CN104523740A

CN104523740A - 一种石上柏多糖提取物制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104523740A
Application number: CN201410725862.0A
Authority: CN
Inventors: 姚宏; 林新华; 王盼盼; 范思思; 陈雨巍; 王鑫; 赖璐璐
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2014-12-04
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-04
Also published as: CN104523740B

Abstract

本发明涉及一种石上柏多糖提取物制备方法及其应用。所述石上柏多糖提取物经脱脂、提取、醇沉、除蛋白、除单糖和寡糖、凝胶柱纯化等步骤实现。该多糖提取物中多糖含量在90%以上。该多糖提取物具有显著的抗氧化活性，可以在制备体外抗肿瘤的药物或药物组合物中应用。

Description

一种石上柏多糖提取物制备方法及其应用

技术领域

本发明属于药理学领域，具体涉及一种石上柏多糖提取物制备方法及其应用。

背景技术

石上柏( Selaginella doederleinii Hieron)是常用中药材，为蕨类植物门（Pteridophyta）卷柏科（Selaginellaceae）卷柏属（Selaginella）植物的干燥全草。其又名深绿卷柏、大叶菜、水柏枝等，主产于云南、贵州、广西、浙江、福建、台湾等地，其性味甘、微苦、涩、凉。在传统中药中，共有六个卷柏属植物有收入典籍，其中石上柏是常用于治疗肿瘤的药材之一。传统中医认为石上柏具有“扶正祛邪”的双重作用，以复方或单方用于肿瘤的治疗历史悠久。到近代，石上柏的单方制剂中成药石上柏片（石上柏醇提物为主要成分）已经用于咽喉癌、绒毛膜上皮癌、肺癌及消化道癌症的治疗，具有较好的抗癌作用。

现代化学药理研究表明，石上柏主要含有多糖类，黄酮类，生物碱类等活性物质，其中多糖类成分具有较好的体外抑制肿瘤，增强或恢复免疫功能等作用。目前石上柏多糖的研究少见文献及专利报道。而且，市面上也未见关于石上柏多糖的药物或药物组合物的出现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石上柏多糖提取物制备方法及其应用，本发明的再一目的是提供一种含有以上石上柏多糖提取物的药物。还提供了含有该石上柏多糖提取物的制剂及该提取物的用途。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的石上柏多糖提取物中主要含有多糖。其中，以重量百分比计，多糖的含量为90%以上，优选的，多糖的含量为95%-98%。

本发明所述石上柏多糖的制备方法，包括以下步骤：（1）脱脂：取石上柏干燥全草，用4-10倍量有机溶剂浸泡后回流1-3次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；（2）提取：上述药渣加水浸泡后，水浴提取1-3次，每次1-3小时，过滤，浓缩滤液至每ml相当于含生药0.5-2.0g；（3）醇沉：向上述浓缩液中加入3-8倍体积乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品Ⅰ；（4）除蛋白：将上述多糖提取物粗品Ⅰ溶于水中配制成0.01-0.1g/ml的粗品Ⅰ溶液，加入1－4倍体积氯仿－正丁醇（V/V= 4:1）混合溶液，搅拌后分层，上层重复操作4-8次后，加入3-8倍体积乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品Ⅱ；（5）除单糖及寡糖：将上述多糖提取物粗品Ⅱ溶于水中配制成0.01-0.1g/ml的粗品Ⅱ溶液，用截止分子量：8000-14000的透析膜透析2天后，取出透析袋内液体加入3-8倍体积乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品Ⅲ；（6）凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品Ⅲ用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入3-8倍体积乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得黄棕色石上柏多糖提取物。

所述步骤（1）中的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、乙醇或95％乙醇水溶液中的一种。

所述步骤（2）中加水量为4-10倍量；提取温度为20-90℃。

所述步骤（3）-（6）中，加入乙醇后乙醇含量为50%-80%。

所述步骤（4）-（6）中，冰浴放置12-36小时。

本发明所述石上柏多糖提取物可以作为活性成分，加入药剂学上可以接受的辅料，按照药剂学上记载的制剂的制备方法制成制剂。

本发明所述石上柏多糖提取物还可以作为活性成分之一，加入药剂学上接受的辅料，按照药剂学上记载的制剂的制备方法制成制剂。

本发明的石上柏多糖提取物及其制剂可在制备治疗和预防癌症药物中应用。

本发明的优点在于：石上柏为民间抗癌草药，广泛分布于我国南方地区，资源丰富。石上柏多糖的研究少见文献及专利报道。本发明首次提供一种石上柏多糖提取物制备方法及其制剂制备方法，可为医疗领域新增一种廉价、药效显著的新型多糖类抗肿瘤药物。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例一石上柏多糖提取物的制备

