ES2387436B1 - Vacuna frente a acinetobacter - Google Patents

Abstract

Vacuna frente a Acinetobacter.#La invención se refiere a una composición que comprende células inactivadas del género Acínetobacter y/o proteínas aisladas de las mismas y a su uso para la elaboración de un medicamento, preferiblemente una vacuna, para la prevención de enfermedades producidas por un organismo del género Acínetobacter. Estas composiciones generan una respuesta inmune, que permite proteger a pacientes frente a enfermedades producidas por organismos de este género, las cuales resultan muy comunes en pacientes ingresados en hospitales.

Description

VACUNA FRENTE A ACINETOBACTER

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y la inmunología. Específicamente, se refiere a una composición que comprende

células inactivadas del género Acinelobacler y/o proteínas aisladas de las

mismas y al uso de esta composición como medicamento para la prevención de enfermedades provocadas por organismos de este género.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El organismo Acinetobacter baumannií es un bacilo gram negativo aerobio yes

agente causal de multitud de enfermedades nosocomiales. El aumento de las enfermedades nosocomiales en la actualidad se debe a la aparición de cepas

de este organismo tanto multirresistentes como panresistentes a antibióticos en hospitales. Debido a la aparición de estas cepas, se hace necesaria la

búsqueda de nuevas estrategias para el tratamiento de estas enfermedades.

Las infecciones por A. baumannii cursan con diferentes síntomas, y causan

diversos tipos de infección en función de la vía de entrada en el huésped. La

vía de entrada más común son las vías respiratorias, lo que provoca neumonías en multitud de casos. Este tipo de infección presenta un elevado riesgo de muerte. Estas neumonías suponen un 6,9% de las neumonías de

pacientes ingresados en la UCI en Estados Unidos (Gaynes el al. 2005, Glin Inlecl Ois, 41 :848-854), un 9,6% en America Latina (Gales el al. 2002, Oiagnoslic microbiology and inlectious disease, 44:301-311) , un 27% en Turquía (Meric el al. 2005, Japanese joumal 01 inlectious diseases, 58:297-302) y un 35% en India (Agarwal el al. 2006, The joumal 01 inlection, 53:98-105). La

tasa de muerte asociada a neumonias nosocomiales generadas por A.

baumannii es elevada y varía entre el 35% y el 70% (Fagon el al. 1996, Glin InleclOis, 23:538-542; Fagon el al. 1993, The American joumal 01 medicine, 94:281-288; Garnacha-Montero el al. 2005, Inlensive care medicine, 31 :649

655). Además de estas neumonías nosocomiales, este organismo genera

también neumonías adquiridas en la comunidad (Community-acquired

pneumonia o CAP) las cuales presentan una alta mortalidad.

Este organismo también genera bacteriemias, las cuales suponen un 6,2% de

5

las bacteriemias de pacientes de UCI en Estados Unidos. La bacteriemia en

estos casos produce entre un 20% y un 60% de mortalidad (Wisplinghoff el al.

2000, Glin Inlecl Dis, 31 :690-697). En España A. baumannii es el responsable

del 27% de las bacteriemias causadas por bacterias gram-negativas (Cisne ros

el al. 1996, Glin Inlecl Dis, 22:1026-1032).

10

Además, A. baumannii en España supone la tercera causa más común de

meningitis (Moreno et al. 1990, Enfermedades infecciosas y microbiología

clínica, 13:281-286), y la segunda causa de infecciones por quemaduras

(Frame el al. 1992, The ¡oumal 01 bum care & rehabifitation, 13:281-286).

t S

Todo lo anterior muestra la necesidad de encontrar tratamientos para las

infecciones causadas por A. baumannii para evitar todas estas complicaciones.

El tratamiento habitual hasta el momento era el uso de antibióticos que

20

actuasen frente a estas bacterias. El problema con estos tratamientos surgió

cuando en las dos últimas décadas aparecieron cepas resistentes a los

mismos. De esta forma se observa un elevado número de aislados de la

bacteria que presentan resistencias a diversos antibióticos, como por ejemplo,

a la ceftazidima (entre un 24% y un 67%), a amikacina (entre el 3% y el 20%), o

2S

a imipenem (hasta el 20%) (Gaynes el al. 2005, Gfin Inlecl Dis, 41 :848-854).

