CN104436159A - 一种新型滴眼液对治疗干眼的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型滴眼液对治疗干眼的用途，所述新型滴眼液是含有α-MSH的滴眼液，α-MSH的质量浓度为10^-4-10^-3mg/ml，用于治疗干眼。α-MSH的优选质量浓度为10^-4mg/ml。本发明通过对大鼠进行泪膜破裂时间BUT、泪液分泌（SchirmerItest）测量、角膜上皮荧光素钠染色（fluoresceinstaining）及评分和泪液蕨类实验分析。然后取大鼠整个眼球，行HE及过碘酸-雪夫PAS染色，并取大鼠新鲜角膜行实时定量PCR检测角膜组织中白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-αmRNA的表达水平。发现含α-MSH的滴眼液能够促进大鼠泪液分泌，延长泪膜破裂时间，稳定泪膜，促进角膜上皮损伤修复及杯状细胞数量恢复，并减轻眼表炎症反应。含α-MSH的滴眼液有利于缓解干眼病变。

Description

一种新型滴眼液对治疗干眼的用途

技术领域

本发明涉及一种药物的应用，具体是一种新型滴眼液对治疗干眼的用途。

背景技术

干眼是由各种原因引起的一种常见眼表疾病，发病率日趋增高，严重影响了人们的视觉和生活质量。而目前我国对于干眼的研究仍处于起步阶段，国际上也缺乏治疗干眼的有效方法。这就迫切需要加强对干眼的研究，针对其发病机制研制干眼的治疗方案，为干眼患者解除痛苦。

全球 15～35%的人群伴有干眼相关的症状或体征。2007 年国际干眼工作小组将干眼新定义为：一种能引起患眼不适、视觉障碍和泪膜不稳定，损害泪液和眼表组织并伴有泪液渗透压增高和眼表炎症的多因素疾病。近年来的研究也指向干眼的发病与炎症、免疫、细胞凋亡及性激素水平等有关。目前，临床上常用人工泪液替代物缓解症状，但对中、重度干眼病不适用；自体血清适用于中、重度干眼病，但因其保存受限而无法广泛应用于临床；其它如糖皮质激素长期应用全身副作用大等。因此，从干眼的发病机制出发，研发一种新型的能有效治疗干眼的药物并应用于临床是亟待解决的关键问题。

α-黑素细胞刺激素（α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH）是阿片-促黑素细胞皮质素原在前体激素转换酶作用下释放出的13个氨基酸残基，经末端化学修饰后具有生物学活性。

既往研究表明，α-MSH具有强有力的抗炎作用，并可促进角膜上皮细胞的损伤修复。本研究拟通过腹部皮下注射氢溴酸东莨菪碱注射液建立大鼠干眼模型，探讨含α-MSH的滴眼液对大鼠干眼眼表的保护效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型滴眼液对治疗干眼的用途,且该滴眼液能够促进泪液分泌，延长泪膜破裂时间，稳定泪膜，促进角膜上皮损伤修复及杯状细胞数量恢复，并减轻眼表炎症反应，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型滴眼液对治疗干眼的用途，所述新型滴眼液是含有α-MSH的滴眼液，α-MSH的质量浓度为10^-4-10^-3mg/ml，用于治疗干眼。

作为本发明进一步的方案：所述新型滴眼液中α-MSH的质量浓度为10^-4mg/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对大鼠进行泪膜破裂时间BUT、泪液分泌（Schirmer I test）测量、角膜上皮荧光素钠染色（fluorescein staining）及评分和泪液蕨类实验分析。于28天，取大鼠整个眼球，行HE及过碘酸-雪夫PAS染色，并取大鼠新鲜角膜行实时定量PCR检测角膜组织中白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α mRNA的表达水平。发现含α-MSH的滴眼液能够促进大鼠泪液分泌，延长泪膜破裂时间，稳定泪膜，促进角膜上皮损伤修复及杯状细胞数量恢复，并减轻眼表炎症反应。含α-MSH的滴眼液有利于缓解干眼病变。

附图说明

图1是各组在第7天、14天、21天、28天的临床指标。(A)泪液分泌量；(B)泪膜破裂时间；(C)荧光素钠染色。其中：*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，10^-3mg/mlα-MSH治疗组versus 0.9％NaCl溶液治疗组；+P<0.05,++P<0.01,+++P<0.001,10^-4mg/mlα-MSH治疗组versus 0.9％NaCl溶液治疗组；^×P<0.05,^××P<0.01,^×××P<0.001,10^-5mg/mlα-MSH治疗组versus0.9％NaCl溶液治疗组。正常组的泪液分泌量为7.3mm，BUT为10.3s，荧光素钠染色标记为0。

