CN104510761A - 具有抗肝损伤作用的救必应提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及救必应为冬青科植物铁冬青Ilex roundda Thunb.的干燥树皮或根皮，具体涉及具有抗肝损伤作用的救必应提取物及其应用。本发明在救必应传统功效的研究基础上，同时制备其活性提取物，和现有技术相比，提出了救必应取物可以显著降低CCl4/酒精致肝损伤模型小鼠血清中的ALT、AST活性及肝组织MDA含量，增强肝脏SOD活性，表明该活性提取物对化学性肝损伤和酒精性肝损伤具有明显的肝脏保护作用。

Description

具有抗肝损伤作用的救必应提取物及其应用
技术领域
本发明涉及药用植物铁冬青树皮(The bark of Ilex rotunda Thumb)——救必应，具体涉及具有抗肝损伤作用的救必应提取物及其应用。
背景技术
随着社会发展和工业化的加速，更多外界因素的干扰以及人类自身的生活习惯导致肝病的发病率逐渐升高。目前，肝损伤的动物模型主要分为急性肝损伤和慢性肝损伤，而CCl4是常用的诱导动物肝损伤的化学试剂。CCl4能导致动物小叶中心坏死，与人类的中毒性肝损伤十分接近。其作用途径主要是通过CCl4的代谢产物导致氧化应激作用从而刺激脂质过氧化作用，使肝脏受到损伤。
酒精性肝损伤是一类危害大但又不易察觉的疾病，临床表现主要包括酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精性肝硬化三类。若不及时治疗，任其发展，可发生很多并发症，严重者很可能导致死亡。近十年来，随着人民生活水平的提高和社交圈的扩大，全球酒的消费量猛增。同时，酒精性肝损伤的发生率也呈明显上升趋势。
对于肝损伤的治疗，应该选用毒副作用较小的天然植物保肝药，因为有些药物的毒副作用较大会造成对肝脏的2次损伤。救必应为冬青科植物铁冬青Ilex roundda Thunb.的干燥树皮或根皮,味苦性寒,具清热解毒、消肿止痛、祛风利湿、跌打损伤等功效,始载于《岭南采药录》,为我国南方地区民间常用草药。常生于低中海拔的温湿肥沃的疏林中、海边溪旁或丘陵地带。
救必应的现代药理学对其药理活性研究鲜有报道。到目前为止，未见以救必应为原料制备活性提取物的技术，也未见以救必应为主要组成组分应用防治肝损伤的药品或保健品的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种具有抗肝损伤作用的救必应提取物及其应用。
具有抗肝损伤作用的救必应提取物，其制备方法具有以下特征：具有抗肝损伤作用的救必应提取物，其制备方法具有以下特征：将救必应粉碎至细粉，乙醇提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；真空干燥，既得具有抗肝损伤作用的救必应提取物。
所述细粉为过80筛，所述乙醇提取为采用乙醇为溶剂超声辅助提取。
所述超声辅助提取为1/20的固液比，40KHz的工作频率，温度为40℃，时间30min。
本发明的又一个目的在于提供一种上述的方法制备得到的具有抗肝损伤作用的救必应提取物在制备抗肝损伤药物或抗肝损伤保健品中的应用。试验结果表明铜锤玉带草提取物能够有效降低肝损伤模型动物血清ALT、AST活性及肝组织MDA含量，增强肝脏SOD活性。
所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。
救必应提取物制成胶囊剂时把救必应提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
救必应制成片剂时，把救必应提取物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
救必应提取物制成颗粒剂时，把救必应提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
救必应提取物制成其他剂型时，可按药学常规方法制备得到，这里不一一赘述。
本发明的有益效果，本发明在救必应传统功效的研究基础上，同时制备其活性提取物，和现有技术相比，提出了救必应取物可以显著降低CCl4/酒精致肝损伤模型小鼠血清中的ALT、AST活性及肝组织MDA含量，增强肝脏SOD活性，表明该活性提取物对化学性肝损伤和酒精性肝损伤具有明显的肝脏保护作用。因此救必应提取物有望开发成为新一代安全有效，用于防治多种类型肝保护的药物或保健品。
