CN104480197B - 一种用于香水椰子种苗纯度鉴定的特异ssr引物及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及香水椰子种苗栽培技术领域，公开了一种用于香水椰子种苗纯度的鉴定的特异SSR引物及其鉴定方法，先提取出香水椰子种苗的DNA，再用以上的特异SSR引物进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带，染色，即可根据分离出的条带情况将具有能结出香味椰果的香水椰子种苗和不能结出香味椰果的香水椰子种苗区分开。本发明所述的香水椰子种苗纯度鉴定方法，无需等到椰子树结果，在苗期即可准确鉴定出能结出香味椰果的香水椰子种苗，鉴定准确率高，能够保证出圃香水椰子种苗的纯度，具有重大的经济效益，对香水椰子的推广具有重大的现实意义。

Description

一种用于香水椰子种苗纯度鉴定的特异SSR引物及鉴定方法
技术领域
本发明涉及香水椰子种苗栽培技术领域，特别是指一种用于香水椰子种苗纯度的鉴定的特异SSR引物及鉴定方法。
背景技术
香水椰子是近年从泰国引进的椰子优良新品种，其主要特点是椰肉和椰汁具有一种用嗅觉可以闻到的糯米香味，香味明显的植株其叶片用手指揉搓后也可闻到淡淡的糯米香味，极受消费者青睐。同时香水椰子产量高，投产早，鲜果市场价值高，经济价值远远高于海南本地的椰子品种。
香水椰子授粉形式主要为自花授粉，但也存在风媒虫媒等介质的传粉。只要是自花授粉后，结出的椰果都会具有同母本一样的香味；但是一旦风媒、虫媒等介质带来其它品种的花粉，经授粉后结出的椰果就不再具有香味，但椰果在外观上同具有香味的椰果没有区别。这种不具有香味的椰果成熟后如用于育苗，其后代不再具有香味，但其外观性状同具有香味的种苗没有区别，无法用肉眼人为地剔除不纯的种苗。这种不纯的种苗如用于生产，从种植到结果大约四年时间都无法从外观鉴定出来，必须到结果后方可从椰果有或无香味进行鉴定。这样，势必造成大量的人力、物力和财力的浪费。同时，由于出圃种苗纯度得不到保证，严重影响广大种植者对香水椰子的认可和种植的积极性，进而影响香水椰子大面积推广工作的进行。
发明内容
本发明提出了一种用于香水椰子种苗纯度的鉴定的特异SSR引物及鉴定方法，能够在香水椰子苗期对种苗进行鉴定，将能够结出香味椰果的香水椰子种苗鉴定出来。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于香水椰子种苗纯度的鉴定的特异SSR引物序列为，左引物序列为(5'to3')TGAAAACAAAAGATAGATGTCAG，右引物序列为(5'to3')GAAGATGCTTTGATATGGAAC。
一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)香水椰子种苗叶片DNA的提取；
(2)利用特异SSR引物进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带；
(4)步骤(3)所得的电泳凝胶进行染色，拍照，即可根据条带情况将具有香味的香水椰子种苗鉴定出来。
进一步，所述步骤(1)香水椰子种苗叶片DNA提取采用改良的CTAB法。
进一步，步骤(1)所述改良的CTAB法，具体操作为：在提取缓冲液和裂解缓冲液中同时加入PVP40和β-巯基乙醇，在提取过程中，利用氯仿-异戊醇进行2-3次抽提。
进一步，所述步骤(2)PCR扩增程序为94-96℃预变性1-3min进入扩增循环；94-96℃变性20-40s，50-60℃退火40-50s，70-75℃延伸1min；重复循环25-35次，72℃延伸5-10min。
进一步，所述步骤(4)染色用试剂为硝酸银。
进一步，所述步骤(4)电泳凝胶上条带显示为2条的香水椰子种苗所结的椰果具有香味，电泳凝胶上条带显示为3条的香水椰子种苗所结的椰果不具有香味。
本发明的有益效果：
椰子树从育苗到结出椰果需要3-4年时间，而传统的育苗方法需要等到椰子结果才能将结出香味椰果的椰子植株挑选出来。自然条件下，如果不经过鉴定直接将种苗栽培，约有四分之一的种苗无法结出香味椰果。不能结出香味椰果的椰子树经济效益低，栽培过程中同样需要花费大量的人力、物力和财力，如果等到结果才发现不能结出香味椰果，无形中造成了种植户经济上的损失。香水椰子种苗纯度不高，也会挫伤广大种植户的积极性，阻碍了香水椰子的大面积推广。本发明采用SSR分子标记技术对香水椰子种苗进行纯度鉴定，可以在种苗期将能够结出香味椰果的香水椰子种苗和不能结出香味椰果的香水椰子种苗区分开来，无需等到椰子树结果之后再区分，能够保证出圃的香水椰子的种苗纯度，避免了在椰子树栽培过程中大量的人力、物力和财力的浪费，具有重大的经济意义。同时，香水椰子种苗纯度的提高，能够极大地调动了种植户的积极性，对香水椰子的推广具有显著的促进作用。
附图说明