图2是五组大鼠28天时角膜上皮荧光素钠染色(A–E)和HE染色(F–J,×200)的代表性图片。其中(A,F)正常组；(B,G) 0.9%NaCl溶液治疗组；(C,H) 10^-5α-MSH治疗组；(D,I) 10^-4α-MSH治疗组；(E,J) 10^-3α-MSH治疗组。

图3是五组大鼠21天时泪液蕨类结晶图像的代表性图片(×200)。

图4是各组大鼠28天时结膜PAS染色的代表性图片(×200)。

图5是各组大鼠28天时杯状细胞计数，其中*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001。

图6是实时定量PCR检测角膜组织中IL-1β和TNF-α mRNA的表达水平变化（*p<0.05，**p<0.01）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，通过皮下注射氢溴酸东莨菪碱建立大鼠干眼模型，探讨一种新型滴眼液对干眼的治疗效果。具体实验过程如下所述。

1.1实验动物

6周龄Wistar健康雌性大鼠36只，72眼，体重为160～180g。

1.2试剂与仪器

东莨菪碱氢溴酸盐，α-MSH，泪液分泌酚红棉线，荧光素钠注射液，PAS染色试剂盒，Fast SYBR®Green Master Mix，Trizol 试剂盒和逆转录试剂盒，7900HT Fast Real-time PCR仪，点样毛细玻璃管，光学显微镜，裂隙灯显微镜。

1.3实验方法

1.3.1干眼模型的制备及治疗

将30只大鼠编号，采用随机数字表法将其随机分为10^-5mg/ml α-MSH组：n=10；10^-4mg/ml α-MSH组：n=10；10^-3mg/ml α-MSH组：n=10。使用浓度为3mg/ml的氢溴酸东莨菪碱注射液腹部两侧交替进行皮下注射制作大鼠干眼模型，0.5ml/次，4 次/日。同时，每只大鼠右眼给予相应浓度的α-MSH滴眼液点眼治疗，50μL/次，2 次/日，其中α-MSH滴眼液是α-MSH溶于无菌的0.9%NaCl溶液，左眼以同样方法给予0.9%NaCl溶液点眼，持续28天。另选6只作为正常对照组，饲养于相同的环境中，不予任何处理。用药后0天、7天、14天、21天、28天对各组大鼠行泪液分泌试验、泪膜破裂时间BUT、角膜上皮荧光素钠染色及泪液蕨类试验分析。用药后28天，颈椎脱臼法处死大鼠，取整个眼球，石蜡切片，行HE及PAS染色，光镜下观察。并取大鼠新鲜角膜行RT-PCR，检测角膜组织中促炎因子白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的mRNA表达水平。

1.3.2泪液分泌实验

大鼠眼表不使用麻醉药物，用镊子夹持酚红棉线，将其置于大鼠下睑结膜囊中外三分之一交界处，停留30s后取出。测量酚红棉线湿润的长度并记录，读数精确到0.5mm，实验中应避免接触或划伤大鼠角膜上皮。

1.3.3泪膜破裂时间BUT测定

将1μl液态荧光素钠（10mg/ml）滴至结膜囊并闭合眼睑，裂隙灯显微镜钴蓝光下观察。协助大鼠瞬目三次，从最后一次瞬目开始计时，至角膜出现第一个黑斑的时间即为BUT。重复三次，取平均值。

1.3.4角膜上皮荧光素钠染色（fluorescein staining）及评分

大鼠结膜囊内滴入1μl液态荧光素钠（10mg/ml）90s后，在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察角膜上皮荧光素钠着色情况并评分。将角膜平均分为4个象限并分别评分，将所有分值相加即得最后分值。评分标准：无着色：0分；点状着色少于30个：1分；点状着色多于30个但不弥散：2分；严重的弥散性着色但尚未形成斑块状：3分；有斑块状着色：4分。

1.3.5泪液蕨类试验

大鼠眼部未使用表面麻醉药物，自制点样毛细玻璃管在下睑结膜囊泪阜处吸取泪液标本，尽量不接触眼表。将泪液标本涂至洁净载玻片上，25℃室温干燥10～20min后，置于光学显微镜下观察泪液蕨类图像的形态并拍照。

