CN104411819B - 用于过继细胞疗法的改进的细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
在同种异体过继细胞治疗背景中制备和使用新的治疗用细胞(称为T载体)具有广泛治疗益处并且GVHD的风险极低或没有。由被改变成具有以下治疗特性的供体T细胞来制备T载体:即不包含其天然抗原受体，并且可递送与其天然抗原特异性无关的治疗益处。T载体的天然抗原特异性可高度受限，使其不能识别在正常细胞上存在的抗原，也不能引发GVHD，使得T载体成为在体内递送多种治疗特性的理想载体。T载体的制备和使用这一范式转变在本质上以先前未构想过的与供体和受者之间是否存在HLA匹配无关的方式打开了T细胞的治疗应用之门。
Description
相关申请
本申请是于2010年12月8日提交的题为“IMPROVED METHODS OF CELL CULTUREFOR ADOPTIVE CELL THERAPY”的美国专利No.12/963,597(在下文中称为“母案”)的部分继续申请，其要求于2009年12月8日提交的题为“IMPROVED METHODS OF CELL CULTURE FORADOPTIVE CELL THERAPY”的美国临时申请No.61/267,761的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及培养细胞的方法，更具体地涉及培养用于细胞疗法的细胞。本发明还涉及制备具有用于过继细胞疗法(Adoptive Cell Therapy)的治疗特性的T细胞。
背景技术
细胞培养是细胞疗法的成本和复杂性的主要因素。就目前的方法而言，培养细胞的工艺既耗时成本又高。通常，为了制备出大量的细胞而采用分阶段进行的体外培养工艺。在最初的阶段，目标细胞是被置于细胞培养装置内的细胞组合物中的相对较小的群体。在此阶段，细胞组合物通常包括：目标细胞的来源(例如外周血单核细胞)、刺激目标细胞的生长和/或呈递抗原的饲养细胞。允许培养基(其中放置细胞)通常处于不受干扰状态的培养装置及方法是有利的，因为这些细胞保持为相对未受干扰的状态。这样的装置包括：标准组织培养板、培养瓶、和培养袋。在各阶段中进行的培养通常是由以下步骤组成：允许细胞组合物消耗培养基中的生长基质(如葡萄糖)、去除用过的培养基、用新鲜培养基更换用过的培养基以及重复该过程直到获得期望数量的目标细胞。常常是，当目标细胞群增加而需要额外的生长表面时，将细胞组合物转移到其它装置中以开始制备的新阶段。然而，就常规方法而言，当生长表面上的细胞群增加时，目标细胞群的生长速率减慢。最终结果是制备相当数量的目标细胞群既很耗时又复杂。
用于产生具有针对Epstein Barr病毒之抗原特异性的T淋巴细胞(EBV-CTL)的现有制备方法提供了制备复杂性的一个实例。在使EBV-CTL实现最佳扩增的常规方法使用标准24孔组织培养板，各孔具有2cm2的放置细胞的表面积，并且由于气体传输需求而将培养基体积限制在1ml/cm2。通过在经辐照抗原呈递细胞系(可以是淋巴母细胞系(LCL)，以约40∶1的表面密度(即细胞/cm2生长表面)比的约1×106个PBMC/cm2与2.5×104个经辐照抗原呈递细胞/cm2)存在下放入含PBMC(外周血单核细胞)的细胞组合物以开始培养过程。这促使细胞组合物中的EBV-CTL群在数量上扩增。9天后，在经辐照抗原呈递LCL存在下，以4∶1的新表面密度比、在大约2.5×105个EBV-CTL/cm2的最小表面密度下，EBV-CTL再次选择性地扩增。将培养基体积限制在生长表面积的最大比为1ml/cm2以使氧气能够到达细胞，这对生长溶质(例如葡萄糖)产生了限制。结果，可以达到的最大表面密度为约2×106个EBV-CTL-cm2。因此，最大每周细胞扩增约为8倍(即2×106个EBV-CTL/cm2除以2.5×105个EBV-CTL-cm2)或以下。EBV-CTL的继续扩增要求每周将EBV-CTL转移到另外的24孔板中且进行抗原再刺激，并且每周更换两次24孔板中各孔内的培养基和生长因子。因为在常规方法中随着EBV-CTL表面密度达到各孔的可能最大量，导致EBV-CTL群的扩增速率减慢，所以必须在较长的制备期(经常长达4-8周)内重复这些操作，以获得充足数量的EBV-CTL以用于细胞输注和质控测量(例如无菌、鉴别和效力测定)。
EBV-CTL的培养仅是细胞疗法所固有的复杂细胞制备工艺的一个实例。需要一种可以缩短制备时间同时降低制备成本和复杂度的更实用的用于细胞疗法的细胞培养方法。
我们已创建了提高整个制备中的群体生长速率的新方法，由此减小制备细胞的复杂性和所需时间。
在过继细胞疗法中，具有天然抗原特异性的T细胞(即，针对特定肽的T细胞，所述特定肽源自在特定人白细胞抗原(HLA)等位基因环境下呈递的特定靶抗原)已被施用于自体及部分HLA匹配的情况以治疗病毒感染和靶肿瘤。在所有这些情况下，治疗益处源于如下事实：(i)天然T细胞受体识别目的抗原；(ii)T细胞被施用于表达呈递靶肽所需的HLA等位基因的受者。
在同种异体造血干细胞移植(HSCT)的情况中，第一过继T细胞转移方案基于这样的前提：供体外周血所含的T细胞能够在HSCT受者中介导抗肿瘤和/或抗病毒活性。因此，供体淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusions，DLI)已被广泛用于提供抗肿瘤免疫力和在较低程度上的抗病毒免疫力。DLI应包含对肿瘤及广泛范围的病毒具有特异性的记忆T细胞，然而，虽然该疗法可成功用于治疗一定比例的腺病毒和EBV感染，但其效力受到对许多常见急性病毒(例如，轮状病毒(RSV)和副流感病毒)具有特异性之T细胞的低出现率及同种异体反应性T细胞的较高出现率的限制。同种异体反应性T细胞与病毒特异性T细胞之高比率在单倍同一性(haploidentical)移植受者中尤其会造成问题，在所述单倍同一性移植受体中移植物抗宿主疾病(GVHD)的较高发病率限制了DLI的可耐受剂量，从而严重地限制了所接受的病毒特异性T细胞的剂量。
为了保留DLI的益处并提高其安全性，已对选择性失活或去除受者特异性同种异体反应性T细胞的策略作出了评估，包括诱发无变应性、选择性同种异体排除(allodepletion)以最小化施用于受者的同种异体反应性T细胞的数目以及利用自杀基因来进行脱靶的同种异体反应性T细胞的体内破坏。
HSCT之后用于预防和治疗特定病毒感染的替代策略是具有抗病毒活性之离体扩增T细胞的过继转移。病毒反应性T细胞之特异性扩增具有如下优点：增加可被输注的病毒特异性T细胞的数目而不增加同种异体反应性T细胞。针对特定抗原具有反应性之富集抗原特异性T细胞的输注潜在地提高治疗效力同时降低不期望的脱靶效应(例如，GVHD)，并且已证实，该治疗手段对于治疗血液恶性肿瘤和实体瘤(例如，黑素瘤)及EBV相关恶性肿瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌)安全且有效。
需要注意的是，所有疗法都需要利用天然T细胞受体在主要组织相容性复合物(MHC)分子的环境中通过天然T细胞受体(TCR)识别抗原的特异性。因此，所述治疗益处本身依赖于使用/施用HLA匹配的或部分匹配的T细胞。例如，为了靶向黑素瘤细胞，可以扩增来自供体的表达针对GP100(在癌细胞上表达的肿瘤相关抗原)之HLA单体型(a)的针对黑素瘤的抗原特异性T细胞。在此情形下，治疗益处通过天然(native or natural)T细胞受体与靶抗原之间的特异性相互作用来介导。然而，该相互作用仅能在存在相容性HLA的情况下(即，在自体情况下或者同样表达HLA的另一个体的情况下)发生。该方法仅能被扩展用于通过产生含具有不同HLA单体型之细胞系的细胞库并且在患者匹配最合适T细胞系的情况下来治疗多位患者。