图1本发明实施例1聚丙烯酰胺凝胶电泳图，编号1-10、13和14为椰果带有香味的香水椰子种苗；12和15-23为椰果不带香味的香水椰子种苗；11为marker。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
用于香水椰子种苗纯度鉴定的特异SSR引物序列为：左引物序列为(5'to3')TGAAAACAAAAGATAGATGTCAG，右引物序列为(5'to3')GAAGATGCTTTGATATGGAAC。
一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)香水椰子种苗叶片DNA的提取参考CTAB法，具体操作为：
取香水椰子种苗叶片，在研体中加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；加入裂解缓冲液水浴后，加入氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入乙酸钠和冰冻异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；钩出沉淀，加75％酒精清洗后，加75％酒精浸泡过夜；再加入75％酒精清洗后，加TE溶解DNA，加入Rnase水浴加热，先加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，最后加入乙酸钠和冰冻无水乙醇，缓慢摇匀，DNA沉淀析出后，钩出沉淀，加入75％酒精清洗3次，自然风干，加入TE溶解，即得香水椰子种苗DNA；
(2)利用以上的SSR引物，对步骤(1)所得的香水椰子种苗DNA进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带，PCR扩增程序为94℃预变性1min进入扩增循环；94℃变性20s，50℃退火40s，70℃延伸1min；重复循环25次，72℃延伸5min。
(4)步骤(3)所得的电泳凝胶采用硝酸银进行染色，拍照；电泳凝胶上带型显示为2条的香水椰子种苗所结的椰果具有香味，电泳凝胶上带型显示为3条的香水椰子种苗所结的椰果不具有香味，即可根据条带情况将椰果具有香味的香水椰子种苗鉴定出来。
实施例2
用于香水椰子种苗纯度鉴定的特异SSR引物序列为：左引物序列为(5'to3')TGAAAACAAAAGATAGATGTCAG，右引物序列为(5'to3')GAAGATGCTTTGATATGGAAC。
一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)香水椰子种苗叶片DNA的提取参考CTAB法，具体操作为：
取香水椰子种苗叶片，在研体中加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；按程序加入裂解缓冲液和氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入乙酸钠和冰冻异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；钩出沉淀，加75％酒精清洗后，加75％酒精浸泡过夜；再加入75％酒精清洗后，加TE溶解DNA，加入Rnase水浴加热，先加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，最后加入乙酸钠和冰冻无水乙醇，缓慢摇匀，DNA沉淀析出后，钩出沉淀，加入75％酒精清洗3次，自然风干，加入TE溶解，即得香水椰子种苗DNA；
(2)利用以上的SSR引物，对步骤(1)所得的香水椰子种苗DNA进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带，PCR扩增程序为95℃预变性2min进入扩增循环；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；重复循环30次，72℃延伸8min。
(4)步骤(3)所得的电泳凝胶采用硝酸银进行染色，拍照，即可根据条带情况将椰果具有香味的香水椰子种苗鉴定出来：电泳凝胶上带型显示为2条的香水椰子种苗所结的椰果具有香味，电泳凝胶上带型显示为3条的香水椰子种苗所结的椰果不具有香味。
实施例3
用于香水椰子种苗纯度鉴定的特异SSR引物序列为：左引物序列为(5'to3')TGAAAACAAAAGATAGATGTCAG，右引物序列为(5'to3')GAAGATGCTTTGATATGGAAC。
一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)香水椰子种苗叶片DNA的提取采用改良的CTAB法，具体操作为：
