CN104524561B - 防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗，其制备方法为包括以下步骤：1)、以琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、约氏不动杆菌这三种菌作为致病菌，对每种致病菌分别进行如下处理：取OD600值为0.2的致病菌的菌悬液，加入甲醛溶液从而配制成甲醛浓度为0.2％的疫苗；将疫苗于37℃恒温箱中灭活处理96h；从而分别得3种致病菌的甲醛灭活苗；2)、将3种致病菌的甲醛灭活苗洗涤后离心，从而分别得3种致病菌的处理后灭活苗；3)、将3种致病菌的处理后灭活苗按照相同的体积比混合后并浓缩至原总体积的1/5，得防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗。本发明的全灭活疫苗，能用于防治棘胸蛙烂皮病，具有很好的推广使用价值。
Description
技术领域
本发明提供一种具有防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗制备方法及其用途。
背景技术
棘胸蛙养殖被认为是目前最具潜力的养殖项目之一，在中国长江以南地区发展较快。然而，病害严重影响了其进一步规模化发展。目前，应用免疫学技术防治水生动物细菌性疾病，已越来越多的受到各国水生动物疾病防治工作者的重视。相对于抗生素，研发“高效、实用、低价、安全”的疫苗防治技术逐渐成为国际水产疫病防控的主要问题。
疫苗的免疫方式在很大程度上决定了疫苗的使用与推广。周永灿(2001)等的研究表明，肌肉注射法免疫效果最好，其最高凝集抗体效价达426.7；与肌肉注射法相比，口服免疫法和喷雾免疫法的最高凝集抗体效价出现较晚。周末等人(2009)对林蛙红腿病进行免疫实验，结果显示肌肉注射法和口服免疫法均能取得较好的免疫效果，浸泡免疫法次之。
疫苗的保存期也是疫苗大规模使用的制约因素。胡成钰等(2001)在牛蛙红腿病菌苗免疫试验中对疫苗的保存期进行的研究，结果显示菌苗在4-10℃环境下，保存120～180d，攻毒试验蛙仍有70％左右的存活率。
烂皮病对棘胸蛙养殖业危害巨大，但到目前为止，对于该病的致病病原，尚没有统一的定论，目前发现的导致棘胸蛙烂皮病的致病菌主要有葡萄球菌(Staphylococcus)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)等。
上文中提及的参考文献具体如下：
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种使用安全且能有效防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)、以琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、约氏不动杆菌这三种菌作为致病菌，对每种致病菌分别进行如下处理：
取OD600值为0.2的致病菌的菌悬液，加入体积浓度为40％的甲醛溶液从而配制成甲醛的体积浓度为0.2％的疫苗；将所述疫苗于37℃恒温箱中灭活处理96h；从而分别得3种致病菌的甲醛灭活苗；
2)、将3种致病菌的甲醛灭活苗均分别进行如下处理：先于10000～12000rpm高速离心25～35min(较佳为于11000rpm高速离心30min)，然后用生理盐水洗涤，再于10000～12000rpm高速离心15min(较佳为于11000rpm高速离心15min)，从而分别得3种致病菌的处理后灭活苗；
3)、将3种致病菌的处理后灭活苗按照相同的体积比混合后并浓缩至原总体积的1/5，得防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗。
作为本发明的防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗的制备方法的改进：