（1）脱脂：取干燥的石上柏全草，用8倍量乙醇浸泡后回流2次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；（2）提取：上述药渣加水10倍量浸泡后，水浴提取3次，每次1小时，过滤，浓缩滤液至每ml相当于含生药1.0g；（3）醇沉：向上述浓缩液中加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置12小时，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品Ⅰ；（4）除蛋白：将上述多糖提取物粗品Ⅰ溶于水中配制成0.05 g/ml的粗品Ⅰ溶液，加入1倍体积氯仿－正丁醇（V/V= 4:1）混合溶液，搅拌后分层，搅拌后分层，上层重复操作4次后，冰浴放置12小时，过滤，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品Ⅱ；（5）除单糖及寡糖：将上述多糖提取物粗品II溶于水中配制成0.05 g/ml的粗品II溶液，用透析膜（截止分子量：8000-14000）透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇至乙醇含量为70%，冰浴放置12小时，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品Ⅲ；（6）凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品Ⅲ用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至乙醇含量为70%，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得白色石上柏多糖提取物。苯酚硫酸法测定多糖得含量为91％，bradford法测定蛋白分别为1.0%。

实施例二石上柏多糖提取物的制备

（1）脱脂：取干燥的石上柏全草，用10倍量80%乙醇浸泡后回流2次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；（2）提取：上述药渣加水8倍量浸泡后，水浴提取2次，每次1小时，过滤，浓缩滤液至每ml相当于含生药1.5g；（3）醇沉：向上述浓缩液中加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品Ⅰ；（4）除蛋白：将上述多糖提取物粗品Ⅰ溶于水中配制成0.1g/ml的粗品Ⅰ溶液，加入3倍体积氯仿－正丁醇（V/V= 4:1）混合溶液，搅拌后分层，上层重复操作8次后，加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，过滤，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品Ⅱ；（5）除单糖及寡糖：取上述多糖提取物粗品Ⅱ适量溶于水中，用透析膜（截止分子量：8000-14000）透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品Ⅲ；（6）凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品Ⅲ用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，过滤，沉淀冷冻干燥，得棕色多糖SDP1、SDP2精品。苯酚硫酸法测定多糖得含量为93％，bradford法测定蛋白分别为1.0%。

实施例三石上柏多糖提取物的制备

（1）脱脂：称取石上柏药材4kg（干燥品，全草）,加80％乙醇8倍量浸泡3小时（W/V），85℃回流5h，2次。过滤，药渣平摊，挥干乙醇；（2）提取：上述药渣挥至无醇味，加4倍量蒸馏水（W/V），浸泡12h，50℃水浴提取2h，2次。四层纱布布氏漏斗抽滤，收集滤液，合并，于60℃旋转蒸发浓缩至3000ml；（3）醇沉：向上述浓缩液加约9000ml无水乙醇，用酒精比重计调节为80％乙醇含量，冰浴放置24h，出现絮状沉淀，用四层纱布布氏漏斗抽滤，沉淀冷冻干燥得多糖提取物粗品Ⅰ；（4）除蛋白：称取上述多糖提取物粗品Ⅰ5.0g，溶解于500ml蒸馏水中，加入CHCl₃100ml，正丁醇20ml，电动搅拌30分钟，分液漏斗静置10分钟，分离弃去下层液，上层液重复脱蛋白操作6次。之后，上层液加无水乙醇至80％，冰浴放置24小时，离心，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品Ⅱ；（5）除单糖及寡糖：取上述多糖提取物粗品Ⅱ适量溶于300ml蒸馏水中，用透析膜（截止分子量：8000～14000）透析，透析袋外用磁力搅拌子匀速搅拌，每2小时换水1次，透析2天。透析袋内液体取出加无水乙醇至80％，冰浴24小时，离心，得灰色沉淀，冷冻干燥得多糖提取物粗品Ⅲ；（6）凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品Ⅲ用Deae sepharose FF凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至80％，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得灰色多糖SDP1、SDP2精品。苯酚硫酸法测定多糖得含量为95％，bradford法测定蛋白分别为0.9%。