具体实施方式
以下结合具体实施例对发明做出进一步说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围，在阅读本发明后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本发明所附权利要求限定的范围。
实施例1
具有抗肝损伤作用的救必应提取物，其通过以下方法制备得到：
将救必应粉碎至细粉，乙醇提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；真空干燥，既得具有抗肝损伤作用的救必应提取物。
实施例2
具有抗肝损伤作用的救必应提取物，其通过以下方法制备得到：
将救必应粉碎至过80目的细粉，20倍量65％乙醇溶剂超声辅助提取提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；真空干燥，既得具有抗肝损伤作用的救必应提取物；所述超声辅助提取为40KHz的工作频率，温度为40℃，时间30min。
实施例3
救必应活性提取物抗肝损伤实验研究
1.实验材料与仪器设备
1.1 实验材料及试剂
救必应提取物，第三章制备。ALT和AST试剂盒，南京建成生物工程有限公司
SOD和MDA试剂盒，南京建成生物工程有限公司；联苯双酯滴丸，浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号091103；CCl4和无水乙醇(化学级)，北京化工厂；
食用豆油，考马斯亮蓝，南京建成生物工程研究所；甘油三酯(TG)试剂盒，购于北京北华康泰临床试剂有限公司；组织固定液，北京化工厂。
1.2 仪器
HC-2517高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；组织匀浆机，江苏省金坛市恒丰仪器制造有限公司；
连续光谱扫描式酶标仪，美国Bio-Tek公司。
1.3 实验动物
雄性，ICR小鼠，购于吉林大学白求恩医学院动物实验中心，体重(22-25g)；正式实验前，适应性饲养1周。
2.实验方法
2.1 CCl4诱导急性肝损伤模型制备
80只小鼠适应性喂养1周，期间自由进食饮水。1周之后，按照体重随机分为9组，每组8只，分别为：Ⅰ组为正常对照组(空白组，CON)，Ⅱ组为肝损伤模型组(Model)，Ⅲ组为联苯双酯组(阳性对照组，150mg·kg-1，LBSZ)，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组分别为救必应高、中、低剂量治疗组，即救必应低剂量组50mg/Kg(IRE-L)，救必应中剂量组100mg/Kg(IRE-M)，救必应高剂量组200mg/Kg(IRE-H)。所有药物均用生理盐水溶解。空白对照组和模型组给予等量生理盐水，每天灌胃1次，连续给药7天。
于给药第6天晚上禁食不禁水12h，次日正常给药1h后，除空白对照组外，其余各组腹腔注射10％的CCl4豆油溶液，造成急性CCl4肝损伤。6h后眼球取血，血清于4200rpm离心10min，取上清液于4℃冰箱中保存。测定血清中ALT、AST活性。取血后，立即劲椎脱臼处死小鼠，解剖取肝脏和脾，称重后，用生理盐水清洗掉肝脏表面血迹，拭去表面生理盐水后，部分肝脏用10％的福尔马林浸泡固定，另一部分用锡纸包好后，立即放入-80℃冰箱中保存。
2.2 酒精诱导急性肝损伤模型制备
80只ICR雄性小鼠，适应性喂养1周，其间自由摄食。将小鼠按体重随机分成9组：Ⅰ组为正常对照组(空白组，CON)，Ⅱ组为酒精肝损伤模型组(Model)，Ⅲ组为联苯双酯组(阳性对照组，150mg·kg-1的联苯双酯LBSZ)，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组分别为救必应提取物高、中、低三个剂量组，即救必应低剂量组50mg/Kg(IRE-L)，救必应中剂量组100mg/Kg(IRE-M)，救必应高剂量组200mg/Kg(IRE-H)。所有药物均用生理盐水溶解。空白对照组和模型组给予等量生理盐水，每天灌胃1次，连续给药7天。灌胃给药，空白组和模型组给予等体积的生理盐水，每天灌胃1次，连续给药7天。
