CN104497167A - 透明质酸衍生物及其治疗药物 - Google Patents

Abstract

含有酚羟基的异喹啉类化合物通过体内可降解的分子桥，与透明质酸共价结合形成的透明质酸衍生物及其制备方法。该类透明质酸衍生物可用于制备非口服给药途径的药物,尤其是制备关节腔和眼后节局部给药途径治疗相关疾病的缓释药物，具有疗效好，毒副作用少的特点。

Description

透明质酸衍生物及其治疗药物

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种含有酚羟基的化合物通过体内可降解的分子桥，与透明质酸共价结合形成的透明质酸衍生物及其应用。

背景技术

近年来，国际上天然植物药的兴起和规模的不断壮大，其研究的深度和广度日益加强，众多的具有生物活性的单体化合物被分离纯化，并通过试验进一步证实了它们的药理作用。多种从植物提取的单体化合物被开发为口服或外用药物，一些单体化合物的纯度已达到注射级别，可用于肌肉、关节腔或静脉给药，如紫杉醇、青蒿素、青藤碱、天麻素、银杏内脂B、穿心莲内酯、阿魏酸、丹参酮ⅡA、没食子酸丙酯、川芎嗪等等。

青藤碱是异喹啉类的代表物质，具有显著的抗炎、镇痛、免疫抑制等作用，是我国沿用已久的抗风湿中药。其抗炎镇痛机制主要来自于对COX-2酶的选择抑制性，对白介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-a)等细胞因子也有抑制作用，作用于炎症发生的多个环节，包括抑制炎症细胞功能、抗自由基损伤、抑制炎症介质释放和对抗炎症介质的效应等〔①梁瑞燕，曹柳英，王文君，等。广州中医药大学学报，2007，24(2)：141～143；②崔元璐，姚康德，戚爱棣。中草药，2006，37(12)：1847～1851〕据报道，对各种类型的关节炎，青藤碱均能显著改进患者症状，治疗风湿性及类风湿性关节炎总有效率为85％以上，起效时间为2～3周，约1个月后明显好转[①粟戟，李蕴麟。甘肃医药，2012,31(5)：338～341②李乐，张彩玲，宋必卫。中药新药与临床药理，2007，17(4)：310～313；③蔡颖，邱赛红，孙必强。中医药导报，2006，12(12)：84～86]。有多项专利公开了青藤碱在治疗老年性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变以及葡萄膜炎等自身免疫性眼病的应用(CN1154843、CN1199623，CN1206588和CN100377707)。但由于青藤碱生物半衰期较短，临床治疗需长期口服，且用药剂量偏大，增加胃肠道的刺激。采用局部给药可使药物直接作用于病灶，减少用药剂量，避免不良反应的发生。但是，由于青藤碱分子量小，局部应用时极易流失，局部大剂量或多次给药可增加刺激作用和感染的机会。

透明质酸(hyalouronic acid，HA)是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，具有良好的润滑性、黏弹性和非免疫原性(Laurent TC等，Ann.Rheum.Dis.1995，54：429～432)。HA及其衍生物广泛用于眼科和骨科手术黏弹剂、关节腔注射治疗骨性关节炎和类风湿性关节炎、预防术后粘连，或作为药物媒介应用于多种药物制剂〔凌沛学和贺艳丽等，中国生化药物杂志,1998,19:200～204〕。在关节腔内HA起润滑、屏障及缓冲应力作用，在眼科手术中使用HA具有扩大手术视野、保护角膜内皮细胞及眼内组织、减少术后并发症、提高手术成功率等多种作用。基于HA本身所具有的特性，其无疑是关节腔和眼内给药系统最 理想的载体。

近年来，以合成或天然聚合物为载体通过共价结合治疗药物制备共价轭合物延长药物半衰期或降低其毒副作用的研究已引起国内外广泛关注。其中HA以其优良特性成为制备轭合物的首选载体：①HA具有良好的生物降解性、生物相容性、无毒、无抗原性，在体内可酶解消除；②HA分子中含有大量羧基、羟基和N-乙酰氨基，均可被化学修饰，尤其是羧基易与小分子药物结合，并保持较高载药率；③HA与药物共价结合能够延长药物半衰期、提高稳定性、降低免疫原性和提高药物溶解性；④HA与其特异性受体CD44的专一性结合使HA药物轭合物具备药物增稠、靶向治疗作用，同时也能达到缓释、控释目的。目前，HA及其衍生物已被广泛用于多种抗癌药物、多肽和蛋白类药物的载体，实验证实能够延长药物在用药部位的存留时间，提高生物利用度，减少给药次数，降低不良反应。