取香水椰子种苗叶片，在研体中加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；按程序加入裂解缓冲液和氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入乙酸钠和冰冻异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；钩出沉淀，加75％酒精清洗后，加75％酒精浸泡过夜；再加入75％酒精清洗后，加TE溶解DNA，加入Rnase水浴加热，先加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，最后加入乙酸钠和冰冻无水乙醇，缓慢摇匀，DNA沉淀析出后，钩出沉淀，加入75％酒精清洗3次，自然风干，加入TE溶解，即得香水椰子种苗DNA；
(2)利用以上的SSR引物，对步骤(1)所得的香水椰子种苗DNA进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带，PCR扩增程序为96℃预变性3min进入扩增循环；96℃变性40s，60℃退火50s，75℃延伸1min；重复循环35次，72℃延伸10min。
(4)步骤(3)所得的电泳凝胶采用硝酸银进行染色，拍照；电泳凝胶上带型显示为2条的香水椰子种苗所结的椰果具有香味，电泳凝胶上带型显示为3条的香水椰子种苗所结的椰果不具有香味，即可根据条带情况将椰果具有香味的香水椰子种苗鉴定出来。
本发明所述的香水椰子种苗纯度鉴定方法效果考察
采用本发明所述的椰子种苗纯度鉴定方法对300份经过椰果培育的香水椰子种苗进行鉴定，区分出椰果具有香味和不具有香味的香水椰子种苗。其中能够结出香味椰果的种苗228株，不能结出香味椰果的种苗72株。将两种香水椰子种苗分别进行栽培，结出椰果后记录椰果是否具有香味。实验结果如表1。
表1 香水椰子种苗鉴定方法效果考察
由表1可知，通过本发明所述的鉴定方法鉴定出的能够结出香味的椰果的香水椰子种苗，经过栽培，其中99％以上可以结出具有香味的椰果；鉴定出的不能够结出香味的椰果的香水椰子种苗，经过栽培，98％以上的种苗结出的椰果不具有香味。如果不经过鉴定，直接将香水椰子种苗出售，其中约有四分之一的种苗不能够结出香味椰果，将给种植户造成严重的经济损失，也会挫伤种植户的积极性，影响香水椰子的推广。通过采用本发明所述的香水椰子种苗纯度的鉴定方法对种苗纯度进行鉴定，无需等到香水椰子树结果即可快速、准确地将香水椰子种苗鉴定出来，准确度可达99％以上，能够有效避免种植户在香水椰子栽培过程中，由于种苗不纯造成的经济损失，具有极大的经济效益。应用本发明所述的香水椰子鉴定方法，可以大大提高香水椰子种苗出圃的纯度，有利于提高种植户的积极性，对香水椰子的推广具有重要的意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于香水椰子种苗纯度的鉴定的特异SSR引物，其特征在于：所述的特异SSR引物序列为，左引物序列为(5'to3')TGAAAACAAAAGATAGATGTCAG，右引物序列为(5'to3')GAAGATGCTTTGATATGGAAC。
2.一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)香水椰子种苗叶片DNA的提取；
(2)利用特异SSR引物进行PCR扩增，所述的特异SSR引物具有如权利要求1所述的序列；
(3)PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带；
(4)步骤(3)所得的电泳凝胶进行染色，拍照，即可根据条带情况将具有香味的香水椰子种苗鉴定出来。
3.根据权利要求2所述的一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(1)香水椰子种苗叶片DNA提取采用改良的CTAB法。
4.根据权利要求3所述的一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)所述改良的CTAB法，具体操作为：在提取缓冲液和裂解缓冲液中同时加入PVP40和β-巯基乙醇，在提取过程中，利用氯仿-异戊醇进行2-3次抽提。
5.根据权利要求2所述的一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(2)PCR扩增程序为94-96℃预变性1-3min进入扩增循环；94-96℃变性20-40s，50-60℃退火40-50s，70-75℃延伸1min；重复循环25-35次，72℃延伸5-10min。
6.根据权利要求2所述的一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(4)染色用试剂为硝酸银。
7.根据权利要求2所述的一种香水椰子种苗纯度的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(4)电泳凝胶上条带显示为2条的香水椰子种苗所结的椰果具有香味，电泳凝胶上条带显示为3条的香水椰子种苗所结的椰果不具有香味。
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