CN114634994A - 鉴别椰子香味性状的分子标记的引物、试剂盒、应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于种苗质量控制及新品种选育领域，公开了一种鉴别椰子香味性状的分子标记的引物、试剂盒、应用及方法，包括第一引物组和第二引物组，第一引物组由正向引物F和反向引物R1组成，第二引物组由正向引物F和方向引物R2组成。先提取拟检测椰子样品的DNA，再进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离并拍照，即可根据电泳条带鉴别拟检测样品是否具有香味性状。本发明可以在育苗阶段剔除不具有香味性状的劣质种苗，无需等到多年以后发现果实不香时再剔除高大的成年植株，从而避免了前期种植过程中人力、物力和财力的浪费，对于香水椰子种苗质量控制及分子辅助育种具有重要意义，在椰子种苗繁育和新品种选育领域应用前景广阔。

Description

鉴别椰子香味性状的分子标记的引物、试剂盒、应用及方法
技术领域
本发明属于种苗质量控制及新品种选育领域，具体涉及一种用于鉴别椰子香味性状的分子标记的引物、试剂盒、应用及方法。
背景技术
椰子(Cocos nucifera)是棕榈科椰子属中唯一的一个种，单子叶多年生常绿乔木，是热带地区重要的木本油料作物和食品能源作物，经济寿命达40-80年，自然寿命可达100年以上，被誉为热带地区的“生命之树”。
椰子可分为高种椰子、矮种椰子以及介于两者之间的杂交种，其中矮种椰子可按果皮颜色分为黄矮、红矮和绿矮，而“香水椰子”属于绿矮中的一种，椰子水、椰肉以及叶片都有令人愉悦的糯米香味，在市场上备受欢迎，价格约为其他绿矮椰子的两倍，我国每年从泰国、马来西亚等东南亚国家进口大量香水椰子。研究表明，香水椰子的香味来源于2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2AP)，受椰子氨基醛脱氢酶(CnAMADH2)等位基因控制。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，在植物农艺性状关联分析、生物遗传连锁图谱构建、分子标记分子育种等领域应用广泛。与其他分子标记相比，SNP分子标记分布广泛、准确性高，能有效避免形态学和环境因素的干扰，从而实现对靶基因及目标性状的早期鉴定。
椰子主要靠种果育苗，导致种苗纯度不高、品种一致性差，椰子从种苗定植到开花结果通常需要3-5年，而等到品种性状稳定并确认椰子果是否具有香味可能需要6-8年。种植管理过程中需要花费大量的人力、物力和财力，种苗品种不纯可能会给椰子种植户造成重大经济损失，并打击种植户或投资者对香水椰子推广种植的积极性，阻碍椰子种植业发展。此外，对拟改良的目标性状进行早期鉴定是缩短多年生作物育种周期的重要技术手段。我国20世纪90年代引进香水椰子后，经多年引种试种培育了“文椰4号”香水椰子品种，在鲜果市场备受关注，海南省近年来已推广种植近4万亩。但目前种苗市场混乱，香水椰子的种苗质量无法保障。因此，开发鉴别椰子香味性状的分子标记及方法对于香水椰子种苗鉴定及分子标记辅助育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别椰子香味性状的分子标记的引物，对于香水椰子种苗鉴定以及分子标记辅助育种具有重要意义，在椰子种苗质量控制以及新品种选育领域应用前景广阔。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种鉴别椰子香味性状的分子标记的引物，包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组由正向引物F和反向引物R1组成，第二引物组由正向引物F和方向引物R2组成，其中，正向引物F的核酸序列为：CGACTGCGAAGAGTGAAGGT(5'-3')；反向引物R1的核酸序列为：GTTTATCCATACAATTCCGGG(5'-3')；反向引物R2的核酸序列为：GTTTATCCATACAATTCCGGC(5'-3')。
本发明的另一目的在于提供一种鉴别椰子香味性状的试剂盒，包含上述的第一引物组(F+R1)、第二引物组(F+R2)其中的一种或两种。
本发明的另一目的在于提供一种上述的引物组在育苗阶段进行早期鉴定椰子香味性状的应用。
本发明的再一目的在于提供鉴别椰子香味性状的方法，步骤如下：
步骤S1、提取椰子种苗或大树的DNA；
步骤S2、使用权利要求2所述的引物组对上述DNA进行PCR扩增；
步骤S3、使用琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR扩增产物；
步骤S4、根据电泳图中的条带情况，鉴别所检测的椰子样品是否具有香味性状：使用第一引物组的PCR扩增产物在1095bp处有条带的是具有香味性状的样品，相同位置无条带出现的是不具有香味性状的样品；使用第二引物组的PCR扩增产物在1095bp处有条带的是不具有香味性状的样品，相同位置有条带出现的是具有香味性状的样品；综合上述两个引物组的鉴别结果，即可准确鉴别椰子香味性状。
进一步地，步骤S2中，PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。
进一步地，步骤S3中，电泳条件为：2％琼脂糖凝胶，140V、20min；紫外照射并拍照。
本发明使用分子标记技术鉴别所检测的椰子是否具有香味性状，可以在育苗阶段剔除不具有香味性状的劣质种苗，无需等到多年以后发现果实不香时再剔除高大的成年植株，从而避免了前期种植过程中人力、物力和财力的浪费，对于香水椰子种苗质量控制以及分子辅助育种具有重要意义，在椰子种苗繁育和新品种选育领域应用前景广阔。
附图说明
图1是本发明引物组与香味性状对应的PCR电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按制造厂商所建议的条件。
实施例一
(1)合成用于鉴别椰子香味性状的分子标记引物，其中，正向引物F的核酸序列为：CGACTGCGAAGAGTGAAGGT(5'-3')；反向引物R1的核酸序列为：GTTTATCCATACAATTCCGGG(5'-3')；反向引物R2的核酸序列为：GTTTATCCATACAATTCCGGC(5'-3')。
(2)椰子叶片的DNA提取参考CTAB法，具体操作为：
取适量椰子叶片，剪碎放在研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；加入裂解缓冲液后水浴，加入氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入预冷的乙酸钠和异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗2-3次，加75％酒精浸泡过夜；加入75％酒精再次清洗后，加TE溶解DNA，加入RNA酶水浴加热，加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，再加入预冷的乙酸钠和无水乙醇，缓慢摇匀至DNA沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗3次，在超净台中自然风干，加入TE溶解，即可得到拟检测样品的DNA。
(3)使用步骤(1)所述的引物组，分别对步骤(2)所得的DNA进行PCR扩增；PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。
(4)PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳分离条带；电泳条件为：2％琼脂糖凝胶，140V、20min；紫外照射并拍照。
(5)根据电泳图中的条带情况，鉴别所检测样品是否具有香味性状：使用引物组1(F+R1)的PCR扩增产物在1095bp处有条带的是具有香味性状的样品，相同位置无条带出现的是不具有香味性状的样品；使用引物组2(F+R2)的PCR扩增产物在1095bp处有条带的是不具有香味性状的样品，相同位置有条带出现的是具有香味性状的样品；综合上述两个引物组的鉴别结果，即可准确鉴别椰子香味性状。
鉴别效果：
实验材料：以农业部文昌椰子种质资源圃(中国热带农业科学院椰子研究所)中稳定产果10年以上的椰子树为材料，选择椰子果经人感官评价鉴定为“香”和“不香”的叶片样品各50份。
实验方法：使用本发明所述的鉴别椰子香味性状的分子标记的引物及方法(提取叶片DNA，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后拍照)。
实验结果：以椰子果经人感官评价鉴定为“香”和“不香”的鉴定结果为标准，本发明所述的鉴别椰子香味性状的分子标记及方法的鉴定结果与实际情况完全相符，鉴别椰子香味性状的准确率为100％。鉴别效果如表1所示。
表1椰子香味性状的鉴别效果
Figure BDA0003622268570000041
Figure BDA0003622268570000051
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (6)