1.3.6眼球石蜡切片HE及PAS染色

颈椎脱臼法处死大鼠，迅速取下包括上下眼睑在内的整个眼球。4%多聚甲醛固定，常温下由低浓度至高浓度梯度酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡、包埋，平行于眼轴方向切片，厚度为3μm。石蜡切片后参照试剂操作说明分别进行HE及PAS染色。HE染色后光学显微镜下观察角膜组织病理学改变。每眼取6张不同等分位置的代表性切片进行PAS染色，以胞质染色深红者为结膜杯状细胞，分别计数并取其平均值作为该眼结膜杯状细胞数量的代表值。

1.3.7 RNA提取和RT-PCR检测

收集角膜组织，液氮中低温研磨，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。继而取250ng总RNA，DNase I处理后，以Oligo dT为引物，按试剂盒说明书行逆转录反应，制备cDNA。然后用CYBER Green real-time PCR的方法检测IL-1β和TNF-α mRNA的表达，以GAPDH为内参照。IL-1β上游引物：AGGCTTCGAGATGAACAACAAAA；下游引物：TCCATTGAGGTGGAGAGCTTTC。TNF-α上游引物：ACAAGGCTGCCCCGACTAC；下游引物：CTCCTGGTATGAAATGGCAAATC，如序列表中序列表1所示。RT-PCR扩增参数为：50℃孵育2min，95℃变性10min，然后进行40次循环：95℃变性15s，60℃退火/延伸1min；加入解离阶段：95℃变性15s，60℃退火15s，然后95℃反应15s，以判定扩增产物的特异性。扩增后，以2^{- ΔΔ Ct}法分析所得数据。即ΔCt=目的基因Ct－内参照Ct，ΔΔCt=目的基因ΔCt－参照因子ΔCt。

1.4统计学处理

采用SPSS13.0统计学软件进行数据统计分析，计量资料经Shapiro–Wilk检验呈正态分布，以均数±标准差表示；然后经Levene检验检查方差齐性。对干眼临床指标Schirmer I值、泪膜破裂时间、角膜荧光素钠染色评分、杯状细胞计数等的相关结果，满足方差齐性时,采用单因素方差分析比较各组整体差异，继而用Tukey post hoc进行组间两两比较；方差不齐时，采用Dunnet t检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。

结果如下所示:

2.1泪液分泌量的变化

用药后第0天，方差分析显示五组的泪液分泌量差异无统计学意义。用药第7天，方差分析示各组间差异有统计学意义（F=14.771，P=0.000）。其中各处理组与正常对照组相比，差异均有统计学意义（均为P=0.0000）。用药第14天，方差分析示各组间差异有统计学意义（F=11.219，P=0.000）。其中除10^-4mg/ml α-MSH治疗组与正常对照组相比较差异无统计学意义外（P=0.355），其余均有统计学意义（均P<0.05）。10^-4mg/ml α-MSH组、10^-3mg/mlα-MSH组分别与0.9%NaCl处理组比较，差异有统计学意义（P分别为0.023和0.046），其余各组两两比较差异均无统计学意义。用药第21天，方差分析示各组间差异有统计学意义（F=8.951，P=0.000），其中除正常对照组与四处理组两两比较差异均有统计学意义外（P=0.000），余均无统计学意义。用药第28天，方差分析示五组间差异有统计学意义（F=6.002，P=0.001），除10^-5mg/ml α-MSH组与0.9%NaCl组差异无统计学意义外（P=0.142），其余均有统计学意义。上述结果提示使用含有α-MSH的滴眼液时，大鼠泪液分泌量明显增加，如图1A所示。

2.2泪膜破裂时间

BUT越小表示泪膜稳定性越差。用药后第0天，方差分析结果显示10^-5mg/ml α-MSH组、10^-4mg/ml α-MSH组、10^-3mg/ml α-MSH组、0.9%NaCl组和正常对照组五组的BUT差异无统计学意义。用药第7天，方差分析示五组间差异有统计学意义（F=2.522，P=0.048）。其中0.9%NaCl处理组与正常对照组及10^-4mg/ml α-MSH治疗组之间差异有统计学意义（P=0.013，P=0.021），余均无统计学意义。用药第14天，方差分析示各组间差异有统计学意义（F=43.904，P=0.000）。其中除了0.9%NaCl处理组与10^-5mg/ml α-MSH治疗组之间差异无统计学意义外（P=0.146），其余各组两两比较差异均有统计学意义。用药第21天，方差分析示各组间差异有统计学意义（F=35.235，P=0.000）。其中正常对照组与四处理组两两比较差异均有统计学意义（P=0.000），0.9%NaCl处理组与10^-5mg/ml α-MSH治疗组、10^-4mg/ml α-MSH治疗组及10^-3mg/ml α-MSH治疗组之间差异有统计学意义（P分别为0.049，0.026，0.015），余均无统计学意义。用药第28天，方差分析示各组间差异有统计学意义（F=31.087，P=0.000）。10^-5mg/ml α-MSH治疗组与0.9%NaCl处理组相比（P=0.239），以及10^-4mg/ml α-MSH组与10^-3mg/ml α-MSH组相比，差异无统计学意义（P=0.553）外，其余两两比较差异均有统计学意义。上述结果提示经含有α-MSH 的滴眼液治疗，干眼大鼠的BUT较未治疗组显著延长，且最适浓度为10^-4mg/ml，如图1B所示。