本发明将含酚羟基的异喹啉类化合物通过分子桥共价结合在HA分子上，其中分子桥选自可以具有取代基的碳数为2～12的的氨基酸和短肽。在本发明的实施例中，分子桥包括甘氨酸、天门冬氨酸以及苯丙氨酸、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、牛磺酸及其衍生物，更优选甘氨酸、天门冬氨酸、谷胱甘肽及其衍生物。

本发明将含酚羟基的异喹啉类化合物通过分子桥共价结合在HA分子上，在生理状态下，异喹啉类化合物能够从HA分子骨架解离释放，实现其抗炎、镇痛、免疫抑制等作用。本发明用于关节腔或眼后节给药，可获得缓慢释药的效果，减少给药次数和给药剂量，提高治疗效果。

本发明化合物及其相关用途未见文献及专利报道。

发明内容

本发明涉及一种透明质酸衍生物，具体涉及一种含有酚羟基的异喹啉类化合物通过体内可降解的分子桥，与透明质酸共价结合形成的透明质酸衍生物及其具体应用。

一种透明质酸衍生物，是含有酚羟基的异喹啉类化合物通过体内可降解的分子桥，与透明质酸共价结合。其中异喹啉类化合物选自异喹啉类生物碱及其衍生物，优选蝙蝠葛碱、白屈菜碱、青藤碱、莲心碱及其衍生物，更优选青藤碱及其衍生物。

本发明透明质酸衍生物，其中体内可降解的分子桥选自可以具有取代基的碳数为1～12的的氨基酸和短肽，优选甘氨酸、天门冬氨酸、苯丙氨酸、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、牛磺酸及其衍生物，更优选甘氨酸、天门冬氨酸、谷胱甘肽及其衍生物。

本发明透明质酸衍生物，其中透明质酸的重复2糖单元的摩尔数与导入含有酚羟基异喹啉类化合物的摩尔数比值为100:1～2:1。

本发明透明质酸衍生物，含有酚羟基的异喹啉类化合物通过体内可降解的分子桥与透明 质酸共价结合，其中导入了含有酚羟基的异喹啉类化合物的透明质酸二糖单元的部分结构，用(1)式表示：

HA-CO-NH-R₁-(CO-O-R₂)_n               (1) 

其中HA-CO-表示透明质酸二糖单元残基，-NH-R₁-(CO-O-)_n表示含有n个羧基的氨基酸NH₂-R₁-(COOH)_n的分子桥残基，R₁表示可以具有取代基的碳数为1～12的直链或具有分枝的烃基，或表示由1～8个相同的或不同的氨基酸组成的肽链，-CO-NH-表示透明质酸二糖单元中糖醛酸的羧基与分子桥的氨基所形成的酰胺键，-CO-O-表示分子桥的羧基与含有酚羟基的异喹啉类化合物的酚羟基所形成的酯键，n表示1～3的整数；此外，该透明质酸衍生物中含有酚羟基的化合物的导入率为1～50摩尔％，该透明质酸衍生物的透明质酸残基中的羰基，以参与含有酚羟基的异喹啉类化合物－分子桥结合形成的酰胺键和未反应的游离羧基两种形式存在。其中未反应的游离羧基可以和金属离子成盐，优选钠盐、钾盐和钙盐。也可以和非金属离子成盐，优选季铵盐，例如四丁基铵盐。

含有酚羟基的异喹啉类化合物可用以下结构式表示：

其中X＝H、Br、F、NO₂、CH₂OH、CHO；Y＝O、NOH；Z＝H、CH₃、CN、Ac、COCH₂CH₃、CH₂CH(CH₃)₂、COPh、COCH₂Ph、CH₂CH(CH₃)Ph。优选青藤碱。

该类透明质酸衍生物用于制备非口服给药途径的药物，优选用于制备注射给药途径和植入给药途径的药物，更优选用于制备关节腔和眼后节局部注射或植入给药途径的药物。

该类化合物具有以下优势：透明质酸分子骨架在局部存留时间长，在生理状态下，异喹啉类化合物持续、缓慢从透明质酸分子骨架释放，药效持续时间长，短期内不需要重复给药；作为分子骨架的透明质酸对局部组织具有润滑、垫衬和保护作用，可以增强药物的治疗作用、减轻毒副作用。

附图说明

附图1实施例1HA-Gly-SN的¹H NMR图谱

附图2实施例1HA-Gly-SN(a)，HA(b),SIN(c)的FT-IR图谱

附图3实施例5SN和HA-Gly-SN体外释放曲线

具体实施例

实施例1：由透明质酸四丁基铵盐制备青藤碱-甘氨酸-透明质酸衍生物

(1)N-叔丁氧羰基甘氨酸(Boc-Gly)的制备：称取甘氨酸2.3g，以20ml甲醇溶解。称取二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)6.96g溶解于4.5ml甲醇，在冰浴下将Boc酸酐甲醇溶液滴加于甘氨酸溶液中，同时滴加4M的氢氧化钠溶液7ml，室温反应2～5h。TCL检测反应至完全。加入甲苯10ml和浓盐酸3ml，加入适量乙酸乙酯萃取，有机层加入适量饱和食盐水洗涤两次，旋转蒸发除去有机溶剂，得无色油状物，加入乙酸乙酯-甲苯重结晶，得白色针状固体4.48g，收率83.6％。