总之，在目前所应用的所有过继细胞疗法中，T细胞用于其治疗目的的治疗特性是供体T细胞的天然抗原特异性。该特性要求供体与受者之间至少部分HLA匹配，而且在同种异体的情况下产生潜在的脱靶效果，例如GVHD。另一些人提出通过对T细胞进行复杂的遗传改造和再造使其携带嵌合抗原受体来一起消除供体T细胞抗原受体，从而消除T细胞的全部先天识别能力。然而，这使制备T细胞的方法进一步复杂化，这已经是过继细胞疗法的一个主要问题。
需要能够克服现有复杂度的用于过继细胞疗法的全新方法，从而允许更广泛地用于主流社会。我们公开了一个新的范例，其允许供体T细胞的抗原特异的特异性保持完整(intact)，但将供体T细胞改变成具有以下治疗特性：即使供体T细胞的天然抗原特异性与其治疗用途无关。本质上讲，该范例转变在以之前未构想过的与供体和受者之间是否存在HLA匹配无关的方式打开了T细胞的治疗应用之门。
发明内容
已发现，与目前可能的方法相比，通过采用允许在整个制备工艺中定期地再建立非常规条件的分阶段制备工艺，可以在更短的时间段内以更经济的方式进行用于细胞疗法的细胞制备。所述非常规条件包括：降低的目标细胞的表面密度(即，细胞个数/cm2)、目标细胞与抗原呈递细胞和/或饲养细胞的新比率、和/或以增加的培养基体积与表面积之比率使用由透气性材料构成的生长表面。
本发明的实施方案涉及用于细胞疗法应用的改进细胞培养方法。其包括如下方法：通过采用使目标细胞群能够相对于常规方法在整个制备工艺中维持更高生长速率的各种新方法，来降低产生期望数量的目标细胞所需的时间、成本和复杂性。
本发明的一个方面依赖于：分阶段进行培养工艺并且在一个或更多个阶段开始时建立使目标细胞群的生长速率能够超过目前可能的生长速率的条件。在培养的至少一个阶段，优选在几乎所有的阶段，建立初始条件，所述初始条件包括：以非常规的低表面密度且以非常规的抗原呈递细胞(和/或饲养细胞)/目标细胞的比率将目标细胞置于非透气性或透气性生长表面上。通过应用本发明此方面的新实施方案，目标细胞群可以在比常规方法所允许的更短时间段内经历更多次倍增，从而缩短制备期。
本发明的另一方面依赖于：分阶段进行培养工艺并且在一个或更多个阶段开始时建立使目标细胞群的生长速率能够超过目前可能的生长速率的条件。在培养的至少一个阶段，优选在几乎所有的阶段，建立条件，所述条件包括：以非常规的高培养基体积与生长表面积之比率，将目标细胞置于透气性材料构成的生长表面上。通过应用本发明此方面的新实施方案，目标细胞群可以在比常规方法所允许的更短时间段内经历更多次倍增，从而缩短制备期。
本发明的另一个方面依赖于：分阶段进行培养工艺并且建立各阶段的条件，使得目标细胞群的生长速率超过目前可能的生长速率。在培养的至少一个阶段，优选在几乎所有阶段，建立初始条件，所述初始条件包括：以非常规的低表面密度(即，细胞个数/cm2)、以非常规的抗原呈递细胞(和/或饲养细胞)/目标细胞的比率、且在非常规的高培养基体积与生长表面积之比率的存在下，将目标细胞置于透气性材料构成的生长表面上。通过应用本发明此方面的新实施方案，目标细胞群可以在比常规方法所允许的更短时间段内经历更多次倍增，从而缩短制备期。
在本发明的一些实施方案中，产生了具有治疗特性的同种异体T载体(T-Vehicle)，其具有使受者获益但不会致使受者遭受移植物抗宿主疾病(GVHD)的治疗目的。
在本发明的一个实施方案中，通过获得T载体来进行治疗性治疗，所述T载体通过包括以下步骤的方法来产生：用抗原刺激供体PBMC或供体脐带血以激活对该抗原具有天然抗原特异性之T细胞的生长。由此制备出抗原特异性T细胞群，其由对抗原(被用来刺激T细胞群生长)具有抗原特异性的天然抗原受体组成。将该抗原特异性T细胞群改变成具有至少一种治疗特性，其不包括天然抗原受体并且具有与天然抗原受体的抗原特异性无关的治疗目的，从而产生出T载体群。然后，将所述T载体递送给能够从所述T载体获益的受者，无论受者的细胞是否呈递T载体的天然抗原受体所识别的抗原，和/或其中受者的细胞不呈递T载体的天然抗原受体所识别的抗原。
在本发明的另一个实施方案中，通过获得T载体来进行治疗性治疗，所述T载体通过包括以下步骤的方法来产生：用抗原刺激供体PBMC或供体脐带血以激活对抗原具有天然抗原特异性之T细胞的生长。由此制备出抗原特异性T细胞群，其由对抗原(被用来刺激T细胞群生长)具有抗原特异性的天然抗原受体组成。将该抗原特异性T细胞群改变成具有至少一种治疗特性，其不包括天然抗原受体并且具有与天然抗原受体的抗原特异性无关的治疗目的，从而产生T载体群。然后，将T载体递送给能够从所述T载体获益并且与T载体不具有HLA匹配的受者。
在本发明的多个实施方案中，将T载体改变成加载有佐剂施用的重组蛋白用于免疫疗法，改变成具有化学治疗剂的治疗特性用于靶向治疗癌症，改变成具有抗微生物剂的治疗特性，改变成具有表达赋予细胞肿瘤特异性之转基因分子的治疗特性，改变成具有加载有或改造为具有重组蛋白用于治疗自身免疫疾病的治疗特性，改变成表达自杀基因，和/或改变成具有加载有和/改造为体内成像的治疗特性。
在本发明的另一实施方案中，通过以下步骤来实现制备具有期望的抗原识别之抗原特异性T细胞的方法：将PBMC或脐带血置于细胞培养装置中，向细胞培养装置中添加多于一种抗原，以激活多于一个抗原特异性T细胞群的生长，每一个群体能够识别抗原的一种，允许一段时间使抗原特异性T细胞来起始群体扩增，评估培养物以确定存在至少一个抗原特异性T细胞群和/或其量，确定哪个T细胞群适于继续增殖，并仅用合适的T细胞群所识别的抗原再次刺激培养物。
在本发明的另一实施方案中，通过以下步骤来实现制备具有期望的抗原识别之抗原特异性T细胞的方法：将PBMC或脐带血置于细胞培养装置中，在开始时向细胞培养装置中添加多于一种抗原，以激活多于一个抗原特异性T细胞群的生长，每一个群能够识别一种抗原，允许一段时间使抗原特异性T细胞起始群体扩增，将培养物分到多于一个装置中，向每个装置中仅添加一种初始抗原，确定哪个装置含有适于继续增殖的抗原特异性T细胞群，并终止不含适于继续增殖的抗原特异性T细胞群的装置中的培养。
在本发明的多个实施方案中，将供体T细胞制备成具有仅允许其识别不在正常人细胞上存在也不在正常哺乳动物细胞上存在的抗原之单一表位的天然抗原特异性。
附图说明
考虑以下对本发明多个实施方案的详细描述并结合附图可更全面地理解本发明，在附图中：
图1A示出了实施例1中的抗原特异性T细胞群在最初7天内的初始刺激后经历至少7次细胞倍增。
图1B示出了通过针对实施例1的四聚体分析所确定的证明细胞组合物内的T细胞群随时间扩增幅度的数据。
图1C示出了实施例1中在23天期间抗原特异性T细胞群生长速率减小。
图2示出一表格，其说明了实施例1中的抗原特异性T细胞的潜在(potential)扩增与观察到的扩增倍数之间的差异。
图3A示出了实施例2中在刺激后抗原特异性T细胞的存在。
图3B示出了实施例2中当表面密度从1×106/cm2减小到3.1×104/cm2同时维持4∶1的抗原特异性T细胞与抗原呈递细胞的比率时抗原特异性T细胞群的扩增。
图3C示出了实施例2中当表面密度从1×106/cm2减小到3.1×104/cm2同时在固定数量抗原呈递细胞存在下抗原特异性T细胞群的扩增。
图4示出了当继续图3中所描述的工作时所获得结果的一个实例，该实例进一步证明当目标细胞需要其它细胞的支持时，只要给目标细胞提供充分的饲养细胞和/或抗原呈递细胞，那么非常规的低目标细胞表面密度也能够起始群扩增。
图5示出了通过以三种不同细胞表面密度(CTL/cm2)期起始培养来证明重复目标细胞群扩增幅度之能力的直方图。
图6示出了用于生成数据的透气性测试装置的截面图。
图7A示出了与在实施例5中所进行的常规方法相比较的根据本发明制备的抗原特异性T细胞的生长曲线。