2.3角膜荧光素钠染色

正常对照组大鼠角膜荧光素钠染色基本无着色或着色不明显，裂隙灯显微镜下观察角膜透明，上皮完整。0.9%NaCl溶液处理组大鼠角膜可见明显的密集点状着色，偶见角膜上皮小片状着染。给予α-MSH滴眼液点眼治疗组大鼠的角膜荧光素钠着色较0.9%NaCl治疗组明显减轻，且随α-MSH滴眼液浓度增高效果更明显，10^-4mg/ml α-MSH组、10^-3mg/ml α-MSH组大鼠的角膜状况良好，基本接近正常对照组（图2A-E）。第0天，方差分析示五组的荧光素钠染色评分差异无统计学意义。用药第7天，方差分析示五组间差异有统计学意义（F=25.842，P=0.000），其中0.9%NaCl处理组的角膜上皮荧光素钠染色评分明显增高，与其余各组比较差异均有统计学意义（均为P=0.000）。用药第14天，方差分析示五组间差异有统计学意义（F=26.076，P=0.000），其中0.9%NaCl组的角膜荧光素钠染色评分进一步增高，与其余各组比较差异均有统计学意义（均为P=0.000)。用药第21天，方差分析示五组间差异有统计学意义（F=50.983，P=0.000），0.9%NaCl组的角膜荧光素钠染色评分增高，与其余各组比较差异均有统计学意义（P=0.000）。用药第28天，方差分析显示五组间差异有统计学意义（F=37.025，P=0.000），0.9%NaCl组的角膜荧光素钠染色评分进一步增高，与其余各组比较差异均有统计学意义（均为P=0.000）。上述结果提示使用含有α-MSH的滴眼液可以显著减轻干眼的角膜上皮损伤，如图1C所示。

2.4角膜HE染色

0.9%NaCl溶液处理组大鼠角膜上皮细胞出现增生，较正常组明显增厚，细胞层数增加至10-12层，基底细胞层水肿、排列紊乱，角膜表面欠光滑。而给予α-MSH滴眼液点眼治疗组的大鼠角膜HE染色较0.9%NaCl溶液处理组明显好转，基本接近正常（图2F-J）。

2.5泪液蕨类实验

第0天，光学显微镜下观察五组大鼠的泪液蕨类结晶图像可见形态良好的蕨类物。自第7天起，0.9%NaCl溶液处理组大鼠泪液结晶中的蕨类物逐渐减少，蕨类物之间的连接中断、分支减少。而在同一时点，α-MSH滴眼液治疗组的蕨类物形态保持良好（图3）。

2.6结膜组织的PAS染色和杯状细胞计数

如图4，5所示，PAS染色可见0.9%NaCl溶液处理组大鼠的结膜穹窿部上皮细胞排列紊乱，出现缺失，杯状细胞形态不一致，数量减少；而α-MSH滴眼液治疗组大鼠的结膜杯状细胞数量增加，且基本呈剂量依赖性。杯状细胞计数显示，第28天时10^-5mg/ml α-MSH组、10^-4mg/ml α-MSH组、10^-3mg/ml α-MSH、0.9%NaCl溶液处理组和正常对照组的杯状细胞计数分别为（91.33±7.45）个、（168.83±54.98）个、（142.17±63.99）个、（69.50±9.75）个、（129.50±16.24），五组间差异有统计学意义（F=6.311，P=0.001）。除了10^-4mg/ml α-MSH 组，10^-3mg/ml α-MSH与正常对照组无差异外，其余两两比较差异均有统计学意义。

2.7 RT-PCR正常大鼠角膜中促炎因子IL-1β mRNA、TNF-α mRNA仅少量表达。0.9%NaCl溶液处理组大鼠角膜组织中IL-1β、TNF-α的mRNA表达较正常对照组显著升高；α-MSH治疗组大鼠角膜中的IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的表达水平随α-MSH的浓度增高呈剂量依赖性地降低，其中10^-4和10^-3mg/ml α-MSH组IL-1β mRNA以及TNF-α mRNA水平显著低均于0.9%NaCl溶液处理组（图6A，6B）。