步骤1)为：取OD600值为0.2的致病菌的菌悬液40ml，加入体积％为40％的的甲醛溶液200μl从而配制成甲醛的体积浓度为0.2％的疫苗。
作为本发明的防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗的制备方法的进一步改进：
步骤2)中用生理盐水洗涤的次数为3次。每次洗涤后均于10000～12000rpm高速离心15min(较佳为于11000rpm高速离心15min)。
备注说明：琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、约氏不动杆菌均为目前能轻易获得的不动杆菌。例如：琼氏不动杆菌可选用编号为1.8764的琼氏不动杆菌，鲁氏不动杆菌选用编号为1.8061的鲁氏不动杆菌，约氏不动杆菌选用编号为1.8030的约氏不动杆菌；上述3种菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
本发明还同时提供了按照上述方法制备而得的防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗。
本发明首先筛选和鉴定了棘胸蛙“烂皮病”病原菌，在此基础上，研制了致病菌株灭活苗，并测定疫苗的免疫力，以期实现棘胸蛙“烂皮病”的免疫防治。
本发明所提供的全灭活疫苗，具有使用方便、预防治疗并举、生产成本低、生产方便等特点，能用于防治棘胸蛙烂皮病，因而具有很好的推广使用价值。
本发明使用注射免疫法对棘胸蛙进行免疫，取得了较好的实验结果，对棘胸蛙蝌蚪、成蛙均能提供有效保护的长效疫苗的商品化生产和推广。
本发明全灭活疫苗的使用方法为：对棘胸蛙进行疫苗头部注射(0.1～0.2ml/只)，注射一次即可。
具体实施方式
下面的实施例有助于本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
以下％均为重量％。
下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、致病菌的筛选、鉴定，依次进行以下步骤：
1)、将患病濒死的棘胸蛙体表用无菌水冲洗、75％(体积％)酒精消毒，取其头部、腿部、排泄孔周围烂皮部位深层皮肤及病蛙肝脏组织，分别涂布于LB固体培养基中，30℃恒温培养24h。挑取不同形态的菌落进行进一步划线分离，直到获得纯培养。
LB固体培养基为常规培养基，具体如下：(均为质量浓度g/L)：蛋白胨20g，K2HPO4.3H2O2.5g，MgSO40.73g，甘油15.0ml，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1.0L；pH 7.0,121℃，15min灭菌。
2)、将上述步骤1)所得的单菌落采用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒(购自大连宝生物工程有限公司)提取每种菌株的基因组DNA，并以其为模板进行PCR扩增。PCR扩增引物为试剂盒内自带引物，扩增反应总体积为25μl，其中模板DNA1μl，PCRpremix 12.5μl，Forward primer 0.25μl，Reverse primer1 0.25μl，并用16S-free H2O加至25μl；循环条件为：94℃预变性5min，94℃ 1min，50～55℃ 1min，72℃延伸1.5min，30个循环后，72℃温育1.5min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，分离、回收、纯化、连接后送交上海生工有限公司测序部测序。
3)、将上述步骤2)所得的结果经Blast软件分析确定病菌所在属。结合分析结果确定主要致病菌，并进行生理生化试验鉴定菌种。
结果：从患烂皮病的棘胸蛙中共分离得到9株菌株。其16S rDNA序列分析结果表明这9株菌株分别属于摩根氏菌属(Morganella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)，其中不动杆菌属菌株约占62.5％。