También se ha observado que un 40% de cepas aisladas son resistentes a

ciprofloxacino, un 30% a levofloxacino, un 26% a gentamicina y un 22% a

cefepima (Rhomberg et al. 2007, Diagnostic microbiology and infectious

disease, 59:425-435). Todo esto ha llevado a la existencia de un elevado

30

número de cepas multirresistentes a varios antibióticos con excepción de la

coJistina. En los últimos años también se ha observado la emergencia de cepas

panresistentes, las cuales presentan asimismo resistencias frente a este

antibiótico (Souli et al. 2006, Antimicrobial agents and chemotherapy, 50:3166

3169).

Debido a esta capacidad de adquirir resistencias por parte de A. baumannii, y de adaptarse a los nuevos antibióticos, se han desarrollado nuevas estrategias para tratar estas enfermedades. Una de ellas es el desarrollo de nuevas moléculas que presentan actividad antimicrobiana. Aunque, debido a la capacidad de A. baumannií de adquirir rápidamente resistencia a antibióticos, dicha estrategia podria tener un carácter temporal, haciendo necesario llevar a cabo un abordaje diferente al cabo de un tiempo.

Existe, por tanto, la necesidad de buscar nuevas formas de impedir o tratar las infecciones causadas por A. baumannií, debido a la gran cantidad de enfermedades que produce y a la alta tasa de morbilidad de las mismas, ya que los tratamientos actuales presentan paulatinamente una pérdida de su eficacia.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a una composición que comprende células inactivadas del género Acinetobacter y/o proteinas aisladas de las mismas y al uso de esta composición como medicamento para la prevención de enfermedades provocadas por organismos de este género.

Los autores de la presente invención demuestran que células inactivadas de Acínetobacter baumanníí, al ser inoculadas en diversos individuos, provocan la inmunización de éstos, los cuales se encuentran así protegidos frente a posteriores infecciones causadas por dicha bacteria, lo que demuestra la utilidad del uso de estas células como vacunas profilácticas frente a infecciones provocadas por A. baumannii.

Por todo esto, un aspecto de la invención se refiere a células inactivadas del género Acinetobacter, de ahora en adelante "células de la invención" o "células

¡nactivadas de la invención". Dentro de este género, la especie que presenta

una mayor capacidad patogénica es la especie Acinetobacter baumannii. Por

ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención las células ¡nactivadas del género Acinetobacter son de la especie Acinetobacter baumannií.

Se entiende por "células del género Acinetobactet" en la presente invención

aquellas células de organismos pertenecientes al superreino Bacteria, filo

Proteobacteria, clase Gammaproteobacteria, orden Pseudomonadales, familia

Moraxelfaceae, y género Acinetobacter.

En la presente invención se entiende por "células de la especie Acinetobacter

baumannil' aquellas células de organismos pertenecientes al superreino Bacteria, filo Proteobacteria, e I a s e Gammaproteobacteria, orden Pseudomonadales, familia Moraxelfaceae, género Acinetobacter y especie

Acinelobacter baumannnii.

Se entiende por "célula inactivada" en la presente invención aquella célula que no presenta capacidad de replicación pero que conserva la capacidad

inmunogénica. Las células de la presente invención son ¡nactivadas previamente a su inoculación para evitar su replicación en el organismo

hospedador, y por lo tanto, para prevenir infecciones generadas a partir de su

aplicación. La inactivación de las células de la invención puede llevarse a cabo mediante diversos métodos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo, aunque sin limitarse, mediante adsorción, calor, luz ultravioleta, radiaciones ionizantes, ultrasonidos, fenal, formol , formaldehído, cristal violeta, gliceraldehído, oxido de etileno, propiolactona, etilenimina, bromoetilenimina o formalina. En una realización preferida las células de la invención se inactivan

mediante la adición de formalina. En otra realización preferida las células de la invención son de la especie Acinetobacter baumannii y se inactivan mediante la

adición de formalina.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición (de ahora

en adelante "composición de la invención") que comprende uno de los

elementos seleccionados de la lista que comprende:

a) células ¡nactivadas de la invención, b) proteínas aisladas de células ¡nactivadas de la invención,

o una combinación de (a) y de (b).

