CN104447787A - 从豚草中分离纯化两种倍半萜内酯化合物的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

一种从豚草(Ambrosia artemisiifolia L.)中分离纯化两种倍半萜内酯化合物的方法，该方法是先用乙醇浸提，经石油醚、乙酸乙酯萃取后，乙酸乙酯萃取层再经小孔吸附树脂除去色素，经ODS C-18反相柱层析、葡聚糖凝胶柱层析分离后，最后利用石油醚/丙酮重结晶，得到高纯度的单体化合物psilostachyin和psilostachyin B。本方法操作简单，所使用的小孔吸附树脂、ODS C-18、葡聚糖凝胶都可以重复利用，并且经实验证实，所得的两单体化合物对入侵生物福寿螺(Pomacea canaliculata Lamarck)具有良好的毒杀效果，可用于防治福寿螺，具有良好的开发前景。

Description

从豚草中分离纯化两种倍半萜内酯化合物的方法及应用
技术领域
本发明属于农业防治领域，具体地说，是一种从豚草中分离纯化两种倍半萜内酯化合物psilostachyin和psilostachyin B的方法和应用。
背景技术
福寿螺(Pomacea canaliculata Lamarck)起源于南美洲，在我国主要分布于长江以南地区，主要取食水稻分蘖嫩芽和水生植物，是一种对农业生产危害十分严重的入侵水生动物。目前对福寿螺的防治主要以化学药剂防治为主，如氯硝柳胺和聚乙醛等，但化学药剂除成本高，对其它非靶标生物毒性较大外，还对生态环境污染严重，影响农业的安全生产。豚草(Ambrosia artemisiifoliaL.)是近年来入侵我国的恶性杂草，能严重影响农业生产，并破坏生物的多样性。因此，利用豚草这种恶性入侵植物来灭杀福寿螺，既能有效地控制福寿螺，又能在一定程度上遏制豚草的蔓延，可谓“以毒攻毒”、“一箭双雕”。
已有专利CN103004892A报道豚草干粉对福寿螺有毒杀作用，在水体中投加10g/L的豚草干粉末3天后能灭杀95％的福寿螺，显示了豚草具有较好的杀福寿螺应用前景。但是该专利并未涉及豚草中灭杀福寿螺的活性成分，截至目前，国内外对豚草中灭杀福寿螺的活性成分也尚无研究报道。基于此，本发明进一步对豚草的活性成分进行分离纯化，提供了一种从该植物中快速提取纯化出毒杀福寿螺活性成分的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种操作简便的从豚草中分离纯化两种倍半萜内酯化合物的方法，同时提供该两种化合物在防治福寿螺中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种从豚草中分离纯化两种倍半萜内酯化合物的方法，该方法步骤如下：
A、取豚草地上部分，洗净、风干、粉碎成粒度≤20目的粉末，按1g豚草粉加3-7ml 95％体积百分浓度的乙醇的比例，于豚草粉中加入乙醇在室温下浸提3次，每次浸提48-96小时，过滤，合并滤液，减压浓缩回收乙醇后，得到膏状乙醇浸提物；
B、按1g乙醇浸提物加30-60ml水的比例，将乙醇浸提物加水分散，再依次用等体积的石油醚和乙酸乙酯于常温分别萃取3次，每次萃取时间为3-5小时，得到石油醚萃取层和乙酸乙酯萃取层，减压回收石油醚和乙酸乙酯萃取液，得石油醚浸膏和乙酸乙酯浸膏；其中，石油醚和乙酸乙酯皆为分析纯；
C、将乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解为饱和溶液后经小孔吸附树脂吸附至饱和，先用水洗脱至无色后，再用90％体积百分浓度的甲醇洗脱至无色，收集洗脱液，浓缩得浓缩物；
上述小孔吸附树脂只要是能用于去除乙酸乙酯膏色素的皆可，如MCI GELCHP 20P 37-75um或SMB MCI GEL 50-70um等。
D、将浓缩物上ODS C-18反相色谱柱进行层析，用体积比为3:7→7:3的甲醇与水的混合液进行梯度洗脱，收集甲醇与水的体积比为4:6时的洗脱液，经薄层色谱检测，合并相同主点馏分，得到两组分，将该两组分分别上葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)柱层析进行纯化，用甲醇进行洗脱，经薄层色谱检测，合并主点馏分并减压浓缩，获得两个固体状物，再将所得固体分别用体积比为1：1混合的石油醚和丙酮重结晶，得到单体化合物1和2；
E、采用核磁共振氢谱及核磁共振碳谱技术对上述单体化合物1和2进行结构鉴定及理化性质的比对，确证所得单体化合物1为psilostachyin，单体化合物2为psilostachyin B。
经验证，上述二单体化合物psilostachyin和psilostachyin B对福寿螺具有毒杀作用，因此，本发明同时提供上述二单体化合物在防治福寿螺中的应用。
如此，本发明从豚草中得到两个杀福寿螺的主要活性成分，使得开发利用豚草中活性成分比利用豚草干粉防治福寿螺更加高效、可控；本方法操作简便，且使用的填料小孔吸附树脂、ODS C-18、葡聚糖凝胶等都可以重复使用，成本低，污染小。并且，豚草属于植物材料，利用其提取物防治福寿螺是一种以害治害的生态防控手段，不仅能有效地防治福寿螺，而且可以控制豚草的蔓延；为有害入侵植物的资源化利用开辟了新的途径，对于入侵生态学及生物入侵控制技术的研究都有极大的参考价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1.化合物的提取分离