最终确定不动杆菌属菌株为本实验菌株材料。
实施例2、回归感染实验
依次进行以下步骤：
1)、将以上所得主要致病菌(即，不动杆菌属)接种于LB液体培养基中，30℃扩大培养16h后，用无菌生理盐水配制成OD600值为0.1、0.2的混合感染液。实验组、对照组健康棘胸蛙各10只，酒精体表消毒后，实验组对其注射感染菌液，对照组同法注射等量生理盐水(表1)。于25℃培养桶中培养，观察记录发病情况，解剖濒死棘胸蛙并进行致病菌分离和鉴定(表2)。
表1 回归感染实验
回归感染结果表明：不动杆菌属菌株对棘胸蛙有较强的致病性，注射24h后实验组棘胸蛙死亡率达到70％。解剖并观察死亡的棘胸蛙，发现其烂皮症状及内脏病变与最初从养殖场获得的病蛙症状相似，而对照组棘胸蛙均表现正常。从回归感染的病蛙中共分离获得18株病菌，编号为1-18。16S rDNA成功测序7株，分析得知这7株菌株分别属于不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)，其中不动杆菌属菌株占71.4％。
分离菌株的染色观察结果表明：不动杆菌属的5株菌(编号2,4,7,8,16)为革兰氏阴性菌，生化鉴定结果见表2。参照《常见细菌系统鉴定手册》，该5株菌分别为：琼氏不动杆菌(2，8，16号菌株)，鲁氏不动杆菌(4号菌株)，约氏不动杆菌(7号菌株)。
表2、5株不动杆菌属分离菌生化鉴定结果
| 特性 | 2号 | 4号 | 7号 | 8号 | 16号 |
| 生长温度：44℃ | - | - | - | - | - |
| 41℃ | + | - | - | + | + |
| 37℃ | + | + | - | + | + |
| 甲基红 | - | - | - | - | - |
| 柠檬酸盐(西蒙氏) | + | - | + | + | + |
| 丙二酸利用 | - | - | - | - | - |
| 精氨酸利用 | + | - | - | + | + |
注：—，反应阴性；+，反应阳性。
实施例3、特异性免疫验证
1)、以琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、约氏不动杆菌为主要致病菌，进行扩大培养。
用无菌水配制置成OD600值为0.2的混合感染液270mL。备注说明：琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、约氏不动杆菌这3种菌在混合感染液中的浓度是一致的。
2)、取健康蛙8只，浸泡于感染菌液中，共计浸泡3天，并设置等量的对照组同法浸泡于无菌水中。
3)、浸泡完毕后，随机取样采集血清，用免疫球蛋白IgG含量测定试剂盒测定实验组及对照组棘胸蛙体内抗体IgG含量。
结果：实验组棘胸蛙体内抗体含量普遍高于对照组健康蛙体内的抗体含量，实验组棘胸蛙与对照组健康棘胸蛙体内的抗体含量存在极显著差异(P＜0.01)，其含量增长约83.80％(表3)。由此推断，棘胸蛙体内存在特异性免疫。
表3 实验组和对照组IgG含量比较
注：P<0.05:差异显著；P>0.05:差异不显著；P＜0.01:差异极显著
实施例4、烂皮病疫苗(防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗)的制备及检验
1)、以琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、约氏不动杆菌这三种菌作为致病菌，对每种致病菌分别进行如下处理：
取OD600值为0.2的致病菌的菌悬液40ml，加入40％(体积％)的甲醛溶液200μl从而配制成甲醛浓度为0.2％的疫苗；
备注说明：琼氏不动杆菌可选用编号为1.8764的琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌可选用编号为1.8061的鲁氏不动杆菌、约氏不动杆菌可选用编号为1.8030的约氏不动杆菌。上述3种菌株均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