图7B示出了对于实施例5，根据本发明制备的抗原特异性T细胞的细胞存活率显著高于常规方法，如利用流式细胞术的前向散射与侧向散射分析所测定的。
图7C示出了对于实施例5，根据本发明所制备的抗原特异性t细胞的细胞存活率显著高于常规方法，如利用膜联蛋白-PI(Annexin-PI)7AAD所测定的。
图7D示出了对于实施例5，本发明的新方法中所制备细胞的优越生长显示出与利用常规方法培养的细胞相同的细胞特异性生长速率，如由CFSE标记细胞的每日流式细胞术分析所确定的，从而确定细胞扩增速率增加是由细胞死亡降低所导致的。
图8A示出了在无需更换培养基的情况下EVB-CTL如何能达到超过常规方法中可能达到的扩增。
图8B示出了实施例6的培养条件如何不改变最终细胞产物，如利用针对EBER的Q-PCR所评估的。
图8C示出了实施例6的培养条件如何不改变最终细胞产物，如利用针对B细胞标志物CD20的Q-PCR所评估的。
图9示出了一个说明性实例，其中我们通过实验证明了目标细胞和抗原呈递细胞的非常低的累积表面密度(在此情况下，AL-CTL与LCL细胞合并产生具有30,000个细胞/cm2表面密度的细胞组合物)不能起始AL-CTL群的生长。
图10A呈现了实施例8的数据，这些数据显示在23天期间内培养细胞的两种新方法如何比常规方法制备出更多的细胞。
图10B示出了实施例8中在测试装置中培养的细胞照片。
图10C示出了在实施例8中，两种新培养方法和常规方法都制备出具有相同表现型的细胞。
图10D示出了对于实施例8，在其中用来自EBV的LMP1、LMP2、BZLF1和EBNA1的EBV肽表位刺激T细胞并用HLA-A2-LMP2肽五聚体染色法进行染色的代表性培养显示了相似频率的肽特异性T细胞。
图10E示出了对于实施例8的新方法和常规方法，细胞维持其溶细胞活性和特异性且以对HLA不匹配EBV-LCL的低杀伤率杀伤自体EBV-LCL，如利用51Cr释放测定所评估的。
图11示出了利用本发明一个方面的目标细胞类型的群扩增与在常规情况下目标细胞群在生长表面上扩增相比较的图示。
图12示出了可以通过采用由透气性材料构成的生长表面以及超过1或2ml-cm2的非常规高培养基体积与生长表面积的比率所获得优点的一个实例。
图13示出了常规情况下目标细胞群在生长表面上的扩增与在本发明一个实施方案下目标细胞类型的群扩增相比较的新方法图示，在本发明实施方案结束时的细胞表面密度远大于常规表面密度。
图14示出了制备细胞的另一种新方法，该新方法还提供了优于常规方法的进一步的优点。
图15示出了对图14中所描述的各制备方法的比较，以证实新方法的功效以及为何在各种阶段调整制备方案可用于获得充分效率的原因。
图16示出了随着制备进行，人们可如何调整新方法中的制备方案而获得效率的一个实例。
图17示出了测试结果，证实T载体不能识别来自不匹配同种异体供体的细胞。
图18示出了测试结果，表明供体T细胞可以被改变以产生具有CD34A-IL7细胞因子表达的治疗特性的T载体，如利用流式分析所确定的。
图19A示出了测试结果，表明IL7细胞因子的全身性递送导致在小鼠的肾中检测到比其肿瘤部位更多的细胞因子。
图19B示出了测试结果，表明IL7细胞因子的T载体递送导致在小鼠肿瘤部位比其他器官更高的细胞因子浓度，并且示出了在施用T载体后，在肿瘤处细胞因子的产生如何持续了至少两周。
图20示出了测试结果，表明供体T细胞可以被改变以产生具有CAR-PSCA之治疗特性的T载体，如利用流式分析所确定的。
图21示出了测试结果，表明具有CAR-PSCA之治疗特性的T载体能够根除肿瘤细胞。
图22A示出了具有能够结合IL4之受体的T载体邻近表达IL4细胞因子之肿瘤细胞。
图22B示出了T载体可如何结合IL4细胞因子，以及保护肿瘤细胞之IL4细胞因子的量可如何被大大减少。
图23示出了测试结果，证实具有表达胞外重组细胞因子受体IL4R/7之治疗特性的T载体能够消耗IL4细胞因子。
图24A示出了加载有化学治疗剂的T载体将如何向炎症部位迁移。
图24B示出了受者免疫系统将如何靶向位于肿瘤细胞部位的T载体。
图24C示出了在受到受者免疫系统攻击时，T载体将如何在肿瘤细胞部位释放其载荷，所述载荷在此情况下为化学治疗剂。
具体实施方式
定义
抗原呈递细胞(APC)：起触发目标细胞对特定抗原产生应答之作用的细胞。
CTL：细胞毒T细胞
目标细胞：特定类型的细胞，制备工艺目的是使其在数量上扩增。一般来说，目标细胞是非贴壁(non-adherent)细胞，其实例包括：调节性T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、原代T淋巴细胞以及广泛种类的抗原特异性细胞等等(所有细胞还可以进行遗传修饰，以改善其功能、体内持久性或安全性)。可以利用饲养细胞和/或抗原呈递细胞对临床用途所需的细胞进行扩增，所述饲养细胞和/或抗原呈递细胞可以包括：PBMC、PHA母细胞、OKT3T、B母细胞、LCL和K562、(天然的或者通过遗传修饰来表达的和抗原和/或表位以及共刺激分子例如41BBL、OX40、CD80、CD86、HLA以及其他许多种)，可以用或者可以不用肽或其它相关抗原对这些细胞进行脉冲。
EBV：Epstein Barr病毒
EBV-CTL：一种T细胞，其通过T细胞表面受体特异性识别受EBV感染细胞、或者表达或呈递来源于EBV的肽的细胞。
EBV-LCL：经Epstein Barr病毒转化的B淋巴母细胞系。
饲养细胞：作用以导致目标细胞数量扩增的细胞。在某些情况下，抗原呈递细胞也可以用作饲养细胞。
生长表面：培养装置内细胞放置的区域。
PBMC(外周血单核细胞)：从外周血获得的外周血单核细胞，所述外周血是一些目标细胞的来源并且可以充当饲养细胞。
应答细胞(R)：将对刺激细胞产生应答的细胞。
静置细胞培养：一种在培养基中培养细胞的方法；即，除了在将培养装置进行位置移动以进行常规处理和/或定期给细胞添加新鲜培养基等情况以外，不进行搅拌或混合。一般来说，静置培养中的培养基通常处于静止状态。本发明涉及的是静置细胞培养方法。
受刺激的：抗原呈递细胞和/或饲养细胞对目标细胞的作用。
刺激细胞(Stimulator(S))：将影响应答细胞的细胞。
表面密度：装置内细胞置于其上的表面的每单位面积的细胞数量。
为试图找到简化用于过继T细胞疗法之目标细胞群的制备的新方法，进行了一系列实验，从而打开了用于细胞疗法应用的细胞的更高效培养之门。对本发明的许多说明性实例及各个方面进行了描述，用以表明如何获得相对于常规方法缩短制备时间并降低复杂性的能力。
实施例1：对常规方法的限制的证明。
此实施例的数据证明了在采用每孔2ml培养基体积(即，培养基高度为1.0cm，培养基体积与表面积的比率为1ml/cm2)的标准24孔组织培养板(即每孔的表面积为2cm2)中制备EBV-CTL的常规培养方法的限制。
培养的第1阶段，第0天：通过用经γ射线辐照(40Gy)的抗原呈递性自体EBV-LCL，以40∶1的(PBMC∶LCL)比率以及1ml/cm2的培养基体积与生长表面的比率，对来自正常供体PBMC的细胞组合物(约1×106个细胞/ml)进行培养而起始EBV-CTL群的扩增，由此，在用45％Click培养基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)、2mM GlutaMAX-I、和10％FBS补充的RPMI 1640中建立约为1×106个细胞/cm2的细胞组合物表面密度。
培养的第2阶段，第9-16天：于第9天，从第一阶段产生的细胞组合物中收获EBV-CTL，将它们以0.5×106个EBV-CTL/cm2的表面密度重悬于新鲜培养基中，并用经辐照的自体EBV-LCL以4∶1的CTL∶LCL比率(表面密度0.5×106个CTL/cm2：1.25×105个LCL/cm2)进行再刺激。于第13天，将24孔板各孔中的2ml培养基体积中的1ml去除，用1ml含重组人IL-2(50U/mL)(Proleukin；Chiron，Emeryville，CA)的新鲜培养基加以更换。
