新化合物，但目前未见从荸荠皮中提取分离该化合物的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于：提出一种荸荠甲素的提取方法。
本发明的荸荠甲素的提取方法，利用常规提取法和MCI、聚酰胺、凝胶以及RP-18色谱技术提取分离化荸荠甲素，具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用；以重量计，称取荸荠皮粉末1份，加入提取罐中，每次加入4-10份70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物。
(2)以重量计，将提取物1份分散在5份水中制成悬浊液，用1-2倍水体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物。
(3)往萃取物中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍萃取物质量的聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，以40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A。
(4)往粗品A中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍质量的聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，转入聚酰胺色谱柱进行分离，用体积比为5:1-2:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B。
(5)以重量计，将粗品B1份溶于4-8份甲醇中，加入等量甲醇体积的水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C。
(6)以重量计，将所得粗品C1份溶于4-8份甲醇中，加入2倍甲醇体积的水制成悬浊液，用RP-18色谱柱纯化，用62-78％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，干燥，获得含量达95％以上的荸荠甲素产品。
所述步骤(3)中的所述的MCI柱规格为70×460mm，填充材料为MCI-gelCHP-20P，柱色谱条件为：柱压为80Psi，流动相流速为50mL/min，检测波长为245nm；所述的流动相为40-100％体积百分比的甲醇水溶液。
所述步骤(4)中所述的聚酰胺，规格为200-300目；所用洗脱液为体积比为5:1-3:1的氯仿-甲醇溶液。
所述步骤(6)中所述的RP-18柱层析材料为RP-18反相硅胶，孔径为50μm；所用洗脱液为62-78％体积百分比的甲醇水溶液。
本发明与现有技术相比其有益效果是：设计科学合理，利用废弃的荸荠皮为原料提取分离荸荠甲素，分离效果好，产品纯度高，使荸荠皮变废为宝，所选用的层析材料MCI、聚酰胺、凝胶及RP-18可反复使用，原料易得，资源丰富，生产成本低，可进行规模化生产，具有较好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的荸荠甲素的提取方法利用常规提取法和MCI、聚酰胺、凝胶以及RP-18色谱技术提取分离化荸荠甲素，具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用。称取一定质量(g)的荸荠皮粉末加入提取罐中，再加入4-10倍体积(mL)的70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物。
(2)将提取物(g)分散在5倍体积(mL)的水中制成悬浊液，用1-2倍水体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物。
(3)往萃取物中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍萃取物质量的聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，柱规格为70mm×460mm，填充材料为日本三菱化学公司生产的MCI-gel CHP-20P，柱色谱条件为：柱压为80Psi，流动相流速为50mL/min，检测波长为254nm，以40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，根据检测峰变化情况调节洗脱液浓度，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A。
(4)往粗品A中加入甲醇至完全溶解，加入2-4倍质量的聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入聚酰胺色谱柱进行分离，用体积比为5:1-2:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B。
(5)将粗品B(g)溶于4-8倍体积(mL)的甲醇中，加入等甲醇体积的水制成悬浊液，用瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司生产的Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C。
(6)将所得粗品C(g)溶于4-8倍体积(mL)的甲醇中，加入2倍甲醇体积的水制成悬浊液，用日本YMC公司生产孔径为50μm的RP-18反相硅胶色谱柱纯化，用62-78％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，干燥，获得含量达95％以上的荸荠甲素产品。
实施例1
将8kg新鲜荸荠皮粉末加入在提取罐中，加入32L 70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，共浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩膏状，获得提取物1.05kg。
将提取物加入5.0L水中制成浑浊液，用5.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，获得萃取物120g。
往萃取物中加入300mL甲醇溶解，用260g聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，用40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A 31g。
将粗品A溶于90mL甲醇中，加入60g聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入聚酰胺柱进行分离，用体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B 0.83g。
将粗品B溶于4.0mL的甲醇中，加入4.0mL水制成悬浊液，用SephadexLH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C 0.18g。
将所得粗品C溶于1.0mL甲醇中，加入2.0mL水制成悬浊液，用RP-18色谱柱纯化，用75％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，干燥，获得含量为95.3％的荸荠甲素7.0mg。
实施例2
将8kg新鲜荸荠皮粉末加入在提取罐中，加入32L 70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，共浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩膏状，获得提取物1.05kg。
将提取物加入5.0L水中制成浑浊液，用5.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，获得萃取物120g。