将上述3种疫苗均于37℃恒温箱中分别进行48h、72h、96h的灭活处理；从而分别得3种致病菌48h/72h/96h的甲醛灭活苗。
3)、将同一处理时间下的3种致病菌的甲醛灭活苗合并后进行无菌检验：
取甲醛灭活苗，涂布于LB固体培养基中，30℃恒温培养进行无菌检验(培养时间为12h)；待其检验通过(即，满足培养基上无菌落生长现象的条件)后，进行如下步骤4)，否则，返回至步骤1)；
经上述检测后，3种致病菌96h的甲醛灭活苗无菌检验合格；而3种致病菌48h的甲醛灭活苗无菌检验不合格，3种致病菌72h的甲醛灭活苗无菌检验也不合格。
即，结果：试验结果显示，灭活处理48h和72h的甲醛疫苗仍有菌落生长，经96h甲醛灭活处理的疫苗无菌落生长，该疫苗通过无菌检验；
4)、将3种致病菌96h的甲醛灭活苗分别进行如下处理：11000rpm高速离心30min，然后用生理盐水洗涤3次(每次洗涤后均于11000rpm高速离心15min)，从而分别得3种致病菌的处理后灭活苗；
5)、将3种致病菌的处理后灭活苗按照相同的体积比混合后并浓缩至原总体积的1/5，得防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗。
6)、取3只健康棘胸蛙进行全灭活疫苗的头部注射(0.1ml/只)，对照组等量同法注射等剂量生理盐水，判断该全灭活疫苗的安全性。
注射该疫苗后观察4d，实验组和对照组的棘胸蛙均未出现死亡，表明该疫苗对棘胸蛙是安全无毒的。
实施例5、全灭活疫苗免疫棘胸蛙
1)、分实验组和对照组，每组20只健康棘胸蛙。
2)、采用头部注射法，实验组注射实施例1所得的全灭活疫苗(0.2ml/只)，对照组同法注射等量的生理盐水。
3)、免疫3天后，使用OD600值为0.2的菌悬液(取自已经患烂皮病的棘胸蛙体表及体内的病菌)进行注射头部注射，实验组和对照组棘胸蛙均为0.2ml/只。
4)、持续观察两组棘胸蛙的死亡情况，7d后统计其免疫保护率。并随机抽取实验组和对照组棘胸蛙各6只，检测体内的抗体IgG含量、总蛋白、免疫球蛋白含量。
疫苗免疫检验具体如下：
①、棘胸蛙免疫保护率(RPS)的检测：
持续观察注射攻毒活菌后的实验组和对照组棘胸蛙，计算免疫保护率。免疫保护率/％＝(对照组死亡率-实验组死亡率)/对照组死亡率×100％；
相对免疫保护率的测定结果如下：
20只头部皮下注射的实验组棘胸蛙中，累计死亡1只，存活率为95％；20只头部皮下注射的对照组棘胸蛙中，累计死亡4只，存活率为80％，相对免疫保护率为75％(表4)。
表4 受免和对照组棘胸蛙经活菌攻毒后的免疫保护力
②、总蛋白、免疫球蛋白、抗体效价的测定：
采集棘胸蛙心脏血，置于1.5ml离心管中，3000rpm离心3min制成血清备用。采用双缩脲蛋白定量测试盒(购自上海酶联生物有限公司)测定血清中总蛋白和免疫球蛋白的含量，采用免疫球蛋白IgG含量测定试剂盒(购自上海酶联生物有限公司)测定血清中抗体IgG含量，并以对照组血清作为对照。
特异性抗体含量的检测结果如下：
实验组和对照组的棘胸蛙血清IgG含量之间存在显著性差异，其中实验组棘胸蛙IgG含量较对照组增长约11.62％，说明棘胸蛙存在特异性免疫；同时，实验组的棘胸蛙体内的抗体含量水平较对照组有显著差异(P<0.05)，可见疫苗免疫对棘胸蛙具有一定的保护作用(表5)
表5 实验组和对照组IgG含量比较
血清总蛋白、免疫球蛋白的含量结果如下：
实验组和对照组棘胸蛙血清中总蛋白含量分别为366.431±36.422mg·ml-1和278.917±21.374mg·ml-1，增长31.37％，存在极显著差异(P<0.01)；实验组和对照组棘胸蛙血清中免疫球蛋白含量分别为204.144±31.584mg·ml-1和117.078±21.372mg·ml-1，增长了74.37％，存在极显著差异(P<0.01)(表6)。
表6 血清总蛋白及免疫球蛋白含量统计分析
5)、统计分析
①、所有数据均由平均数±标准差表示，数据经正态性检验，对照和试验组差异显著性由T检验进行，置信水平设在0.05，所有统计分析均由SPSS19.0软件运行。