Se entiende por "proteínas aisladas de células ¡nactivadas de la invención" una

o un conjunto de proteínas que se pueden obtener de las células de la invención mediante métodos conocidos en el estado de la técnica. Las proteínas que presentan un mayor potencial para la generación de una

respuesta inmune son las proteínas de la membrana celular, ya que son éstas

las que pueden ser reconocidas por los anticuerpos generados en el huésped en caso de infección bacteriana por ser las proteínas expuestas en la superficie

de la bacteria. Por todo ello, en una realización preferida de este aspecto de la

invención las proteínas aisladas de (b) son proteínas de la membrana celular.

En otra realización preferida, estas proteínas de (b) se obtienen mediante un método que comprende:

i) disociar las proteínas de la membrana celular mediante la adición de un detergente a las células inactivadas de la invención, y

ii) precipitar las proteínas disociadas en el paso (i).

Este método presenta como ventaja frente a otros métodos de obtención de proteínas, que el detergente, además de disociar las membranas, forma micelas las cuales engloban las endotoxinas de Acinetobacter, y permiten su

eliminación. Esto permite que la mezcla proteica obtenida esté más libre de contaminantes. En los ejemplos de la presente invención se demuestra cómo

mediante este método se recuperan todas las proteínas presentes en las

células de Acinetobacter excepto una proteína de 36 KDa identificada como

proteína A de la membrana externa de Acinetobacter baumannii (AbOmpA; número de acceso en UniProtKB: Q6RYW5). Dicha protefna se encuentra unida de forma natural a las endotoxinas de A baumannií. Por ello, la eliminación de dicha proteína conlleva la eliminación de las endotoxinas de dicho organismo.

Por ello, una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende uno de los elementos seleccionados de la lista que comprende:

a) células ¡nactivadas de la invención,

b} proteínas aisladas de células ¡nactivadas de la invención,

o una combinación de (a) y de (b), donde las proteinas de (b) se obtienen mediante un método que comprende: i) disociar las proteínas de la membrana celular mediante la adición de

un detergente a las células ¡nactivadas de la invención, y ii) precipitar las protelnas disociadas en el paso (j).

Existen multitud de detergentes que pueden ser utilizados para disociar las proteínas de membrana. Entre estos se encuentran tanto los iónicos como los no iónicos y los anfóteros. como por ejemplo aunque sin limitarse, Triton X-100. Triton X-114, dodecilsulfato sódico (SOS), octilglucósido, ocliltioglucósido, mallósido, cetiltrimetilamonio (CTAB), sulfobatina 3-12, o 3-(cloroamido propil)dimetilamonio-1-propanosulfato (CHAPS), NP-40, el deoxycolato de sodio, DOC, Brij o Hecameg. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el detergente utilizado en el paso (i) es SOS o Tritón.

La precipitación de proteínas se puede llevar a cabo por múltiples métodos conocidos en el estado de la técnica como por ejemplo. aunque sin limitarse. por la adición de sulfato de amonio, ácido tricloroacético, etanol. acetona, ácido tricloroacético y acetona, o metanol y cloroformo. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la precipitación de las proteínas en el paso (ii) se realiza mediante la adición de cloroformo y metano!. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el detergente utilizado en el paso (i) es SOS o Tritón , y la precipitación de las proteínas en el paso (ii) se realiza mediante la adición de cloroformo y metan%~~

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende además otro principio activo. En una realización más preferida de este aspecto de la invención la composición de la invención comprende además un adyuvante.