培养的第3阶段，第17-23天：重复第2阶段的条件其中每周添加两次IL-2，于第23天终止培养。尽管终止了培养，但也可以用类似(mimick)第2阶段和第3阶段的其它培养阶段继续进行培养。
在细胞毒测定中用作靶细胞的细胞系和肿瘤细胞：BJAB(一种B细胞淋巴瘤)和K562(一种慢性红系白血病(chronic erythroid leukemia))是从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，美国)获得的。将所有的细胞培养于具有含10％热灭活胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、25IU/mL青霉素、和25mg/mL链霉素(全部获自BioWhittaker，Walkersville，MD)的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)的培养物中。在含5％CO2的加湿空气中于37℃培养细胞。
免疫表型分型：
细胞表面：用藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素(periodin)叶绿素蛋白质(PerCP)以及针对CD3、CD4、CD8、CD56、CD16、CD62L、CD45RO、CD45RA、CD27、CD28、CD25、CD44的别藻蓝蛋白(APC)缀合的单克隆抗体(MAb)(获自Becton-Dickinson(MountainView，CA，美国))对细胞进行染色。利用PE缀合的四聚体(Baylor College of Medicine)和APC缀合的五聚体(Proimmune Ltd，英国牛津)对EBV-CTL前体频率进行定量。在FACSCalibur流式细胞仪上分别获得针对细胞表面和五聚体染色的10,000和100,000个实时事件(live event)并利用Cell Quest软件(Becton Dickinson)进行数据分析。
用于测量细胞分裂的CFSE标记：为了评估倍增率，将2×107个PBMC或EBV特异性CTL(EBV-CTL)清洗两次，并将其重悬于850μl含0.1％胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)的1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在染色前，取等分试样的羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)(10mM于二甲亚砜中)(Celltracetm CFSE细胞增殖试剂盒(C34554)，Invitrogen)解冻，用1×PBS稀释1∶1000并将150μl稀释液添加到细胞悬浮液中(标记浓度为1μM)。于室温下用CFSE将细胞孵育10分钟。随后，将1ml FBS添加到细胞悬浮液中，接着于37℃孵育10分钟。然后，将细胞用1×PBS清洗两次，计数，用如上所述抗原进行刺激。
膜联蛋白V-7-AAD染色：为了确定我们的培养物中凋亡细胞和坏死细胞的百分率，我们按照制造商的说明书(BD Pharmingentm，#559763，San Diego，CA)进行了膜联蛋白-7-AAD染色。简言之，用冷的PBS清洗从24孔板或G-Rex中获得的EBV-CTL，将这些细胞以1×106个细胞/ml的浓度重悬于1×结合缓冲液中，于室温(RT，25℃)在暗处用膜联蛋白V-PE和7-AAD进行15分钟染色。孵育之后，立即用流式细胞术对细胞进行分析。
铬释放测定：如前所述，我们在标准的4小时51Cr释放测定中评估了EBV-CTL的细胞毒活性。我们使用自体以及I类和II类HLA不匹配的经EBV转化的淋巴母细胞系(EBV-LCL)作为目标细胞来测量MHC限制性和非限制性杀伤，并且使用K562细胞系来测量自然杀伤活性。分别利用在单独的培养基中或者在1％Triton X-100中进行孵育的铬标记目标细胞来确定自发的(spontaneous)和最大51Cr释放。按下式计算一式三份孔的特异性裂解的平均百分率：[(测试计数-自发计数)/(最大计数-自发计数)]×100。
酶联免疫斑点(ELIspot)测定：利用ELIspot分析对响应于抗原刺激而分泌IFNγ的T细胞的频率和功能进行定量。用经辐照的LCL(40Gy)或者LMP1、LMP2、BZLF1和EBNA1肽混合物(稀释到1μg/ml)(JPT Technologies GmbH，德国柏林)或者EBV肽HLA-A2GLCTLVAML＝GLC、HLA-A2CLGGLLTMV＝CLG、HLA-A2-FLYALALLL＝FLY、和HLA-A29ILLARLFLY＝ILL(Genemed Synthesis有限公司，San Antonio，Texas)对在24孔板或G-Rex中扩增的CTL细胞系进行刺激，稀释到2μM的最终浓度，将单独的CTL用作阴性对照。以1×106/ml将CTL重悬于ELIspot培养基中[用5％人血清(Valley Biomedical有限公司，Winchester，Virginia)和2mM L-谷氨酰胺(GlutaMAX-I，Invitrogen，Carlsbad，CA)补充的RPMI1640(Hycloue，Logan，UT)]。于4℃用10μg/mL抗IFN-γ抗体(Catcher-mAB91-DIK，Mabtech，Cincinnati，OH)包被96孔滤板(filtration plate，MultiScreen，#MAHAS4510，Millipore，Bedford，MA)过夜，然后清洗，于37℃用ELIspot培养基封闭1小时。将应答细胞和刺激细胞在所述板上孵育20小时，然后将板清洗并用生物素缀合的抗IFN-γ单克隆二抗(Detector-mAB(7-B6-1-生物素)，Mabtech)进行孵育，接着用亲和素：生物素化的辣根过氧化物酶复合物(Vectastain Elite ABC试剂盒(标准)，#PK6100，Vector Laboratories，Burlingame，CA)进行孵育，然后用AEC底物进行显影(Sigma，St.Louis，MO)。对于各培养条件，以一式三份进行。将各板送到纽约州纽约市的Zellnet Consulting公司进行评估。对点形成单位(SFC)和输入细胞数量进行绘图。
统计分析：以平均值±1SD表示体外数据。利用学生t检验来确定各样品间差异的统计学显著性，接受用P＜0.05来表示显著性差异。
在这些培养条件下，在起初刺激后的前7天内，抗原特异性T细胞群经历至少7次细胞倍增，如图1A中所示。因此，我们预计每周T细胞扩增128倍(如通过将细胞组合物中的抗原特异性T细胞的频率乘以细胞总数所测定的)。将第一、第二和第三次刺激后的四聚体阳性细胞的频率示于图1B。于第0天，对两个EBV四聚体(RAK和QAK)具有反应性的T细胞的频率分别为0.02％和0.01％。于第0天的单次刺激后，到第9天细胞组合物中的四聚体阳性T细胞的频率分别从0.02％和0.01％增加到2.7％和1.25％。因此，存在于细胞组合物中的抗原特异性四聚体阳性T细胞的百分率达到135倍和125倍的增加，正如用RAK和QAK所测量的。此外，在培养的第1阶段第0天的单次刺激后，到第9天观察到细胞组合物中细胞的表面密度增加到1.1倍(数据未示出)(存在大约1.1×106个细胞/cm2)。因为PBMC组合物中的大部分细胞对刺激抗原是非特异性的，所以观察到总细胞数的整体增加很少，但在培养的第一阶段期间组合物中抗原特异性细胞群的扩增倍数约为280倍，如图1C中所示。遗憾的是，尽管细胞倍增的数目在培养的第二和第三阶段期间是相同的(如由CSFE所测量)，但在培养的第二或第三阶段期间此抗原特异性T细胞的扩增速率并未持续，在第二阶段仅为5.7而在第三阶段仅为4.3。图2的表格说明抗原特异性T细胞的潜在扩增与观察到的扩增倍数之间的差异(n＝3)。
