CN104479041B - 一种具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从海带中提取具有抗肿瘤活性的海带多糖的方法，包括下述步骤:原料处理、超高压处理、超声波处理、褐藻酸盐的去除、脱色、去除蛋白、干燥即得成品。经试验证明，所得到的海带多糖具有很好的抗肿瘤活性。

Description

一种具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种多糖的制备方法，具体涉及一种从海带中提取具有抗肿瘤活性的海带多糖的方法。

背景技术

海带(Laminaria Japonica Aresch)是褐藻门海带目海带科海带属的大型海藻。海带富含多种功能性成分，具有极高的食用和药用价值，其药用价值在《本草纲目》、《神农本草经》和《食物本草》等传统医书中都已有记载。研究表明海带的多种生物功能大多与海带中的生理活性多糖有关，如免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、降脂、降糖、抗氧化等。

对于具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法也有很多学者进行了研究和探讨，传统方法主要为酸提取法、碱提取法、酶提取法等。这些制备方法都存在一定的缺陷。酸提可造成多糖水解碱提取法造成多糖生物活性降低。酶提取法耗时，工业生产需要使用的酶量大，成本高。热水提取醇沉的方法简便，但是耗时耗能。脱除多糖中蛋白的方法有三氯乙酸沉淀法及savage法等，利用三氯乙酸沉淀蛋白，多糖收率较高，但常伴有糖链降解；savage法采用氯仿及戊醇等有机试剂使蛋白变性、沉淀，其处理条件温和，能较好的避免多糖降解，但处理效率低，多糖损失严重。如中国专利CN103421126A，公开了一种提取海带多糖的方法，将海带洗净后，晒干、粉碎、过筛后浸泡到水中，经过水提和超声波浸提，然后再醇沉，得到海带多糖沉淀，最后将沉淀烘干，即的粗品的海带多糖，该方法得到海带多糖含量低。如中国专利CN102367282B，公开一种具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法：海带粉碎后加水，调节pH值至1-4，在100-120℃下提取2-5小时，过滤，得提取液，用含有钾的碱调节提取液pH值至6.3-7.0将提取液浓缩至固形物含量为35-48％的浓缩液，浓缩液中加入乙醇，混合均匀后在4℃下静置4-12小时，过滤，得多糖沉淀，冷冻干燥，得到海带多糖。采用该方法，得到的多糖含量比较低，而且整个工序时间长。

近年来，虽然国内外学者已经对海带多糖的提取分离纯化进行了研究，并取得了一定进展，但针对多糖的特定药理活性，研究较少，这在一定程度上制约了海带多糖的精深加工与应用。

发明内容

本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法，包括下述步骤：

1)原料处理：将海带，粉碎或打碎；

2)超高压处理：粉碎或打碎后的海带中加入40-60倍重量份的纯净水，压力350MPa，作用温度70-85℃，超高压处理2-5min，完成后过滤，收集滤液；

3)超声波处理：将步骤2)得到滤液，超声波处理5-10min，作用温度70-85℃，功率为300W，完成后过滤，收集滤液；

4)褐藻酸盐的去除：用浓度为1.5M的盐酸溶液调节步骤3)得到滤液的pH值为1.2，在转速12000r/min下离心20min，收集上清液；

5)脱色：向步骤4)得到的上清液中加入相当于上清液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，上清液中加入上清液重量0.5％的活性碳，80℃保温25-35min进行脱色，抽滤，收集滤液；

6)去除蛋白、干燥：向步骤5)得到的滤液中加入相当于滤液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，向滤液中缓缓加入醋酸钾稀溶液至终浓度2mol/L，4℃静置过夜，离心10-15min，沉淀进行冷冻干燥得海带多糖。

本发明所述的海带为新鲜或干制后的海带。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明采用超高压处理海带原料，在预定压力保持一段时间,使原料细胞内外压力达到平衡(有效成分达到溶解平衡)后迅速卸压,使细胞内外渗透压力差突然增大,细胞内的有效成分穿过细胞膜(细胞膜的结构在超高压下发生变化),转移到细胞外的提取液中,达到提取目标成分的目的。超高压提取避免了因长时间高温而引起的有效成分的变化、损失以及生理活性的降低，同时因为超高压是在密闭的环境下进行的，没有溶剂的挥发，不会对环境造成污染。是一种安全有效的提取活性物质的方法。

2、本发明在采用超高压处理原料后，接着再采用超声波提取，超声波提取利用的是强烈的机械剪切作用，促进多糖的溶出，本发明通过采用两种提取方式的结合，一方面缩短了提取时间，另一方面提高了产品得率，采用本发明的方法，多糖含量98.5％以上，提取率70％以上。

3、采用醋酸钾进行除蛋白，安全性高且易回收再利用，去除蛋白率高反应条件易控制，避免了传统Sevage法去除蛋白中高毒性有机溶剂氯仿的使用，也避免了采用双氧水除蛋白而造成的目标产物结构异构化导致海带多糖含量下降，生产相对较安全，产品含量较高。

4、本发明得到的海带多糖含量高，具有很好的抗肿瘤活性，为制备抗肿瘤药物提供新的选择。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：

一种具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法，包括下述步骤：

1)原料处理：将干制后的海带10kg，粉碎；

2)超高压处理：粉碎后的海带中加入400kg的纯净水，压力350MPa，作用温度85℃，超高压处理4min，完成后过滤，收集滤液；

3)超声波处理：将步骤2)得到滤液，超声波处理10min，作用温度85℃，功率为300W，完成后过滤，收集滤液；

4)褐藻酸盐的去除：用浓度为1.5M的盐酸溶液调节步骤3)得到滤液的pH值为1.2，在转速12000r/min下离心20min，收集上清液；

5)脱色：向步骤4)得到的上清液中加入相当于上清液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，上清液中加入上清液重量0.5％的活性碳，80℃保温25min进行脱色，抽滤，收集滤液；