En esta memoria, el término "adyuvante" se refiere a un agente, que no posea un efecto antigénico por sí mismo, que puede estimular el sistema inmune incrementando su respuesta a la vacuna. Existen multitud de adyuvantes como por ejemplo, aunque sin limitarse, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, agonistas de los receptores tipo toll, citoquinas, escualeno, adyuvante incompleto de Freund o adyuvante completo de Freund. En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención, el adyuvante se selecciona de la lista que comprende: fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, agonistas de los receptores tipo toll, citoquinas, escualeno, adyuvante incompleto de Freund

o adyuvante completo de Freund. En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención, el adyuvante es fosfato de aluminio.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a la composición de la invención para su uso como medicamento. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades producidas por organismos del género Acinefobacfer, o alternativamente, a la composición de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades producidas por organismos del género Acinetobacfer. En una realización preferida de este aspecto de la invención los organismos del género Acinefobacfer son de la especie Acinetobacter baumannii.

Se entiende por "enfermedad producida por organismos del género Acinetobactef' aquellas enfermedades en las que el agente causal de la patología es del género Acinetobacter, o alguno de sus productos de metabolismo. El género Acinetobacter produce diversas de patologías, como

por ejemplo aunque sin limitarse, bacteriemia, meningitis, infección del tracto urinario, infecciones de la piel y tejidos blandos, infección del lecho quirúrgico o neumonía. Por todo ello, en una realización más preferida, la enfermedad

producida por organismos del género Acinetobacter se selecciona de la lista

que comprende: bacteriemia, meningitis, infección del tracto urinario,

infecciones de la piel y tejidos blandos, infección del lecho quirúrgico o

neumonía.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia

a cualquier sustancia usada para prevención, alivio, tratamiento o curación de

enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente

invención se refiere a una composición que comprende la composición de la invención. Esta composición de la invención comprende células ¡nactivadas del

género Acinetobacter y/o proteínas de las mismas en una cantidad

terapéuticamente efectiva, que es capaz de inducir una respuesta inmune en el organismo al que le son administradas frente a un organismo del género Acinetobacter. El término "medicamento" incluye, por tanto, lo que se conoce como vacuna.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de células inactivadas de la invención, o de proteínas de las mismas, que produzca el efecto deseado. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composición de la invención son los vehículos conocidos por los

técnicos en la materia.

Se entiende por "infección" en la presente invención aquella patología generada por la invasión o colonización de cualquier tejido de un hospedador

por parte de algún organismo del género Acinetobacter, preferiblemente A.

baumannii.

Se entiende por "tejido blando" en la presente invención, todo aquel tejido no

óseo presente en un organismo.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención el medicamento es una vacuna. En el contexto de la presente invención el término "vacuna" se refiere a una preparación antigénica empleada para provocar una respuesta del sistema inmune a una enfermedad. Son preparados de antígenos que, una vez dentro del organismo, provocan la respuesta del sistema inmunitario mediante la producción de anticuerpos, y generan memoria inmunológica produciendo

inmunidad permanente o transitoria.

Los medicamentos y composiciones de la invención pueden utilizarse tanto solos como en combinación con otros medicamentos o composiciones para el tratamiento o prevención de enfermedades producidas por organismos del

género Acinetobacter.

Tanto los medi camentos como las composiciones de la invención pueden incluir, además, vehículos o excipientes farmacéutica mente aceptables.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición o de los medicamentos de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo

hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de

mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones,

azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección del medicamento, como por ejemplo, para aislarlo del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio dibásico, la

función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de

presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente.

El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de daños cuya causa sean células del género Acinetobacter, o cualquier derivado o producto metabólico de las mismas.

El término "antígeno" en esta memoria se refiere a una molécula (generalmente una proteína o un polisacárido), que puede inducir la formación de anticuerpos. Hay muchos tipos de moléculas diferentes que pueden actuar como antígenos, como las proteínas o péptidos , los polisacáridos y, más raramente , otras moléculas como los ácidos nucleicos.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus

variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y

en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Muestra los niveles de anticuerpos frente a las proteínas de la membrana externa de A. baumannií en el suero de ratones a cero, dos y cuatro semanas en los ratones vacunados (Vacunado, n = 10), o en los controles que recibieron sólo adyuvante (Control, n ~ 10). Los niveles de anticuerpos en los ratones vacunados fueron significativamente más altos que en los ratones sin vacunar ('p ~ 0,001 , test U de Mann-Whitney).