(2)甘氨酸-青藤碱的制备：称取青藤碱4.94g和Boc-Gly 2.89g，以400ml CH₂Cl₂溶解，冰浴。称取DCC 3.8g和DMAP 0.28g溶解于50ml CH₂Cl₂，滴加入上述溶液中，室温反应过夜。过滤，收集滤液，分别用适量1M盐酸、10％NaHCO₃和饱和食盐水洗涤滤液，收集有机层，用无水MgSO₄干燥2～8h，过滤，旋转蒸干溶剂，以CH₂Cl₂-甲醇重结晶获得白色固体。该白色固体用适量乙酸乙酯溶解，避光条件下，通入干燥HCL气体脱BOC,过滤，得白色固体4.81g，收率69.86％。

(3)透明质酸四丁基铵盐的制备

取四丁基氯化铵((C₄H₉)₄NCL，TABCL)15.5g(56mmol)溶解于250ml蒸馏水中，加至H⁺型阳离子交换树脂树脂中，搅拌得到(C₄H₉)₄N⁺阳离子交换树脂。取500g 1.6％HA(Mr＝30kDa)至(C₄H₉)₄N⁺阳离子交换树脂中，搅拌48h。加蒸馏水冲洗树脂，得约2000ml HA-TBA,旋转蒸发浓缩至100g左右，冷冻干燥48h，得蓬松固体4g。

(4)青藤碱-甘氨酸-透明质酸的制备

取HA-TBA 3g置500ml圆底烧瓶中，加150ml DMSO，磁子搅拌24h，完全溶解后，在搅拌条件下缓缓滴加HOBT溶液(450mg至20mlDMSO)和DCC溶液(687mg至30mlDMSO)。另取Gly-SN 1.5g溶于30mlDMSO中，加三乙胺6滴。缓缓滴加至上述混合溶液中，37℃，避光，磁子搅拌24h。抽滤，收集滤液。滤液经透析袋透析后，5倍乙醇沉淀，减压干燥得固体产物HA-Gly-SN 3.5g。产物透明质酸的2糖单元的摩尔数与青藤碱的摩尔数比值为4:1。产物HA-Gly-SN的¹H NMR图谱见图1，产物HA-Gly-SN(a)，HA(b),SIN(c)的FT-IR图谱见图2。

产物结构如下式所示。

实施例2：由透明质酸钠盐制备青藤碱-甘氨酸透明质酸衍生物

通过与实施例1中(1)、(2)相同的方法制备Gly-SN。将1.50gHA(30W)至80ml水中溶解完全，加中间体Gly-SN 0.85g，EDCI 0.85g，NHS 0.52g，搅拌溶解并保持pH 4.2-5之间，室温反应20h，将反应液至透析袋，0.9％NaCl透析过夜，5倍乙醇沉淀透析液，得白色粉末。产物透明质酸的2糖单元的摩尔数与青藤碱的摩尔数比值为10:1。

实施例3：由透明质酸四丁基铵盐制备青藤碱-天门冬氨酸-透明质酸衍生物

通过与实施例1的方法类似的方法，用天门冬氨酸代替甘氨酸，得到3.1g目标化合物粉末。产物透明质酸的2糖单元的摩尔数与青藤碱的摩尔数比值为6:1。

产物结构如下式所示。

实施例4透明质酸衍生物载药率的测定

(1)透明质酸衍生物中青藤碱的含量测定

取本发明实施例1制备的青藤碱-甘氨酸-透明质酸衍生物12mg溶于50ml水中作为供试液。另精密称定盐酸青藤碱适量，加水制成浓度为20μg/ml的对照品溶液。按中国药典2010年版二部附录ⅣA规定的方法，取对照品溶液和供试液在265nm波长处测定吸光度(A₁和A₂)，并按下式计算青藤碱(Csn)的含量。

Csn＝0.075A₂/A₁

(2)透明质酸衍生物中葡萄糖醛酸的含量测定

参照文献方法[凌沛学.透明质酸[M].北京:中国轻工业出版社,2007.P186.]测定透明质酸衍生物中葡萄糖醛酸含量(Cua/％)。

(3)透明质酸衍生物载药率(R)计算如下

$R(\%)=\frac{0.59*\mathrm{Csn}}{\mathrm{Cua}}*100\%$

实施例5透明质酸衍生物的体外药物释放试验

(1)样品制备

取本发明实施例1制备的青藤碱-甘氨酸-透明质酸衍生物1.0g溶于50ml含有30U透明质酸酶的生理盐水50ml中，作为供试样品；同时配制浓度为2.5mg/ml的盐酸青藤碱溶液，作为对照样品。将供试样品和对照样品置截断分子量2000Da的透析袋中，备用。