6)去除蛋白、干燥：向步骤5)得到的滤液中加入相当于滤液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，向滤液中缓缓加入醋酸钾稀溶液至终浓度2mol/L，4℃静置过夜，离心10min，沉淀进行冷冻干燥得海带多糖。

实施例2：

1)原料处理：将新鲜的海带10kg，打碎；

2)超高压处理：打碎后的海带中加入600kg的纯净水，压力350MPa，作用温度80℃，超高压处理2min，完成后过滤，收集滤液；

3)超声波处理：将步骤2)得到滤液，超声波处理8min，作用温度80℃，功率为300W，完成后过滤，收集滤液；

4)褐藻酸盐的去除：用浓度为1.5M的盐酸溶液调节步骤3)得到滤液的pH值为1.2，在转速12000r/min下离心20min，收集上清液；

5)脱色：向步骤4)得到的上清液中加入相当于上清液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，上清液中加入上清液重量0.5％的活性碳，80℃保温30min进行脱色，抽滤，收集滤液；

6)去除蛋白、干燥：向步骤5)得到的滤液中加入相当于滤液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，向滤液中缓缓加入醋酸钾稀溶液至终浓度2mol/L，4℃静置过夜，离心12min，沉淀进行冷冻干燥得海带多糖。

实施例3：

1)原料处理：将干制后的海带10kg，粉碎；

2)超高压处理：粉碎后的海带中加入500kg的纯净水，压力350MPa，作用温度70℃，超高压处理5min，完成后过滤，收集滤液；

3)超声波处理：将步骤2)得到滤液，超声波处理5min，作用温度70℃，功率为300W，完成后过滤，收集滤液；

4)褐藻酸盐的去除：用浓度为1.5M的盐酸溶液调节步骤3)得到滤液的pH值为1.2，在转速12000r/min下离心20min，收集上清液；

5)脱色：向步骤4)得到的上清液中加入相当于上清液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，上清液中加入上清液重量0.5％的活性碳，80℃保温35min进行脱色，抽滤，收集滤液；

6)去除蛋白、干燥：向步骤5)得到的滤液中加入相当于滤液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，向滤液中缓缓加入醋酸钾稀溶液至终浓度2mol/L，4℃静置过夜，离心15min，沉淀进行冷冻干燥得海带多糖。

实验例：本发明得到的海带多糖对癌细胞的抑制作用

1、实验材料：本发明实施例1、实施例2得到的海带多糖。

实验地点：广西桂林医学院。

2、肿瘤细胞株：人膀胱癌细胞株T-24，用RPMI-1649培养液，37℃，5％C0₂，相对湿度100％培养，贴壁细胞0.25％胰蛋白酶消化传代。

3、方法MTT比色法测定提取物对肿瘤细胞生长的抑制作用。取对数生长期细胞，用新鲜的RPMI-1640培养液配制成细胞悬液，悬浮细胞1X10⁵个/ml贴壁细胞0.8X10⁵个/ml。悬浮细胞分别加入不同浓度实验药物后接种于96孔培养板中；贴壁细胞先接种于96孔培养板中，每孔90μl，24h后分别加入不同浓度实验药物。终体积为每孔100μl且每组设3个平行孔，共设4组：受试药组T(培养液+细胞悬液+不同浓度受试药)、阴性对照组N(培养液+细胞悬液)、药物颜色对照组TC(培养液+不同浓度受试药)、空白对照组B(培养液+生理盐水)。受试药浓度依次为10μg/m1,30μg/m1,50μg/ml。置37℃，5％C0₂培养箱中培养72h后，向每孔加入MTT溶液10μl震荡混匀后，继续培养4h，加入SDS90μl终止培养，37℃过夜，然后室温下在微量振荡器上震荡10min,酶标仪测定570nm波长处的吸光度(OD值)，实验重复3次。

按以下公式计算生长抑制率:

生长抑制率(％)＝[(N组OD均值-B组OD均值)-(T组OD均值-TC组OD均值)]/[N组OD均值-B组OD均值]X 100％。

4、药物对人膀胱癌细胞株T-24的抑制率结果见表1。

表1：对株T-24的抑制率结果

结果表明，实施例1、实施例2得到的海带多糖对T-24细胞的增殖有抑制作用，实施例2疗效好于实施例1。

Claims (2)

1.一种具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)原料处理：将海带，粉碎或打碎；

2)超高压处理：粉碎或打碎后的海带中加入40-60倍重量份的纯净水，压力350MPa，作用温度70-85℃，超高压处理2-5min，完成后过滤，收集滤液；

3)超声波处理：将步骤2)得到滤液，超声波处理5-10min，作用温度70-85℃，功率为300W，完成后过滤，收集滤液；

4)褐藻酸盐的去除：用浓度为1.5M的盐酸溶液调节步骤3)得到滤液的pH值为1.2，在转速12000r/min下离心20min，收集上清液；

5)脱色：向步骤4)得到的上清液中加入相当于上清液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，上清液中加入上清液重量0.5％的活性碳，80℃保温25-35min进行脱色，抽滤，收集滤液；

6)去除蛋白、干燥：向步骤5)得到的滤液中加入相当于滤液重量2倍的质量浓度为95％的乙醇，4℃静置4h，过滤，向滤液中缓缓加入醋酸钾稀溶液至终浓度2mol/L，4℃静置过夜，离心10-15min，沉淀进行冷冻干燥得海带多糖。

2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的海带多糖的制备方法，其特征在于：所述的海带为新鲜或干制后的海带。