Figura 2. Muestra los niveles de anticuerpos frente a las proteínas de la

membrana externa de varias cepas de A. baumannii en el suero de

ratones después de dos inyecciones de la vacuna (Vacunado, n ~ 10), o dos inyecciones de sólo adyuvante (Control, n ~ 10). Los niveles de anticuerpos en los ratones vacunados fueron significativamente más altos que en los ratones sin vacunar ('p ~ 0,001 , test de Student).

Figura 3. Muestra los recuentos bacterianos en los bazos 12 horas

después de la inoculación en los ratones inmunizados (Vacunado; n~8) y los ratones controles (Control; n~8) con 1,6 x 10· ufc de la cepa ATCC 19606. 'p < 0,001 ; test U de Mann-Whitney.

Figura 4. Muestra la supervivencia de los ratones vacunados (Vacunados; n ~ 8/grupo) y los ratones sin vacunar (Control; n ~ 8/grupo) después de la inoculación con: A. A. baumanniiATCC 19606 (1,6 x 10· ufc); B. Ab-154 (3,6 x 10· ufc); y C_ 113-16 (4,1 x 10· ufc). 'p < 0,001 ; prueba log-rank.

Figura 5. Representa las muestras de preparaciones de proteínas de la

membrana externa antes y después de la extracción de la endotoxina

teñidas con tinción de azul de coomassie. A. carril 1: sin extracción; carril 2: extracción con 2% Triton X-100; carril 3: extracción con 2%Triton X-114. B. carril 1: sin extracción; carril 2: extracción con 2% SDS; carril 3: extracción con

5% SDS. Las flechas indican la proteina AbOmpA que fue extraida durante la eliminación de la endotoxina.

Figura 6. Muestra los niveles de IgG en grupos de ratones (n = 10/grupo) tras la inmunización con la preparación indicada. Los datos muestran los títulos para cada uno de los ratones y la mediana se representa con una línea. La línea horizontal discontinua representa el límite de detección de la ELlSA.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1. PREPARACiÓN DE LA VACUNA

Para preparar las células inactivadas la cepa A. baumannii ATCC 19606 fue crecida en 250 mi de caldo de Meuller-Hinton hasta obtener una densidad óptica de 1,2 a 600 nm. Las bacterias fueron lavadas 2 veces con 100 mi del tampón de fosfato por centrifugación a 6.000 x g a 4'C durante 10 minutos. Las bacterias fueron resuspendidas en 10 mi del tampón de fosfato y se añadió formalina a una concentración final de 0,05 M. Las células fueron incubadas con la formalina durante 16 horas a temperatura ambiente para su inactivación. Para confirmar que las células fueron inactivadas, 10 1-11 de la suspensión de células inactivadas fueron sembrados en una placa de agar sangre, comprobando que no hubo crecimiento. Las células inactivadas fueron lavadas 3 veces con 100 mi del tampón del fosfato por centrifugación a 6.000 x g a 4' C durante 10 minutos. La concentración de las células inactivadas fue ajustada a 1 x 10' células/mi por espectrofotometria y por último fueron mezcladas con el adyuvante de fosfato del aluminio a una proporción 1:1 (v/v).

EJEMPLO 2. INMUNIZACiÓN CON CÉLULAS INACTIVADAS

Para caracterizar la respuesta inmune a la inyección de células ¡nactivadas, 8 ratones C57BU6 fueron inyectados intramuscularmente en ambas patas con

100 ~I de la mezcla de la vacuna (1 x 108 células inactivadas+adyuvante) y se

administró una segunda inyección tres semanas después. Como control

negativo, en paralelo 8 ratones fueron inyectados con PBS más adyuvante (sin

bacterias). Dos semanas después de la primera inyección y una semana después de la segunda inyección, se recogieron muestras de sangre de cada

ratón que fueron utilizadas para determinar la cantidad de anticuerpos (lgG) frente a las proteínas de la membrana externa de A. baumannii por la técnica de ELlSA. A las dos y cuatro semanas en todos los ratones inmunizados se detectaron niveles altos frente a las proteínas de la membrana externa,

mientras que en los ratones controles inyectados con sólo el PBS+adyuvante

no se detectaron anticuerpos (Figura 1). Para determinar si la inmunización con las células ¡nactivadas produce anticuerpos capaces de reconocer antígenos

de varias cepas de A. baumannii, las muestras de suero recogidas a las cuatro se manas fueron analizadas por ELlSA utilizando proteínas de cuatro cepas

clínicas. Como muestra la figura 2, la inmunización con células inactivadas produce anticuerpos capaces de reconocer antígenos de varias cepas.