于给药第6天晚上9点禁食不禁水，末次给药1h后，除空白组外，其余各组按12ml·kg-1剂量灌胃50％乙醇造成急性酒精肝损伤。4h后，眼球取血，分离血清置4℃冰箱保存备用，测定血清中ALT、AST活性及TG浓度。劲椎脱臼处死小鼠，立即解剖取肝脏和脾，称重。取小鼠肝脏0.4g左右，按重量体积比1:9加生理盐水制成10％的肝匀浆，按试剂盒说明测定组织中MDA含量和SOD活性。
2.3 血清学及肝脏指标检测
离心完的血清分别按照ALT，AST试剂盒的说明书于96孔板中加样，酶标仪测定OD值，计算出小鼠血清中ALT，AST的活性。
6.3.3.1肝匀浆的制备 
称取一定重量的冻存肝脏，按照重量体积比1:9加冷生理盐水进行匀浆，于冷冻离心机中4200rpm离心10min，取上清液得10％的肝匀浆，制备肝匀浆均在低温条件下操作。取少量10％的肝匀浆，用冷生理盐水稀释成1％的肝匀浆。
6.3.3.2肝脏指标的检测
按照考马斯亮蓝试剂盒和SOD，MDA试剂盒的说明分别于96孔板中加样，酶标仪测定各自的OD值，分别计算出1％肝匀浆中肝蛋白浓度和肝脏中SOD的活性以及10％肝匀浆中MDA的浓度。
2.4 统计学处理 
所有数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05表示具有统计学差异。
3.实验结果
3.1 小鼠一般形态学/行为学观察 
腹腔注射CCl4后，约5min，大部分小鼠行动不成直线，四肢瘫软，10min后小鼠基本昏睡，提示CCl4急性肝损伤造模成功，可以用于药物筛选。
3.2 救必应提取物对血清中AST、ALT及TG的影响
3.2.1CCl4诱导的急性肝损伤
救必应提取物对CCl4诱导的肝损伤小鼠血清转氨酶活性的作用。注射完CCl4后，模型组小鼠血清中AST和ALT活性明显升高，与空白对照组相比有极显著差异(P＜0.01)，提示CCl4急性肝损伤模型成功。
与模型组相比，联苯双酯给药组可以显著降低ALT活性，对AST具有一定的降低作用，差异不显著(P﹥0.01)。救必应提取物高剂量和中剂量(IRE-M和IRE-H)均能降低模型血清中AST和ALT的活性，具有显著性差异(P＜0.01)，但救必应低剂量(IRE-L)对于AST和ALT活性具有一定降低作用，但差异不显著(P﹥0.01)。
3.2.2 酒精诱导的急性肝损伤
一次性大剂量给予酒精后，模型组小鼠血清中AST和ALT活性及TG浓度均显著升高，与正常对照组相比均有统计学差异，提示造模成功。与模型组(Model)相比，联苯双酯组(LBSZ)能显著降低血清中AST和ALT水平具有显著差异(P＜0.05)，对TG含量无影响。观察救必应给药组对二种酶和甘油三酯的影响发现，救必应三个剂量组(IRE-L，IRE-M，IRE-H)对ALT和AST均有一定的降低作用，且高剂量和中剂量组具有统计学意义(P＜0.05)。三个救必应给药组中，仅高剂量组(200mg/Kg)可以显著降低TG水平，明显改善酒精脂代谢紊乱，但低剂量和中剂量组对TG水平无影响。
3.3 救必应提取物对小鼠肝脏中SOD和MDA的影响
3.3.1 CCl4诱导的急性肝损伤
鉴于血清中转氨酶活性的测定结果，我们对救必应提取物对肝损伤小鼠肝脏中SOD活性和MDA的影 响加以探讨。注射CCl4后，模型组中肝脏SOD活性显著性降低(P＜0.05)，MDA含量急剧升高，与空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。与模型组相比，联苯双酯给药组可以显著升高SOD活性，降低MDA含量；救必应高、中、低剂量均能显著升高肝脏中SOD活性(P＜0.05)。但，仅救必应高剂量和中剂量可以显著降低小鼠肝脏组织中MDA水平(P＜0.05)。低剂量组对MDA水平无影响。
3.3.2 酒精诱导的急性肝损伤
模型组与正常对照组相比，SOD活性极显著降低(P＜0.01)，MDA浓度极显著升高(P＜0.01)，说明造模成功。各给药组与模型组相比，结果显示：联苯双酯组能显著升高酒精造成的肝损伤小鼠中SOD活性(P＜0.05)，降低MDA水平(P＜0.05)；救必应高剂量给药组显著升高了SOD活性(P＜0.01)，同时也显著性降低了肝脏中MDA水平(P＜0.05)；救必应中剂量对显著降低MDA水平(P＜0.05)，但对SOD无统计学意义；