泪液由水、蛋白质、脂类及代谢产物等组成，对眼表有清洁、润滑、营养和抗感染等作用。全身给予氢溴酸东莨菪碱注射液皮下注射后，大鼠的泪液量显著减少，而经含有α-MSH的滴眼液治疗后泪液分泌量较溶剂对照组有剂量依赖性地显著增加，这表明α-MSH能够促进大鼠泪液分泌。

正常眼表上皮细胞可以分泌粘蛋白，使细胞不角化，而且是保持眼表湿润的必要条件。轻度干眼时，眼表细胞改变不明显；而中重度干眼时，几乎都存在眼表细胞凋亡，这在干眼发病机制中起着重要作用，是引起干眼病情恶性循环的重要因素。本研究中对角膜上皮荧光素染色评分的分析可见，含α-MSH的滴眼液可以减轻东莨菪碱诱导的干眼大鼠角膜上皮荧光素钠着色，这提示α-MSH能够修复干眼造成的角膜上皮损伤。

随着研究的深入，人们越来越意识到炎症在干眼发病中的作用。干燥可导致炎性因子释放而损害眼表，而眼表的损害则进一步加剧干眼。IL-1β和TNF-α是较常见的促炎因子。研究发现在氢溴酸东莨菪碱诱导的干眼模型中，眼表的IL-1β和TNF-α表达明显增加。我们的研究也证实了这一点，溶剂对照组大鼠角膜中IL-1β和TNF-α mRNA的表达较正常大鼠显著增加，而应用α-MSH滴眼液点眼后，角膜中此二基因的表达水平显著降低。

泪液蕨类试验是评估泪液中电解质的浓度和黏蛋白含量的敏感指标。显微摄像观察泪液蕨类结晶发现，泪液中盐类和糖蛋白、黏蛋白的比例是决定泪液蕨类图形特点的关键因素。本研究发现α-MSH治疗组较0.9%NaCl溶液处理组的蕨类样物形态保持良好，间接反映α-MSH可能改善东莨菪碱诱导的大鼠干眼模型眼表的渗透压和泪液组分。

泪膜的主要部分是由杯状细胞分泌的黏蛋白与泪腺分泌的浆液层形成的凝胶，这种混合粘性液体可紧密依附在角膜上皮表面，使泪膜均匀而稳定。如果粘蛋白层缺乏或成分改变，即使泪液分泌量正常，泪膜也不能保持稳定。干眼引起的炎症和泪液渗透压的增高可能造成结膜杯状细胞数量减少，引起泪液中粘蛋白分泌不足，造成泪膜不稳定，进一步加剧干眼的恶化。另外，干眼继续恶化可导致结膜上皮细胞鳞状化生，从而进一步加重杯状细胞的损害和粘蛋白的减少，造成干眼病变的恶性循环。我们的实验结果也证实东莨菪碱诱导的干眼模型可以引起泪膜不稳定和杯状细胞的丢失。本研究对结膜杯状细胞计数结果分析显示，α-MSH治疗组的结膜杯状细胞计数显著增加、泪膜破裂时间显著延长，表明α-MSH对结膜杯状细胞有一定的保护作用，从而维持泪膜的稳定性。

总之，局部应用α-MSH滴眼液且其质量浓度为10^-4-10^-3mg/ml能够促进大鼠泪液分泌，延长泪膜破裂时间，增加泪膜稳定性，促进角膜上皮损伤修复及杯状细胞增生，减轻眼表炎症反应，有利于缓解干眼的病理改变,可以作为临床治疗干眼的新型药物。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同条件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

用CYBER Green real-time PCR的方法检测IL-1β和TNF-αmRNA的表达，以GAPDH为内参照。

IL-1β上游引物：AGGCTTCGAGATGAACAACAAAA

下游引物：TCCATTGAGGTGGAGAGCTTTC

TNF-α上游引物：ACAAGGCTGCCCCGACTAC

下游引物：CTCCTGGTATGAAATGGCAAATC

Claims (2)

1.一种新型滴眼液对治疗干眼的用途，其特征在于，所述新型滴眼液是含有α-MSH的滴眼液，α-MSH的质量浓度为10^-4-10^-3mg/ml，用于治疗干眼。

2.根据权利要求1所述的新型滴眼液对治疗干眼的用途，其特征在于，所述新型滴眼液中α-MSH的质量浓度为10^-4mg/ml。