Una semana después de la segunda inyección de la vacuna, los ratones fueron

inoculados con 1,6 x 106 bacterias de la cepa ATCC 19606 de A. baumanniipor

inyección intraperitoneal. Doce horas después de la inoculación, se extrajeron

los bazos de los ratones y se determinó la cantidad de bacteria en el tejido. En

los bazos de los ratones inmunizados con las células inactivadas (Vacunado;

Figura 3) se detectaron aproximadamente 410g menos de bacteria que en los bazos de los ratones que recibieron sólo el adyuvante (Control; Figura 3).

Para determinar si la vacuna es capaz de proporcionar protección frente a la infección por A. baumannii, los ratones vacunados y los ratones control fueron inoculados por inyección intraperitoneal con las dosis indicadas de las cepas

ATCC 19606, Ab-154 Y 113-16. La supervivencia de los ratones fue

monitorizada durante los 7 días siguientes. En todos los casos, los ratones inmunizados mostraron una tasa mayor de supervivencia comparada con los

ratones sin inmunizar; ATCC 19606 (100% vs 12,5%); Ab-154 (100% vs 0%); 113-16 (87 ,5% vs 0%). La diferencia en supervivencia fue significativa estadisticamente para cada cepa (p < 0,001 , prueba log-rank) (Figura 4).

EJEMPLO 3. PURIFICACiÓN DE LAS PROTEíNAS DE LAS MEMBRANAS EXTERNAS DE A. BAUMANNII

Las proteinas de la membrana externa de la cepa A. baumannii ATCC 19606

fueron aisladas con el método descrito a continuación. La bacteria fue crecida

en un litro de caldo de Meuller-Hinton hasta llegar a una densidad óptica de 0,8 a 600nm. Las células bacterianas fueron centrifugadas a 5.000 x g durante 10 minutos y el pellet bacteriano fue resuspendido en 10 mililitros de tampón fosfato 1 OmM a pH 7,2. Las células bacterianas fueron lisadas por sonicación, y las células no lisadas fueron eliminadas por centrifugación a 5.000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante fue centrifugado a 18.000 x g durante 60 minutos a

4 !le para precipitar las membranas bacterianas. Las membranas internas fueron solubilizadas con una solución de 2% N-Iaurylsarcosinata en tampón

fosfato 1 OmM a pH 7,2. Tras la so lubilización, las membranas externas insolubles fueron precipitadas por centrifugación a 18.000 x g durante 60

minutos a 4 !i!e. Finalmente, las membranas externas purificadas fueron

lavadas con 2 mililitros de Tri s-CI 62,5 mM, pH 6,8 Y centrifugadas a 18.000 x g

durante 60 minutos a 4 !i!e.

EJEMPLO 4. ELIMINACiÓN V CUANTIFACIÓN DE ENDOTOXINAS

Para eliminar las endotoxinas de las proteínas de la membrana externa se desarrolló un método consistente en dos pasos. En el primer paso las endotoxinas se disocian de las proteínas de la membrana externa con detergentes iónicos o no-iónicos. En el segundo paso, las endotoxinas disociadas y el detergente son eliminados por precipitación de las proteínas con metanol y cloroformo. Las membranas externas de A. baumannii fueron

resuspendidas en 1 mililitro de Triton X·100 al 2%. Triton X-114 al 2%. SOS al 2%, o SOS al 5% a 4 oC y agitadas durante 5 minutos para disociar las

endotoxinas. Las proteínas fueron precipitadas por la adición secuencial de 4

mililitros de metan01, 2 mililitros de cloroformo y tres mililitros de agua destilada. Tras mezclar, la solución fue centrifugada a 10.000 x g durante 10 minutos a 4