4.结论
4.1 CCl4在体内代谢产生的中间产物会导致生物膜上的脂质过氧化，破坏细胞膜的磷脂，改变细胞的结构和功能，从而使肝细胞受损甚至坏死。而细胞膜结构的破坏会直接导致细胞内容物渗透到血液中，因此，本章检测了血清中转氨酶的水平。本章实验结果显示，对血清中转氨酶的作用，救必应高中剂量对AST具有降低作用，救必应提取物可以保护肝功能。
4.2 急性肝损伤模型中，CCl4代谢产生的自由基加重了小鼠体内氧化应激状态，导致肝损伤小鼠肝脏中SOD活性降低，MDA含量升高。救必应高中剂量组均能升高肝损伤小鼠肝脏中SOD的活性，降低MDA的水平，实验结果表明：救必应提取物具有不同程度的抗氧化应激作用。鉴于救必应提取物良好的保肝作用，有必要进行深入的作用机制研究。
4.3 酒精对肝脏的毒性作用的机理有很多，目前认为大量或高浓度的乙醇进入机体后，首先在肝脏微粒体中被代谢成乙醛，之后进一步被氧化成乙酸，使得NADH/NAD+比率增大。在此代谢过程中微粒体细胞色素P450被激活，产生大量活性氧簇。过多的活性氧簇使机体内氧化和抗氧化平衡被打破，导致氧化应激。同时，这些自由基与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，损伤肝细胞膜的结构和功能,使膜通透性升高，导致肝细胞内的转氨酶大量进入血液中，使血液中转氨酶的活性增加，其中以丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨基转移酶(AST)为主。甘油三酯是酒精肝损伤的一个特征指标，酒精在肝脏内代谢过程中，导致NADH/NAD+比率失调，使脂肪酸的氧化及甘油三酯的转运受到抑制，致使甘油三酯含量升高。
本实验结果显示，与模型组比较，救必应提取物均能降低血清中增加的ALT和AST活 性及TG浓度，结果说明，救必应提取物对细胞膜有一定的保护作用。
SOD是细胞内天然存在的氧自由基清除剂，可以平衡细胞内氧化和抗氧化作用，阻止氧化应激作用的发生，SOD活性的高低反映了机体清除自由基的能力。MDA是脂质过氧化反应的产物，MDA浓度的高低可以反映机体细胞膜受自由基破坏的程度。本实验结果显示，救必应给药组对SOD和MDA均有作用。
实施例8
所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。
实施例9
救必应提取物制成胶囊剂时把救必应提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
实施例10
救必应制成片剂时，把救必应提取物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
实施例11
救必应提取物制成颗粒剂时，把救必应提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
救必应提取物制成其他剂型时，可按药学常规方法制备得到，这里不一一赘述。

Claims (5)

1.具有抗肝损伤作用的救必应提取物，其制备方法具有以下特征：将救必应草粉碎至细粉，乙醇提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；真空干燥，既得具有抗肝损伤作用的救必应提取物。
2.如权利要求1所述的具有抗肝损伤作用的铜锤玉带草提取物，其特征在于：所述细粉为过80筛，所述乙醇提取为采用乙醇为溶剂超声辅助提取。
3.如权利要求1所述的具有抗肝损伤作用的铜锤玉带草提取物，其特征在于：所述超声辅助提取为1/20的固液比，40KHz的工作频率，温度为40℃，时间30min。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法制备得到的具有抗肝损伤作用的铜锤玉带草提取物在制备抗肝损伤药物或抗肝损伤保健品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。
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