实施例1证明大致在制备的第一周后制备目标细胞所需的时间量通常被延长，因为在培养的后续阶段目标细胞群的扩增速率降低。
实施例2：在任意给定阶段或培养各阶段的开始时，可以通过降低目标细胞群的细胞表面密度来实现增加目标细胞群所需时间量的缩短。
我们假设，与第一次刺激相比，在第二次T细胞刺激后目标细胞群的扩增速率下降的原因在于导致激活引起细胞死亡(AICD)的限制性细胞培养条件。例如，参照图3A，在第一次刺激时，PBMC的EBV抗原特异性T细胞成分最多占群体的2％，并且因此抗原特异性应答性T细胞的接种密度小于2×104/cm2，剩余的PBMC充当非增殖性的饲养细胞(示出为图3A中的CFSE阳性细胞)，这些饲养细胞维持使抗原特异性CTL能够增殖的最佳的细胞-细胞接触。相反，在第9天的第二次刺激时，大部分T细胞是抗原特异性的，尽管组合物的总细胞密度是大致相同的，但增殖细胞密度则高出50到100倍。因此，在再刺激时大部分细胞增殖，因而会快速消耗并耗尽它们的营养和O2供给。
为了确定限制性培养条件是否造成次最优T细胞生长速率，我们测量了以较低细胞密度铺板的活化T细胞的扩增。方法描述于前面的实施例1中。
我们将活化的EBV特异性T细胞接种于标准24孔板的孔中，各孔具有2cm2的生长表面积，在倍增稀释时导致减小的表面密度(从1×106/cm2减小到3.1×104/cm2)同时维持4∶1的应答细胞与刺激细胞之比(R∶S)，如图3B中所示。以1.25×105/cm2的起始CTL表面密度获得最大的CTL扩增(4.7±1.1倍)，但进一步的稀释则降低扩增速率，如图3B中所示。我们推测此限制性稀释效应可能是由于缺乏细胞-细胞接触所致，因此在7天的时段内我们用固定数量的饲养细胞(以1.25×105/cm2的表面密度铺板的EBV-LCL)以从1×106到3.1×104的表面密度培养EBV-CTL的倍增稀释液并且评估细胞扩增。我们观察到CTL扩增的显著增加，从1×106/cm2的表面密度下EBV-CTL的仅2.9±0.8倍扩增一直到3.1×104/cm2的表面密度下EBV-CTL的34.7±11倍扩增，如图3C中所示。重要的是，这个培养条件的更改并未改变细胞的功能或抗原特异性(数据未示出)。因此，活化的抗原特异性T细胞群能够实现比常规培养方法所允许更大的扩增。值得注意的是，无论起始表面密度如何，刺激后获得的最大表面密度(1.7到2.5×106/cm2)是相同的。
因此，常规的培养条件是限制性的，这表明培养基体积与生长表面积的比率需要增加到超过常规的1ml/cm2从而允许目标细胞群增加到超过常规方法的表面密度限制。此外，通过在任意培养阶段的开始将目标细胞群的表面密度减小到低于常规方法，可以获得达到大约34倍的更好的抗原特异性CTL扩增。这在细胞疗法中具有显著的结果，因为在制备开始时细胞数量经常是相当有限的。例如，通过以降低的表面密度将有限数量的目标细胞分布在增加的表面积上，可以在较短的时段内获得更大的目标细胞群，因为相对于常规表面密度而言群生长速率有显著增加。
实施例3：包含目标细胞和/或抗原呈递细胞的细胞群的最小表面密度可以允许以非常低的表面密度接种的目标细胞群生长。
图4示出了当继续图3中所述的工作时我们所获得结果的一个实例，该实例进一步证明了当目标细胞需要其它细胞的支持时，只要给目标细胞提供充足的饲养细胞和/或抗原呈递细胞，非常规地低的目标细胞表面密度就可以起始群扩增。在这些实验中，我们继续证明具有在8比1的R∶S比率下的约1.0×106个目标细胞/cm2与在1比32的R∶S比率下的仅为约3900个目标细胞/cm2之间的表面密度和R∶S比率之下总细胞组合物如何使目标细胞大大扩增到超过起始表面密度的50倍，在扩增到50倍时我们停止测试。
实施例4：已证明通过以非常规地低的目标细胞表面密度的起始一个阶段、容许群体扩增、终止该阶段并重复条件而使制备工艺在各阶段重复的能力可递送可重复的结果。
我们以三个目标细胞表面密度(CTL/cm2)继续实施例3中所述的评估，如图5中所示。各特定的接种密度能够始终实现相同的扩增倍数。下面将对该影响进行更详细的描述，因为这些影响与显著缩短目标细胞群制备时间的能力有关。
实施例5：通过在由透气性材料构成的生长表面上培养目标细胞同时增大培养基体积与生长表面积的比率，在培养的给定阶段相对于常规方法增加目标细胞群可以倍增的次数并且增加可达到的表面密度。
细胞系和肿瘤细胞、免疫表型分型、CFSE标记、膜联蛋白V-7-AAD染色、铬释放测定、酶联免疫斑点(ELIspot)测定、反转录病毒制备和T淋巴细胞的转导以及统计分析描述于实施例1中。
测试装置(在下文中一般性地称为“G-Rex”)的构造如图6中所示。各G-Rex 10的底部20由透气性硅胶(silicone)膜构成，该膜的厚度约为0.005至0.007英寸。共同未决的美国专利公开US2005/0106717A1(在下文中称为Wilson‘717)是与替选的透气性材料使用相关的许多其它信息源中的一个，并且可利用该专利公开将透气性培养装置的形状、特征以及对本发明许多实施方案有利的其它有用特征告知本领域技术人员。在此实施例3中，G-Rex(称为“G-Rex40”)具有10cm2的生长表面区域，细胞组合物(显示为项30)在该生长表面上放置，细胞组合物的特征在整个实验中发生变化，如本文中所述。除非另有说明，否则培养基(显示为项40)的体积为30ml，从而形成3ml/cm2的培养基体积与生长表面积的比。
以常规的4∶1的CTL∶LCL比率将活化的EBV特异性CTL和经辐照的自体EBV-LCL在G-Rex40装置中进行培养。以5×105个细胞/cm2的表面密度将EBV-CTL接种于G-Rex40中，将EBV-CTL群体的扩增速率与以相同表面密度接种于培养基体积比生长表面积为1ml/cm2的标准24孔板中的EBV-CTL的扩增速率进行比较。3天后，如图7A中所示(p＝0.005)，在不进行任何培养基更换的情况下，G-Rex40中的EBV-CTL从5×105/cm2增加到中值为7.9×106/cm2(在5.7至8.1×106/cm2的范围内)。相反，在常规24孔板中进行3天培养的EBV-CTL仅从5×105/cm2的表面密度增加到第3天的中值为1.8×106/cm2(在1.7至2.5×106/cm2的范围内)。在G-Rex40中，可以通过补充培养基来进一步增加表面密度，而不能通过补充24孔板中的培养基或IL-2来增加细胞表面密度。例如，在第7天补充培养基和IL-2后，G-Rex40中EBV-CTL的表面密度进一步增加到9.5×106个细胞/cm2(在8.5×106至11.0×106/cm2的范围内)(数据未示出)。
为了理解G-Rex装置中优越的细胞扩增背后的机制，于培养第5天我们利用流式细胞前向散射分析和侧向散射分析评估经OKT3刺激的外周血T细胞的存活率。由于在培养物中存在会干扰分析的残留的经辐照EBV-LCL，因而在此测定中不能评估EBV-CTL。如图7B中所示，G-Rex40培养物中细胞存活率显著更高(G-Rex40中的存活率为89.2％，相对于24孔板中的存活率为49.9％)。然后，我们每天用膜联蛋白-PI 7AAD对培养物进行分析，持续7天，以区分活细胞与凋亡/坏死细胞，观察到24孔板中扩增的T细胞存活率始终低于G-Rex中的T细胞存活率，如图7C中所示。这些数据表明，增殖细胞的累积改善存活率，这是由于与24孔板相比，G-Rex装置中的细胞数增加。