取10kg风干粉碎成粉末的豚草地上部分，室温下用50L 95％体积百分浓度的乙醇浸提3次，每次浸提50小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩回收乙醇后，得到膏状乙醇浸提物500g，将该500g乙醇浸提物加20L水分散，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，各萃取3次，每次萃取4小时，得石油醚萃取层和乙酸乙酯萃取层，减压回收石油醚和乙酸乙酯萃取液，得石油醚浸膏90g、乙酸乙酯浸膏90g；将乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解为饱和溶液，经小孔吸附树脂(MCI GEL CHP20P 37-75um)吸附至饱和，先用水洗脱至无色后，再用90％体积百分浓度的甲醇洗脱至无色，收集洗脱液，浓缩；将所得浓缩物过ODS C-18反相色谱柱层析，用甲醇/水(3:7→7:3，v/v)进行梯度洗脱，每个浓度收集10瓶，每瓶100mL，收集甲醇:水＝4:6(v/v)洗脱部分，经薄层色谱检测，合并相同主点馏分即合并第1-3瓶和第5-9瓶，得到两组分，将该两组分分别利用Sephadex LH-20柱层析分离纯化(用甲醇进行洗脱)，经薄层色谱检测，合并主点馏分并减压浓缩，获得两个固体状物，将它们分别进一步利用石油醚/丙酮(1：1，v/v)重结晶，得到两个无色针状结晶的单体化合物1(60mg)和2(90mg)，经HPLC检测纯度为95％以上。
2.化合物的结构鉴定
上述化合物1，为无色针状晶体，核磁共振数据如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.27(H-11a,d,J＝3.2Hz,1H),5.58(H-11b,d,J＝3.2Hz,1H),4.99(H-8,d,J＝9.5Hz,1H),3.43(C-H,m,1H),2.90-1.49(m,complex signal),1.23(H-5,s,3H),1.06(H-1,d,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ177.32(C4),169.68(C12),139.00(C11),121.77(C13),93.64(C5),83.42(C8),79.58(C1),41.72(C7),40.17(C10),30.21(C6),27.30(C3),26.94(C9),15.04(C2),14.85(C14),14.64(C15).对照文献，其1HNMR和13CNMR数据与psilostachyin一致，并且理化性质中晶体熔点213°、旋光值 (c 0.5，CHCl3)与文献报道一致(中国中药杂志,1993,18(3)：164-166)，所以进一步鉴定为同一物，即确定化合物1为psilostachyin。
上述化合物2，为无色针状晶体，1HNMR谱显示：存在2个典型的单峰甲基信号[δH 1.54(s,H3-14)和1.44(s,H3-15)]，在C-6上存在1个典型的内酯键[δH 4.88(d,J＝9.1Hz,H-6)]，在C-11上存在α,β'不饱和γ内酯形式的环外亚基组，有1对相互影响强烈的双峰质子[δH 6.25(d,J＝3.5Hz,H-13a)和5.48(d,J＝3.1Hz,H-13b)]。1H NMR(400MHz,Pyr)δ6.25(1H,d,J＝3.5Hz,H-13a),5.48(1H,d,J＝3.1Hz,H-13b),4.88(1H,d,J＝9.1Hz,H-6),3.30(1H,m,H-7),2.68(1H,ddd,J＝16.9,9.3,6.2Hz,H-9a),2.50(1H,ddd,J＝16.9,6.9,5.5Hz,H-9b),2.42–2.28(2H,m,H-2),2.24–2.16(2H,m,H-3),1.87(1H,ddd,J＝14.2,9.5,4.8Hz,H-8a),1.67–1.58(1H,m,H-8b),1.54(3H,s,H-14),1.44(3H,s,H-15).13C NMR(100MHz,Pyr)δ171.27(C-4),170.64(C-12),139.83(C-11),133.61(C-1),126.71(C-10),120.57(C-13),87.42(C-5),84.19(C-6),42.09(C-7),35.18(C-3),30.51(C-8),26.30(C-9),25.80(C-2),23.87(C-14),23.21(C-15).对照文献，其1HNMR和13CNMR数据与psilostachyin B一致，鉴定为同一物，并且理化性质中晶体熔点118°、旋光值(c 0.7，CHCl3)与文献报道一致(Phytochemistry,1986,25(6):1355-1358)，所以进一步鉴定为同一物，即确定化合物2为psilostachyin B。
上述二化合物psilostachyin和psilostachyin B的结构式为：
实施例2本发明的二单体化合物对福寿螺的毒杀实验
福寿螺毒杀实验采用浸泡法。将本发明制备的两个化合物分别配制成5组不同浓度的水溶液，置于玻璃容器中；每组投放25只健康福寿螺，完全浸没，在玻璃容器口盖上一层纱网防止福寿螺逃逸。于处理24h、48h、72h时分别取出疑似死亡的个体，用蒸馏水复苏30min，30min内开厣爬行的为活螺，刺探无反应的定为死亡个体。同时设置空白对照，每个处理重复3次，实验温度为26℃。结果见下表1。
表1 豚草倍半萜内酯对初孵福寿螺的毒杀活性
上述实验结果表明，在psilostachyin 25mg/L的浓度下，3天后福寿螺的死亡率达到100％；在psilostachyin B 25mg/L的浓度下，3天后福寿螺的死亡率也达到了88.9％，说明psilostachyin和psilostachyin B对福寿螺都有明显的毒杀活性，两者相比，psilostachyin效果更好。