实施例四：

抗肿瘤生物活性筛选试验：

将对数生长的肿瘤细胞（人肝癌细胞HepG-2、人白血病HL60、宫颈癌细胞Hela、人鼻咽癌细胞CNE-2、人肺癌细胞A549用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含10%（体积百分含量）小牛血清的RPMI1640培养基悬浮细胞，制成细胞悬液，并分别将各肿瘤细胞稀释至1.0×10⁵个/ml，再将其接种至96孔培养板中，每孔200ul，各肿瘤细胞分别接种3个孔，于37℃，5%CO₂的培养箱内培养24h；然后倾去各孔培养液。

将实施例1制得的石上柏多糖溶解于DMSO中，然后用RPMI1640培养基进行稀释，得到石上柏多糖溶液，使其终浓度为1000μg/ml，使DMSO的浓度为10%（体积百分含量）。

同时设实验组、对照组和空白组进行实验：

实验组：将石上柏多糖溶液依次分别加入上述肿瘤细胞HepG-2、HL60、Hela、CNE-2、MCF-7的培养孔内，各自接种3个孔，每孔加入20μl；

对照组：向上述各肿瘤细胞的培养孔内加入含10%（体积百分含量）DMSO的RPMI1640培养基，各自接种3个孔，每孔加入20μl；

空白组：向不含肿瘤细胞的空培养孔内加入含10%（体积百分含量）DMSO的20μl RPMI1640培养基；

将以上各组的培养板同时置于37℃，5%CO₂的培养箱内培养2天。2天后向每孔加入50 μl新鲜配制的1 mg/ml四甲基偶氮唑蓝（MTT）溶液，并在37℃，5%CO₂的条件下继续培养4h；小心弃上清，每孔加入150ul DMSO，充分溶解MTT还原产物；在酶标仪上测定各孔在波长492nm处的光密度值（OD值），按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。抑制率（%）=1-（OD_实验-OD_空白）/（OD_对照-OD_空白）×100%。

实验设三次重复，结果取平均数。石上柏多糖对人不同肿瘤细胞HepG-2、HL60、Hela、CNE-2、A549的抑制作用的结果如表1所示。

表1 石上柏多糖对人不同肿瘤细胞的抑制作用

石上柏多糖对多种肿瘤细胞的抑制作用实验结果表明（表1），石上柏多糖在浓度为100 μg/ml时对人肝癌细胞HepG-2、人白血病HL60、宫颈癌细胞Hela、人鼻咽癌细胞CNE-2、人肺癌细胞A549-7均有一定程度的抑制作用，对人肺癌细胞A549-7可达87.3%。因此，石上柏多糖可以用于制备肝癌、白血病、宫颈癌、鼻咽癌、肺癌的药物。

实施例五石上柏多糖胶囊剂的制备

取石上柏多糖500g,60oC干燥，粉碎成细粉，装入胶囊，制成1000粒即得。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种石上柏多糖提取物，其特征在于，所述多糖提取物是以石上柏为原料提取的，其中多糖的含量达90%以上。

2.根据权利要求1所述的一种石上柏多糖提取物，其特征在于，所述多糖提取物，优选的，多糖的含量为95%-98%。

3.一种如权利要求1所述的石上柏多糖提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）脱脂：取石上柏干燥全草，用4-10倍量有机溶剂浸泡后回流1-3次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；（2）提取：上述药渣加水浸泡后，水浴提取1-3次，每次1-3小时，过滤，浓缩滤液至每ml相当于含生药0.5-2.0g；（3）醇沉：向上述浓缩液中加入3-8倍体积乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品Ⅰ；（4）除蛋白：将上述多糖提取物粗品Ⅰ溶于水中配制成0.01-0.1g/ml的粗品Ⅰ溶液，加入1－4倍体积氯仿－正丁醇混合溶液，氯仿－正丁醇体积比为4:1，搅拌后分层，上层重复操作4-8次后，加入3-8倍体积乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品Ⅱ；（5）除单糖及寡糖：将上述多糖提取物粗品Ⅱ溶于水中配制成0.01-0.1g/ml的粗品Ⅱ溶液，用截止分子量：8000-14000的透析膜透析2天后，取出透析袋内液体加入3-8倍体积乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品Ⅲ；（6）凝胶柱纯化：将上述多糖提取物粗品Ⅲ用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入3-8倍体积乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得黄棕色石上柏多糖提取物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、乙醇或95％乙醇水溶液中的一种。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中加水量为4-10倍量；提取温度为20-90℃。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤（3）-（6）中，加入乙醇后乙醇含量为50%-80%。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤（4）-（6）中，冰浴放置12-36小时。

8.一种如权利要求1所述石上柏多糖提取物在多糖提取物药物或药物组合物上的应用。

9.一种如权利要求1所述石上柏多糖提取物在制备治疗和预防癌症药物中应用。