为了确定相对于24孔板在G-Rex中是否还有由细胞分裂次数增加造成的结果，于第0天用CFSE对T细胞进行标记并且将T细胞分在培养基体积为40ml的G-Rex40装置中与各孔培养基体积为2ml的24孔板中。每日的流式细胞术分析证明从第1天到第3天细胞分裂次数无差异。然而，自第3天开始，G-Rex40中培养的目标细胞群以超过2ml孔的减小率的速率继续增加，表明培养条件已变成限制性的，如图7D中所示。因此，在G-Rex40测试装置中的大目标细胞群是由于相对于常规方法的细胞死亡率降低与持续增殖的联合作用所致。
实施例6：通过采用非常规地高的培养基体积与生长表面积的比率并且使用由透气性材料构成的生长表面，可以减小制备期间对饲养培养物的需求，同时获得非常规地高的目标细胞表面密度。
这通过使用用于EBV∶LCL的起始和扩增的G-Rex测试装置而得以证实。为了此实施例的目的，G-Rex2000是指如图8中所示的装置，例外是底部是由100cm2生长表面积构成并且提供2000ml培养基容量。在不改变细胞表型的情况下，将EBV-LCL在G-Rex2000中进行培养和扩增。以1×105个细胞/cm2的表面密度将EBV-LCL连同1000ml完全RPMI培养基铺板在G-Rex2000中，以形成10ml/cm2的培养基体积与表面积的比率。为了比较，以5×105个细胞/cm2的表面密度将EBV-LCL铺板在T175瓶中并加入30ml完全RPMI培养基，以形成约为0.18ml/cm2的培养基体积与表面积的比率。如图8A中所示，在无需任何操作或培养基更换的情况下，G-Rex2000中培养的EBV-LCL的扩增大于T175瓶中的扩增。此培养条件并不改变最终细胞产物，如利用针对EBER和B细胞标志物CD20的Q-PCR所评估的，如图8B和图8C中所示。
实施例7：当在培养开始时不存在充足的饲养细胞和/或抗原细胞时，目标细胞则可能不扩增。然而，可以改变细胞组合物而使其含有充当饲养细胞和/或抗原呈递细胞的其它细胞类型，从而使扩增能够进行。
图9示出了一个说明性实例，其中我们通过实验证明了目标细胞和抗原呈递细胞的非常低的累积表面密度(在此情况下，AL-CTL与LCL细胞联合形成表面密度为30,000个细胞/cm2的细胞组合物)不能引发AL-CTL群的生长。然而，通过改变组合物而使其含有充当饲养细胞的另一种细胞类型，可以使该相同细胞组合物生长。在此情况下，我们评价了在约为0.5×106个细胞/cm2的表面密度下三种不同形式的经辐照K562细胞的饲养层，在所有情况下AL-CTL群都是从直方图第一个柱中所示的初始细胞组合物开始扩增，在14天内从仅15,000个细胞/cm2的表面密度变化到4.0×106个细胞/cm2的表面密度。我们还证明了，与添加第三细胞类型不同，增加LCL的群体获得了类似的有利结果。任意地选择用于LCL或K562的高表面密度，以证明当细胞组合物含有足够数量的饲养细胞和/或抗原特异性细胞时，可以利用非常低的目标细胞群来起始生长。当饲养细胞供应短缺、昂贵、或者制备麻烦时，建议将饲养细胞的表面密度减小到低于0.5×106个细胞/cm2。一般来说且如我们已证明的，当细胞组合物中有抗原呈递细胞和/或饲养细胞时，抗原呈递细胞和/或饲养细胞以及目标细胞的增加的表面密度应当优选为至少约0.125×106个细胞/cm2，从而在细胞组合物中形成足够的表面密度以起始目标细胞群的扩增。此外，为了实现超过标准表面密度限度的继续扩增，此实施例中使用由透气性材料构成的生长表面以及4ml/cm2的培养基体积与表面积的比。
实施例8：与其它方法相比，减小的目标细胞的表面密度、改变的应答细胞与刺激细胞的比率、增加的培养基与生长表面积的比率以及定期以低表面密度培养将细胞分布在由透气性材料构成的生长表面上，这些使得在较短的时段内能够制备出更多的目标细胞并简化制备工艺。
为了进一步评价我们的简化和缩短目标细胞制备的能力，我们使用G-Rex测试装置用于EBV-CTL的起始和扩增。为了此实施例的目的，G-Rex500是指如图6中所示的装置，例外是底部是由100cm2生长表面积所构成并且提供500ml培养基容量。
对于EBV-CTL制备的起始阶段，我们将PBMC以1×106/cm2的表面密度(将总计为107个PBMC分布于10cm2G-Rex40的生长表面上)接种于G-Rex40中，并用EBV-LCL以40∶1的PBMC∶EBV-LCL比率刺激这些细胞。对于CTL制备，在维持应答性T细胞的抗原特异性的第一次刺激中此40∶1比率是优选的。在培养的起始阶段后，于第9天开始第二阶段，其中将1×107个应答性T细胞从G-Rex40转移到G-Rex500测试装置中。为了起始培养的第二阶段，将200ml的CTL培养基置于G-Rex500中，在第二阶段开始时形成2ml/cm2的培养基体积与表面积的比率、以及2.0cm的高出生长表面区域的培养基高度。在第二阶段开始时，目标细胞的表面密度为1×105个CTL/cm2且抗原呈递细胞的表面密度为5×105个LCL/cm2，由此形成非常规的1∶5的目标细胞与抗原呈递细胞的比率。在此阶段，两种细胞表面密度和R∶S比率在所有筛选的供体中均导致一致的EBV-CTL扩增。四天后(第13天)，将IL-2(最终浓度为50U/ml)以及200ml新鲜培养基直接添加到该培养物中，将培养基体积与表面积的比调整为4ml/cm2。于第16天，收集细胞并计数。所获得的CTL中值表面密度为6.5×106/cm2(在2.4×106至3.5×107的范围内)。
与常规方案相比，使用由透气性材料构成的生长表面使增加的培养基体积与表面积的比率(即大于1ml/cm2)、降低细胞表面密度(即小于0.5×106/cm2)、和改变的应答细胞与刺激细胞的比率(小于4∶1)成为可能，从而导致制备时间的缩短。图10A示出了实施例8的此G-Rex方法与实施例1采用的常规方法及实施例5中所描述的G-Rex方法的比较。如图所示，常规方法需要23天来递送与任意一种G-Rex方法中在约10天内所递送的同样多的目标细胞。23天后，实施例8的G-Rex方法能够制备出比实施例5的G-Rex方法多23.7倍的目标细胞并且制备出比实施例1的常规方法多68.4倍的目标细胞。此外，在无需额外的抗原呈递细胞刺激的情况下，目标细胞继续分裂直到第27-30天，只要当细胞表面密度大于7×106/cm2时就将培养物分开即可。
尽管在G-Rex中使用光学显微镜不能清楚地看见CTL，但CTL细胞簇可以用眼睛或者用倒置显微镜看见，在培养的第9、16和23天的细胞的外观示于图10B中。如图10C中所示，G-Rex中的培养并不改变扩增细胞的表型，其中细胞组合物中超过90％是CD3+细胞(G-Rex中为96.7±1.7，相对于24孔中为92.8±5.6)，其中主要是CD8+(62.2％±38.3，相对于75％±21.7)。对活化标志物CD25和CD27以及记忆标志物CD45RO、CD45RA和CD62L的评价证明了在各培养条件下扩增的EBV-CTL之间无实质性差异。抗原特异性也不受培养条件的影响，正如利用ELIspot和五聚体分析所测量的。图10D示出了代表性培养，其中用来自LMP1、LMP2、BZLF1和EBNA1的EBV肽表位进行刺激并用HLA-A2-LMP2肽五聚体染色法进行染色的T细胞显示出相似频率的肽特异性T细胞。此外，扩增的细胞维持它们的溶细胞活性和特异性并且杀伤自体EBV-LCL(在20∶1的E∶T比率下，62％±12相对于57％±8；G-Rex相对于24孔板)，对HLA不匹配EBV-LCL的杀伤率低(15％±5相对于12％±7，E∶T比为20∶1)，如利用51Cr释放测定所评价的，如图10E中所示。