往萃取物中加入300mL甲醇溶解，用260g聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，用40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A 31g。
将粗品A溶于90mL甲醇中，加入60g聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入聚酰胺柱进行分离，用体积比为4:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B 0.96g。
将粗品B溶于4.0mL的甲醇中，加入4.0mL水制成悬浊液，用SephadexLH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C 0.19g。
将所得粗品C溶于1.0mL甲醇中，加入2.0mL水制成悬浊液，用RP-18色谱柱纯化，用70％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，干燥，获得含量为96.3％的荸荠甲素9.0mg。
实施例3
将8kg新鲜荸荠皮粉末加入在提取罐中，加入32L 70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，共浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩膏状，获得提取物1.05kg。
将提取物加入5.0L水中制成浑浊液，用5.0L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，获得萃取物120g。
往萃取物中加入300mL甲醇溶解，用260g聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，用40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，按每份500mL收集，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A 31g。
将粗品A溶于90mL甲醇中，加入60g聚酰胺拌样，将甲醇挥发干，转入聚酰胺柱进行分离，用体积比为3:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B 1.05g。
将粗品B溶于5.0mL的甲醇中，加入5.0mL水制成悬浊液，用SephadexLH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C 0.23g。
将所得粗品C溶于1.0mL甲醇中，加入2.0mL水制成悬浊液，用RP-18色谱柱纯化，用65％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，干燥，获得含量为95.6％的荸荠甲素8.5mg。
所得产品通过1H-NMR、13C-NMR、IR、HREIMS、UV进行结构鉴定。波谱数据证实，所纯化得到的荸荠甲素的化学结构式如下：
荸荠甲素，黄色无定形粉末。[α]16D:–17.5(c 1.09,MeOH)；IR(KBr)νmax:3432,1616,1564,1467,1451,1349,1273,1166,1127cm-1；UV(MeOH):λmax(logε)352.5(4.15),292.5(4.17),235.0(4.22),203.5(4.23)nm；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:6.72(s,H-3),6.54(s,H-8),7.39(s,H-2′),6.89(br s,H-5′),7.42(d,J＝7.7Hz,H-6′),6.59(d,J＝10.0Hz,H-1″),5.79(d,J＝10.0Hz,H-2″),1.42(s,3H,H-4″),1.42(s,3H,H-5″),13.44(br s,HO-5)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:164.3(s,C-2),103.0(d,C-3),181.9(s,C-4),155.6(s C-5),104.8(s,C-6),158.7(s,C-7),95.0(d,C-8),156.4(s,C-9),104.7(s,C-10),121.3(s,C-1′),113.5(d,C-2′),145.9(s,C-3′),150.1(s,C-4′),116.0(d,C-5′),119.2(d,C-6′),114.6(d,C-1″),129.1(d,C-2″),78.1(s,C-3″),27.9(q,C-4″),27.9(q,C-5″)；ESIMS(negative-ion mode)m/z 351[M–H]–；HREIMS m/z 352.0953[M]+,分子式C20H16O6的计算值为352.0947。

Claims (4)

1.一种荸荠甲素的提取方法，其具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用；以重量计，称取荸荠皮粉末1份，加入提取罐中，每次加入4-10份70％体积百分比的丙酮水溶液，在25℃下浸泡24h，浸泡3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物。
(2)以重量计，将提取物1份分散在5份水中制成悬浊液，用1-2倍水体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物。
(3)往萃取物中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍萃取物质量的聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，装柱，连接MCI柱进行中压分离，以40-100％体积百分比的甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，薄层色谱法检测，收集合并流动相浓度为70-90％体积百分比的洗脱液，减压浓缩，获得粗品A。
(4)往粗品A中加入甲醇至完全溶解，用2-4倍质量的聚酰胺拌样，将甲醇挥发至干，转入聚酰胺色谱柱进行分离，用体积比为5:1-2:1的氯仿-甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品B。
(5)以重量计，将粗品B1份溶于4-8份甲醇中，加入等量甲醇体积的水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品C。
(6)以重量计，将所得粗品C1份溶于4-8份甲醇中，加入2倍甲醇体积的水制成悬浊液，用RP-18色谱柱纯化，用62-78％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有荸荠甲素的洗脱液，减压浓缩，干燥，获得含量达95％以上的荸荠甲素产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的所述的MCI柱规格为70×460mm，填充材料为MCI-gel CHP-20P，柱色谱条件为：柱压为80Psi，流动相流速为50mL/min，检测波长为245nm；所述的流动相为40-100％体积百分比的甲醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的聚酰胺，规格为200-300目；所用洗脱液为体积比为5:1-3:1的氯仿-甲醇溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中所述的RP-18柱层析材料为RP-18反相硅胶，孔径为50μm；所用洗脱液为62-78％体积百分比的甲醇水溶液。
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