蛙类是否存在特异性免疫及免疫的强弱是实现免疫防治蛙病的关键。由上述表3-6可以看出，本发明在测定受感染的棘胸蛙体内抗体IgG含量时，发现该含量显著增加，表明棘胸蛙对该致病菌具有较强的特异性免疫。由此可见，本发明筛选出棘胸蛙烂皮病致病菌，并在此基础上制成甲醛灭活疫苗，实现了运用棘胸蛙自身特异性免疫防治烂皮病的全新的治疗方法，实验结果也显示，该疫苗的免疫保护率达到了75％。
细菌性疾病是蛙类养殖中的一类常见疾病，本发明研制的疫苗安全、高效，对减少棘胸蛙养殖过程中抗生素的使用，解决因抗生素使用过量导致耐药菌株出现，保证食品的安全性，具有积极意义，也可为棘胸蛙的其他细菌性疾病的疫苗防治提供理论支持。以上结果说明，本发明是一种防预防棘胸蛙烂皮病效果最好的安全的、使用方便的疫苗制剂。
对比例1-1、鲁氏不动杆菌、约氏不动杆菌的配合
将实施例4步骤4)所得的鲁氏不动杆菌处理后灭活苗、约氏不动杆菌处理后灭活苗按照相同的体积比混合后并浓缩至原总体积的1/5，得全灭活疫苗Ⅰ。
对比例1-2、琼氏不动杆菌、约氏不动杆菌的配合
将实施例4步骤4)所得的琼氏不动杆菌处理后灭活苗、约氏不动杆菌处理后灭活苗按照相同的体积比混合后并浓缩至原总体积的1/5，得全灭活疫苗Ⅱ。
对比例1-3、琼氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌的配合
将实施例4步骤4)所得的琼氏不动杆菌处理后灭活苗、鲁氏不动杆菌处理后灭活苗按照相同的体积比混合后并浓缩至原总体积的1/5，得全灭活疫苗Ⅲ。
全灭活疫苗Ⅰ、全灭活疫苗Ⅱ、全灭活疫苗Ⅲ按照实施例4步骤6)的方法进行安全性检测，结果均为：注射该疫苗后观察4d，实验组和对照组的棘胸蛙均未出现死亡，表明该全灭活疫苗Ⅰ、全灭活疫苗Ⅱ、全灭活疫苗Ⅲ对棘胸蛙均是安全无毒的。
对比实验：
将上述全灭活疫苗Ⅰ、全灭活疫苗Ⅱ、全灭活疫苗Ⅲ分别替代实施例1所得的全灭活疫苗，其余内容等同于实施例5。
①、免疫保护力的结果如下表7所示：
表7 受免和对照组棘胸蛙经活菌攻毒后的免疫保护力
②、总蛋白、免疫球蛋白、抗体效价的测定：
特异性抗体含量的检测结果如下：
表8 实验组和对照组IgG含量比较
血清总蛋白、免疫球蛋白的含量结果如下表9：
表9 血清总蛋白及免疫球蛋白含量统计分析
根据上述表7～表9，我们得知：全灭活疫苗Ⅰ、全灭活疫苗Ⅱ、全灭活疫苗Ⅲ均低于本发明的全灭活疫苗疫苗的使用效果。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)、以琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)这三种菌作为致病菌，对每种致病菌分别进行如下处理：
取OD600值为0.2的致病菌的菌悬液，加入体积浓度为40％的甲醛溶液从而配制成甲醛的体积浓度为0.2％的疫苗；将所述疫苗于37℃恒温箱中灭活处理96h；从而分别得3种致病菌的甲醛灭活苗；
2)、将3种致病菌的甲醛灭活苗均分别进行如下处理：先于10000～12000rpm离心25～35min，然后用生理盐水洗涤，再于10000～12000rpm离心15min，从而分别得3种致病菌的处理后灭活苗；
3)、将3种致病菌的处理后灭活苗按照相同的体积比混合后并浓缩至原总体积的1/5，得防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗的制备方法，其特征是：
所述步骤1)为：取OD600值为0.2的致病菌的菌悬液40ml，加入体积浓度为40％的甲醛溶液200μl从而配制成甲醛的体积浓度为0.2％的疫苗。
3.根据权利要求1或2所述的防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗的制备方法，其特征是：
步骤2)中用生理盐水洗涤的次数为3次。
4.如权利要求1～3任一所述方法制备而得的防治棘胸蛙烂皮病的全灭活疫苗。
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