对用于细胞疗法的改进的细胞制备之各种新方法的讨论：已给出了实施例1-8用以向本领域技术人员揭示各种条件的使用(包括：制备周期开始时目标细胞群的降低的表面密度、降低的应答细胞与刺激细胞之间的表面密度比率、由透气性材料构成的生长表面和/或增大的培养基体积与生长表面积的比率)可如何用来加速并简化用于细胞疗法的研究和临床应用的细胞制备。尽管实施例1-8与抗原特异性T细胞的制备有关，但这些新培养条件也可以应用于许多重要的具有临床意义的(或者概念小鼠模型的临床前证据所需的)悬浮细胞类型，这些细胞类型包括：调节性T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、原代T淋巴细胞、种类广泛的抗原特异性细胞等(所有这些细胞都也可以进行遗传修饰，以改进其功能、体内持久性或安全性)。可以利用饲养细胞和/或抗原呈递细胞来扩增细胞，所述饲养细胞和/或抗原呈递细胞可以包括：PBMC、PHA母细胞、OKT3T、B母细胞、LCL和K562，(天然的或者通过遗传修饰来表达的和抗原和/或表位以及共刺激分子例如41BBL、OX40L、CD80、CD86、HLA等)，其可以用或者可以不用肽和/或相关抗原对这些细胞进行脉冲。
非常规地低的起始表面密度：本发明的一个方面是发现了通过采用较低的目标细胞表面密度可以相对于常规方法缩短制备时间。以这种方式，目标细胞能够具有比常规方法所允许的更大的最小细胞表面密度与最大细胞表面密度之间的差值。优选地，当目标细胞群生长速率已开始减小但目标细胞的数量尚不足以终止制备时，再次以低的起始表面密度将目标细胞再分布于由透气性材料所构成的额外的生长表面上。
为了解释如何应用我们这种新的细胞制备方法，所述方法依赖于任意给定培养阶段开始时的较低表面密度，现在对一个实施例进行描述。图11示出了与利用本发明一个方面的目标细胞类型的群扩增相比较的、在常规情况下目标细胞群在生长表面上扩增的图示。在此新方法中，在制备阶段开始时目标细胞的表面密度小于常规表面密度。为了突出此新方法的优点，此部分的解释不描述最初获得目标细胞群的工艺。培养的“日期”开始于“0”以使本领域技术人员能够更容易地确定此新方法的相对时间优点。在此实施例中，常规方法的各制备周期开始于0.5×106个目标细胞/cm2的常规表面密度，而此实施例的各制备周期开始于低得多且非常规的表面密度0.125×106个目标细胞/cm2。因此，在此实施例中需要为常规方法所需表面积4倍的表面积(即500,000/125,000)来起始培养。在此实施例中，于第14天常规方法的目标细胞达到2×106个细胞/cm2的最大表面密度。因此，1cm2的生长面积提供2×106个细胞/cm2，然后将这些细胞再分布于4cm2的生长面积上，因此可以利用0.5×106个细胞/cm2的常规起始密度(即4cm2乘以0.5×106个细胞＝2×106个细胞)继续进行制备。使该周期重复另一个14天，在此时间点再次达到最大细胞表面密度，其中每4cm2的生长表面积递送2.0×106个细胞，总共8.0×106个细胞，然后将这些细胞分布于16cm2的生长面积上并重复制备周期，以在42天内递送总共32×106个细胞。
在图11中所示的新方法中，未采用在制备开始时将500,000个目标细胞沉积在1cm2上的常规方法，而是于第0天将500,000个细胞均等地分布在4cm2的生长面积上，以形成非常规地低的125,000个目标细胞/cm2的起始表面密度。在此实例中，如同常规方法，新方法的生长速率于第7天即将开始降低。新方法中的细胞表面密度为1×106个细胞/cm2。因此，在生长速率即将减小的时间点，此阶段的培养已制备出4×106个细胞，然后将这些细胞再分布于32cm2的生长面积上，因此可以采用0.125×106个细胞/cm2的起始表面密度(即32cm2乘以0.125×106个细胞＝4×106个细胞)继续第二阶段的制备。使该制备的周期或阶段重复另一个7天直到第14天，在此时间点再达到最大细胞表面密度，其中每32cm2的生长表面积含有1.0×106个目标细胞，以仅在14天内制备出总计32×106个细胞。注意在各制备周期结束时，如同常规方法，新方法提供的最终表面密度为起始表面密度的数倍。然而，通过降低起始细胞表面密度并且在细胞已进入生长制备期之前结束制备的各阶段，可显著地缩短制备时间。此实施例描述了通过相对于常规细胞表面密度降低目标细胞的表面密度(在此情况中降低到0.125×106个细胞/cm2)，如何在仅为常规方法33％的时间内(14天对42天)递送相同数量的目标细胞。
尽管我们采用了0.125×106个细胞/cm2的起始表面密度定量说明了优点，但本领域技术人员应当了解本发明的此实施例证明了任何低于常规细胞表面密度的降低都将会缩短制备期。此外，本领域技术人员将认识到在本文所给出的此方法和其它新方法中，细胞生长的速率以及细胞生长减慢所发生的时间点仅是为了说明的目的，而各应用中的实际速率将基于各种条件(例如培养基组成、细胞类型等)而变化。另外，对于给定的应用，本领域技术人员应认识到本发明的此方面的优点是在任何特定应用中由于细胞表面密度减小到低于常规细胞表面密度所导致的制备时间缩短，其中此说明性实例中所采用的特定的常规表面密度可因应用不同而变化。
因此，本发明方法的一个方面现描述了期望通过采用减小的细胞表面密度而使制备存在于细胞组合物中的给定数量目标细胞的制备期最小化。应当以非常规地低的细胞表面密度将目标细胞沉积在生长表面上，使得：
a.目标细胞与抗原呈递细胞和/或饲养细胞共存，且如果生长表面不是由透气性材料构成则培养基体积与表面积的比率为高至1ml/cm2，如果生长表面是由透气性材料构成则培养基体积与表面积的比率为高至2ml/cm2，和
b.在制备周期开始时优选的表面密度条件是使得目标细胞表面密度优选为小于0.5×106个细胞/cm2，更优选地如图4中所示那样减小，以及
c.目标细胞的表面密度加上抗原呈递细胞和/或饲养细胞的表面密度优选为至少约为1.25×105个细胞/cm2。
基于上述实施例，最好是证明如果试图将抗原呈递细胞和/或饲养细胞的表面密度进一步减小到低于1.25×105个细胞/cm2并不限制目标细胞群的扩增。基于证明当通过提供充足的抗原呈递细胞和/或饲养细胞时目标细胞群可以在非常规地低的密度下实现生长的目标，我们选择了1.25×105个细胞/cm2。
使用由透气性材料构成的生长表面以及更高的培养基体积与生长表面积的比率，可以简化并缩短制备。本发明的另一方面是发现：采用由透气性材料构成的生长表面及超过常规比率的培养基体积/生长表面积之比率、以及随时间增加所采用生长表面积的量的重复的制备周期，这些因素将缩短制备期。
现在给出一个说明性实例来展示这些条件能够如何缩短制备期。图12示出了可以通过采用由透气性材料构成的生长表面以及超过1或2ml/cm2的非常规地高的培养基体积/生长表面积之比率所获得优点的实例的论述。接下来的论述的意图是向本领域技术人员揭示通过采用这种方法可以提供若干个选择，包括：缩短制备时间、减小所采用的生长表面积的量、和/或降低人力和污染的危险。本领域技术人员应认识到图12及相关论述仅是实例，而并非限制本发明的范围。
在此说明性实例中假设含有目标细胞群的细胞组合物每“X”时间段消耗大约1ml。图12示出了标记为“常规方法”和“新方法”的两种制备工艺。在生长开始时，各工艺开始于0.5×106/cm2的目标细胞的表面密度。然而，在新方法中生长表面是由透气性材料构成，并且培养基体积与表面积的比为2ml/cm2，而常规方法的培养基体积与表面积的比为1ml/cm2。在时间段“X”中，常规方法的目标细胞群已达到2×106/cm2的表面密度平台期并耗尽营养，而新方法的额外培养基体积使生长能够继续且期望的细胞表面密度为3×106/cm2。如果该新方法继续，那么目标细胞达到4×106/cm2的表面密度。因此，产生许多有利的选择。该新方法可以在时间“X”前终止并制备出比常规方法多的细胞，可以在时间“X”终止并制备出为常规方法约1.5倍之多的细胞，或者可以继续直到耗尽培养基的营养并且在2倍的时间内制备出为常规方法2倍之多的目标细胞，但无需处理补料的装置。常规方法中为了采集同样多的细胞，必须收集这些细胞并重启该工艺，因而增加了劳动以及可能的污染危险。因为细胞疗法用途中通常仅能够开始于固定数量的细胞，所以常规方法不允许在制备开始时简单地增加表面积的这样的选项。