(2)青藤碱的含量测定

采用紫外-可见分光光度法测定青藤碱的含量，以生理盐水为空白对照，以盐酸青藤碱原料药为对照品，测定液用生理盐水稀释至含盐酸青藤碱约30ug/ml，参考中国药典2010年版二部附录ⅣA规定的方法，在265nm波长处测定吸光度并计算青藤碱的含量。

(3)体外释放曲线绘制

参考中国药典2010年版二部附录ⅣA规定的方法，将测定样品和对照样品置于网碟下方，以生理盐水为释放介质，温度37±5℃，转速50rpm，固定时间点取样测定释放液中青藤碱的含量，计算累积释放量，以时间为横坐标绘制体外释放曲线。见图3。

从图3可以看出，HA-SN具有延缓释放青藤碱的作用。对照样品盐酸青藤碱溶液160min时即释放约90％的药物，且基本达到释放平台，3h后累计释放量不再增加。HA-SN溶液药物释放速度明显低于对照样品，释放曲线平缓，10h释放药物达90％以上。表明HA-Gly-SN轭合物具有缓释特性。

Claims (10)

1.一种透明质酸衍生物，其特征是含有酚羟基的异喹啉类化合物通过体内可降解的分子桥，与透明质酸共价结合。

2.权利要求1所述透明质酸衍生物，其中与透明质酸共价结合的异喹啉类化合物选自异喹啉类生物碱及其衍生物，优选蝙蝠葛碱、白屈菜碱、青藤碱、莲心碱及其衍生物，更优选青藤碱及其衍生物。

3.权利要求1～2中任一项所述的透明质酸衍生物，其中体内可降解的分子桥选自可以具有取代基的碳数为2～12的的氨基酸和短肽，优选甘氨酸、天门冬氨酸、苯丙氨酸、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、牛磺酸及其衍生物，更优选甘氨酸、天门冬氨酸、谷胱甘肽及其衍生物。

4.权利要求1～3中任一项所述的透明质酸衍生物，其中透明质酸的重复2糖单元的摩尔数与导入含有酚羟基异喹啉类化合物的摩尔数比值为100:1～2:1。

5.一种透明质酸衍生物，含有酚羟基的异喹啉类化合物通过体内可降解的分子桥与透明质酸共价结合，其中导入了含有酚羟基的异喹啉类化合物的透明质酸二糖单元的部分结构，用(1)式表示：

HA-CO-NH-R₁-(CO-O-R₂)_n   (1) 

HA-CO-表示透明质酸二糖单元残基，-NH-R₁-(CO-O-)n表示含有n个羧基的氨基酸NH₂-R₁-(COOH)_n的分子桥残基，R₁表示可以具有取代基的碳数为1～12的直链或具有分枝的烃基，或表示由1～8个相同的或不同的氨基酸组成的肽链，-CO-NH-表示透明质酸二糖单元中糖醛酸的羧基与分子桥的氨基所形成的酰胺键，-CO-O-表示分子桥的羧基与含有酚羟基的化合物的酚羟基所形成的酯键，n表示1～3的整数；R₂代表含有酚羟基的化合物形成酯键后的剩余部分；此外，该透明质酸衍生物中含有酚羟基的化合物的导入率为1～50摩尔％，该透明质酸衍生物的透明质酸残基中的羰基，以参与含有酚羟基的化合物－分子桥结合形成的酰胺键和未反应的游离羧基两种形式存在。

6.权利要求5所述透明质酸衍生物，其中透明质酸残基中未反应的游离羧基与金属离子成盐，优选钠盐、钾盐和钙盐。

7.权利要求5所述透明质酸衍生物，其中透明质酸残基中未反应的游离羧基与非金属离子成盐，优选季铵盐。

8.权利要求5所述透明质酸衍生物，其中含有酚羟基的异喹啉类化合物用(2)式表示。

其中X＝H、Br、F、NO₂、CH₂OH、CHO；Y＝O、NOH；Z＝H、CH₃、CN、Ac、COCH₂CH₃、CH₂CH(CH₃)₂、COPh、COCH₂Ph、CH₂CH(CH₃)Ph。

9.权利要求5和6所述透明质酸衍生物，其中含有酚羟基的异喹啉类化合物是青藤碱。

10.权利要求1～7任一项所述的透明质酸衍生物用于制备非口服给药途径的药物，优选用于制备注射给药途径和植入给药途径的药物，更优选用于制备关节腔和眼后节局部注射或植入给药途径的药物。