1.一种鉴别椰子香味性状的分子标记的引物，其特征在于：包括第一引物组和第二引物组，所述第一引物组由正向引物F和反向引物R1组成，第二引物组由正向引物F和方向引物R2组成，其中，正向引物F的核酸序列为：CGACTGCGAAGAGTGAAGGT(5'-3')；反向引物R1的核酸序列为：GTTTATCCATACAATTCCGGG(5'-3')；反向引物R2的核酸序列为：GTTTATCCATACAATTCCGGC(5'-3')。
2.一种鉴别椰子香味性状的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述第一引物组、第二引物组其中的一种或两种。
3.一种权利要求1或2所述引物组在育苗阶段进行早期鉴定椰子香味性状的应用。
4.一种鉴别椰子香味性状的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤S1、提取椰子种苗或大树的DNA；
步骤S2、使用权利要求2所述的引物组对上述DNA进行PCR扩增；
步骤S3、使用琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR扩增产物；
步骤S4、根据电泳图中的条带情况，鉴别所检测的椰子样品是否具有香味性状：使用第一引物组的PCR扩增产物在1095bp处有条带的是具有香味性状的样品，相同位置无条带出现的是不具有香味性状的样品；使用第二引物组的PCR扩增产物在1095bp处有条带的是不具有香味性状的样品，相同位置有条带出现的是具有香味性状的样品；综合上述两个引物组的鉴别结果，即可准确鉴别椰子香味性状。
5.根据权利要求4所述的鉴别椰子香味性状的方法，其特征在于：步骤S2中，PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。
6.根据权利要求4所述的鉴别椰子香味性状的方法，其特征在于：步骤S3中，电泳条件为：2％琼脂糖凝胶，140V、20min；紫外照射并拍照。
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Citations (1)

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CN104480197A (zh) * 2014-11-18 2015-04-01 中国热带农业科学院椰子研究所 一种用于香水椰子种苗纯度的鉴定的特异ssr引物及鉴定方法

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