!i!e. Las proteínas precipitadas fueron resuspendidas de nuevo en la solución de detergente y el proceso fue repetido 2 veces. Tras las tres extracciones, las

proteínas fueron resuspendidas en un tampón de solubilización (Tris 50 mM,

pH 7,4, urea 8 M, tiourea 2 M) para determinar la concentración de proteínas, o

fueron resuspendidas en el tampón fosfato para determinar los niveles de endotoxina. La concentración de proteina fue determinada utilizando el Kit 2D Quant (GE Healthcare) y los niveles de endotoxina fueron determinados con el kit Limulus Amebocyte Lysate QCL-1 000 Assay (Lanza). Los experimentos fueron realizados por triplicado.

El proceso completo de eliminación de endotoxinas puede ser realizado en menos de una hora utilizando reactivos comunes , baratos y disponibles comercialmente. Antes de la extracción, las proteínas de la membrana externa

mostraron niveles altos de endotoxinas (>2000 unidades de endotoxinaJllg

proteína ; Tabla 1). Tras la extracción con los detergentes utilizados se

redujeron los niveles de endotoxina más del 96%. Sin embargo, con la extracción utilizando una solución de 5% SOS se eliminó hasta el 99,4% de

endotoxina y se recuperó mayor cantidad de proteína.

Tabla 1. Comparación de los detergentes en la eliminación de endotoxinas.

Muestra

Recuperación de proteínas ('lo) Unidades de endotoxlna (media ± D.E.) Reducción en endotoxina ('lo)

Detergentes Triton Sin extracción 2% Triton X-lOO 2% Triton X-114

--54,9 55,9 2070 ± 96 74,4 ± 3,9 63 .0±2,1 --96,4 97.0

SOS Sin extracción 2% SOS 5% SOS

--74,3 90,2 2730 ± 16 56.7 ± 4,8 15,6 ± 5,4 -97,9 99,4

EJEMPLO 5. CARACTERIZACiÓN DEL EFECTO DE LA ELIMINACiÓN DE

5 LA ENDOTOXINA EN LA COMPOSICiÓN DE PREPARACIONES DE PROTEíNAS DE LA MEMBRANA EXTERNA POR SDS-PAGE y MALDITOFITOF

Cuatro 1J9 de proteínas de la membrana externa de A. baumannií sin extracción

10 de endotoxina y 4 )Jg de una muestra sin endotoxinas fueron separadas por SDS-PAGE y visualizadas con la linción de Coomassie (Simply Blue SafeSlain; Invitrogen). Aquellas proteínas menos abundantes tras la extracción de endoloxina fueron exlraidas del gel e identificadas por MALDI-TOFITOF MS. Tras el proceso de extracción de la endotoxina con todos los detergentes se

15 recuperó la mayoría de las proteínas, excepto una proteína de 36 kDa que fue casi completamente eliminada en el proceso (Figura 5). La proteína fue identificada como proteína A de la membrana externa de Acinetobacter baumannii (AbOmpA; número de acceso en UniProIKB: Q6RYW5).

EJEMPLO 6. INMUNIZACiÓN Y ELISAs

Preparaciones de las proteínas de la membrana externa sin extracción de la endotoxina y preparaciones sin endoloxinas fueron diluidas a una 5 concentración de 125 J..lg/ml en el tampón fosfato y subsecuentemenle diluidas

1:1 en al adyuvante, Adjuphos (Brenntag Biosector). Ratones C57BL/6 hembra de entre 8-10 semanas de edad fueron inmunizados inlramuscularmente con las preparaciones (n = 10/grupo) inyectando 100 J..l1 en cada cuadriceps (dosis = 25 J..lg proteína/ratón). Tres semanas tras la primera inyección, los ratones

10 fueron inmunizados una segunda vez con la misma dosis. Como control, un grupo de ratones recibió dos inyecciones con tampón fosfato. Una semana después de la segunda inyección, se recogieron muestras de suero que fueron almacenadas a -80 oC hasta su posterior análisis.