Claims (5)

1.一种从豚草中分离纯化两种倍半萜内酯化合物的方法，其特征在于，该方法步骤如下：
A、取豚草地上部分，洗净、风干、粉碎成粉末，按1g豚草粉加3-7ml 95％体积百分浓度的乙醇的比例，于豚草粉中加入乙醇在室温下浸提3次，每次浸提48-96小时，过滤，合并滤液，减压浓缩回收乙醇后，得到膏状乙醇浸提物；
B、按1g乙醇浸提物加30-60ml水的比例，将乙醇浸提物加水分散，再依次用等体积的石油醚和乙酸乙酯于常温分别萃取3次，每次萃取时间为3-5小时，得到石油醚萃取层和乙酸乙酯萃取层，减压回收石油醚和乙酸乙酯萃取液，得石油醚浸膏和乙酸乙酯浸膏；
C、将乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解为饱和溶液后经小孔吸附树脂吸附至饱和，先用水洗脱至无色后，再用90％体积百分浓度的甲醇洗脱至无色，收集洗脱液，浓缩得浓缩物；
D、将浓缩物上ODS C-18反相色谱柱进行层析，用甲醇与水按体积比为3:7→7:3的混合液进行梯度洗脱，收集甲醇与水的体积比为4:6时的洗脱液，经薄层色谱检测，合并相同主点馏分，得到两组分，将该两组分分别上SephadexLH-20柱层析进行纯化，用甲醇进行洗脱，经薄层色谱检测，合并主点馏分并减压浓缩，获得两个固体状物，再将所得固体分别用体积比为1：1混合的石油醚和丙酮重结晶，得到单体化合物1和2；
E、采用核磁共振氢谱及核磁共振碳谱技术对上述单体化合物1和2进行结构鉴定及理化性质的比对，确证所得单体化合物1为psilostachyin，单体化合物2为psilostachyin B。
2.如权利要求1所述的从豚草中分离纯化两种倍半萜内酯化合物的方法，其特征在于，所述步骤C中的小孔吸附树脂为MCI GEL CHP20P 37-75um或SMB MCIGEL 50-70um。
3.如权利要求1所述的从豚草中分离纯化两种倍半萜内酯化合物的方法，其特征在于，所述步骤A中的豚草粉粒度≤20目。
4.如权利要求1-3所述的单体化合物psilostachyin在防治福寿螺中的应用。
5.如权利要求1-3所述的单体化合物psilostachyin B在防治福寿螺中的应用。
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