15 Para realizar los ELlSAs, fueron utilizadas placas de 96 pocillos, con 0,3 ~g de las proteínas de la membrana externa fijadas al fondo de cada pocillo. Los pocillos fueron lavados dos veces con una solución de PBS+ 0,1% Tween-20 (PBST) y bloqueados durante 30 minutos con una solución de PBST + 5% de leche desnatada en polvo (PBSTM). Tras dos lavados con PBST, diluciones

20 seriadas de los sueros de los ratones en PBSTM fueron añadidas a los pocillos e incubadas durante 60 minutos. Las placas fueron lavadas dos veces con PBST y posteriormente fueron añadidos a cada pocillo 1 00 ~I de IgG conjugado a peroxidasa de rábano (diluido 1:10.000 en PBSTM). Tras una incubación de una hora , las placas fueron lavadas tres veces con PBST y fueron añadidos a

25 cada pocillo 100 ~I de substrato (Sigma) y se incubó durante 15 minutos. La reacción fue parada con la adición de 50 1-11 de 0,5 M H2S04 y la absorbancia de cada pocillo fue medida a una longitud de onda de 450 nm. El titulo de la muestra fue definido como la dilución más alta en la que la absorbancia fue superior al resultado de los pocillos sin suero más 0,1 .

30 Los ELlSAs realizados con muestras de suero de los grupos de ratones mostraron que ambas preparaciones {membrana externa sin extracción de

,.

endotoxina y preparaciones sin endotoxinas) produjeron niveles de anticuerpos

altos tras dos inyecciones (Figura 6). La comparación de los niveles entre los dos grupos no mostró diferencia significativa (p ~ 0,525, test de U de MannWhitney).

EJEMPLO 7. ANÁLISIS ESTADíSTICO

Los niveles de anticuerpos obtenidos en ambos grupos de ratones fueron comparados con el test de U de Mann-Whitney utilizando el programa SPSS

10 versión 15.0 (SPSS Inc.). Un valor p de < 0,05 fue considerado significativo.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Composición que comprende uno de los elementos seleccionados de la

   lista:

   a.

   células inactivadas del género Acinetobacter,

   b.

   proteínas aisladas de células inactivadas del género Acinetobacter,

   o una combinación de (a) y (b).
2. 2. Composición según la reivindicación 1 donde las proteínas aisladas de

   (b) son proteínas de la membrana celular.
3. 3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2 donde las

   proteínas de (b) se obtienen mediante un método que comprende: i) disociar las proteínas de la membrana celular mediante la adición de

   un detergente a las células inactivadas del género Acinetobacter, y

   ii) precipitar las proteínas disociadas en el paso (i).
4. 4. Composición según la reivindicación 3 donde el detergente del paso (i) es SDS o Tritón .
5. 5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 Ó 4 donde la

   precipitación de las proteínas en el paso (ii) se realiza mediante la adición de cloroformo y metanol.

6. 6.

   Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que además comprende un adyuvante.

7. 7.

   Composición según la reivindicación 6 donde el adyuvante se selecciona de la lista que comprende: fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, agonistas de los receptores tipo tOIl, citoquinas, escualeno, adyuvante incompleto de Freund o adyuvante completo de Freund.

8. 8.

   Composición según la reivindicación 7 donde el adyuvante es fosfato de

   aluminio.
9. 9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde las

   5 células inactivadas del género Acinetobacler son de la especie Acinetobacter baumannii.
10. 10. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9

    para la elaboración de un medicamento.
11. 11 . Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la elaboración de un medicamento para la prevención de

    enfermedades producidas por organismos del género Acinetobacter.

    15 12. Uso de una composición según la reivindicación 11 donde el organismo del género Acinetobacler pertenece a la especie Acinefobacfer baumannii.
12. 13. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 donde la enfermedad se selecciona de la lista que comprende:

    20 bacteriemia, meningitis, infección del tracto urinario, infecciones de la piel y tejidos blandos , infección del lecho quirúrgico o neumonía.
13. 14. Uso de una composición según cualquiera de las rei vindicaciones 10 a

    13 donde el medicamento es una vacuna.