图13继续图12的实施例，以显示多于一个的制备周期是如何更加有利的。图13图示了常规方法中目标细胞群在生长表面上扩增与本发明的新方法中目标细胞类型的群扩增相比较，其中该新方法的表面密度超过常规方法的表面密度。为了突出本实施例，此部分的说明中不描述获得目标细胞群的工艺。培养的“日期”开始于“0”以使本领域技术人员能够更容易地确定本发明此方面的相对时间优点。在此实施例中，两种培养都是于“第0天”采用0.5×105个细胞/cm2的常规目标细胞表面密度开始。在此说明性例中，常规方法的生长表面也是由透气性材料构成。然而，常规方法中培养基体积与生长表面的比为1ml/cm2，而新方法中培养基体积与生长表面的比为4ml/cm2。如图13中所示，常规方法中当在约4天时表面密度约为1.5×106个细胞/cm2时，目标细胞群的生长速率开始降低且在第14天达到2×106个细胞/cm2的最大表面密度。此时，以0.5×106/cm2的表面密度将目标细胞群以1.0ml/cm2分布于新鲜培养基的4cm2生长表面上并且制备周期再次开始，在另一个14天内达到2×106个细胞/cm2的表面密度且在第28天递送8×106个目标细胞。相比之下，新方法中，于大约第10天至第11天当表面密度约为3×106个细胞/cm2时目标细胞群的生长速率开始下降，可以在第28天达到4×106个细胞/cm2的最大表面密度。然而，为了加速制备，当目标细胞群仍然处在高生长速率时终止制备周期。因此，于大约第10天到第11天，将3×106个细胞以0.5×106/cm2的表面密度再分布于6cm2的新鲜培养基的生长表面积上(4.0ml/cm2)并且制备周期再次开始，在大约另一个10到11天内目标细胞群达到3×106个细胞/cm2的表面密度并且于大约21天时递送18×106个目标细胞。因此，与常规方法相比，该新方法在大约75％的时间内制备出超过2倍数量的目标细胞。
我们已能够在由透气性材料构成的生长表面上获得超过10×106个细胞/cm2的细胞表面密度，因而证明本发明采用高表面密度并不限于此实施例中的密度。
因此，现在对本发明方法的另一个实施例进行描述，其中通过采用降低的细胞表面密度而使制备给定数量的存在于细胞组合物内的目标细胞的制备期最小化：
a.在抗原呈递细胞和/或饲养细胞存在下将目标细胞接种于由透气性材料构成的生长表面区域上，培养基体积/表面积的比至少为2ml/cm2，
b.在制备周期开始时建立优选的表面密度条件，使得目标细胞表面密度在约为0.5×106个细胞/cm2的常规密度内，
c.使目标细胞群能够扩增超过约为2×106个细胞/cm2的常规表面密度，以及
d.如果需要更多的目标细胞，则将目标细胞再分布于由透气性材料所构成的额外的生长表面上并重复步骤a-d直到获得足够的目标细胞。
当采用这些新方法时，通过将采用非常规地低的表面面积、采用目标细胞和/或饲养细胞的新表面密度比、采用由透气性材料所构成的生长表面、采用非常规地高的培养基体积/生长表面积的比来启动培养、以及执行多周期制备，这些特征加以组合，可以获得更多的益处。可以在任何制备周期内改变所述条件，由此获得期望的结果，例如在制备时间缩短、表面面积的利用、加料频率等之间达到平衡。
图14示出了另一种新方法，其中相对于常规方法获得了进一步的优点。如同本文中所描述的其它说明性实施方式，本领域技术人员将认识到本文中的描述并非限制本发明的范围，而是用来说明如何实现制备效率提高的优点。
在此实例中，在常规条件下每周使目标细胞倍增。培养的“日期”开始于“0”以使本领域技术人员能够更容易确定此实施方式的相对时间优点。此外，不再重复前述的与饲养细胞和/或抗原呈递细胞表面密度比有关的问题，以简化此实例。为了说明的目的，在制备“第0天”采用起始有500,000个目标细胞并且常规条件下倍增时间为7天的细胞群。常规方法开始于0.5×106个细胞/cm2的表面密度、以及1ml/cm2的培养基体积与表面积的比。如图所示，当目标细胞群达到2×106个细胞/cm2的表面密度时，将细胞以0.5×106个细胞/cm2的表面密度分布于额外的表面积上并且制备周期再次开始。在此实施例的新方法开始于0.06×106个细胞/cm2的表面密度，生长表面区域由透气性材料构成、培养基体积与表面积的比6ml/cm2。如图中所示，当细胞群将要开始进入生长平台期时，将细胞再分布于更大的生长表面上。在此情况下，注意在常规方法中细胞表面密度接近培养基体积与表面积的比的1.5倍(即，约为1.5×106个细胞/ml)时开始平台期，由此判断细胞群开始进入平台期。因此，于大约第9天，在约为4.5×106个细胞/cm2的表面密度下将细胞分布于36cm2的生长表面积上并且制备周期重新开始。
图15列表显示了对图14中所示各制备方法的比较，并且引申到各阶段以证明新方法的效能、以及为何在各种阶段中调整制备方案可有利地获得充分效率。注意到，新方法在仅完成制备周期的第二阶段后就优于常规方法，在仅大约一半的时间内以仅61％的表面积需求递送了接近1.37倍的细胞。然而，注意在制备周期的第三阶段是如何产生细胞的显著增加以及表面积的相应增加。因此，应将制备周期模型化，以预期如何在该方法的全部各周期中调节初始细胞表面密度和/或最终细胞表面密度而使任意给定方法获得最佳的效率水平。
作为一个实施例，图16示出了当制备进行时可如何通过改变新方法中的变量而获得效率的一个实例。例如，可以使第3周期的起始表面密度从0.06增加到0.70细胞/cm2并且使最终表面密度从4.5变化到7.5细胞/cm2。增加最终表面密度取决于增加培养基体积与表面积的比率使其超过起始的6ml/cm2至更大的数值。培养基体积比表面积越大，保持在快速生长期内的周期(即在平台期前的群扩增)就越长。在此情况下，我们给出额外的5天时间来完成快速生长期并且将培养基体积与表面积的比提高到大约8ml/cm2。这样，在此实施例中，能够在34天内用合理的表面积制备出超过3万亿的细胞。例如，我们已制造出具有约625cm2由透气性材料构成的生长表面的装置并对该装置进行了测试。这显然是比常规方法优越的细胞制备方法。
因此，现在对本发明方法的另一优选实施方案进行描述，其中期望的是通过采用降低的细胞表面密度而使存在于细胞组合物内的给定数量目标细胞的制备期最小化：
a.在抗原呈递细胞和/或饲养细胞存在下将目标细胞接种于由透气性材料构成的生长表面上，且培养基体积与表面积的比率为至少为2ml/cm2，何
b.在制备周期的开始时建立优选的表面密度条件，使得目标细胞表面密度小于常规密度，优选从约0.5×106个目标细胞/cm2至约3900个目标细胞/cm2，并且目标细胞与抗原呈递细胞和/或饲养细胞的总数量为至少约1.25×105个细胞/cm2，和
c.使目标细胞群扩增超过约2×106个细胞/cm2的常规表面密度，以及
d.如果需要更多的目标细胞，则将目标细胞再分布于由透气性材料构成的额外的生长表面上并重复步骤a-d直到获得足够的目标细胞。
本发明的公开内容通过产生一类新的称为T载体的治疗用细胞使过继细胞治疗领域得到进步。T载体包含不携带固有GVHD风险的T细胞群，进一步改变成包含一个或更多个能够用于治疗目的的治疗特性以为受者提供治疗益处。因为T载体不具有启动GVHD疾病的天然能力，所以其成为一种理想输送载体，其装备任何数量的能够对抗广泛多种医学病症和疾病之武器。本发明公开了制备和使用具有治疗特性而无现有技术方法中存在的固有GVHD风险的T载体的方法，所述治疗特性用于为受者提供过继细胞疗法之健康益处。重要的是，T载体与用于过继细胞疗法的现有技术方法作用方式相反，因为T载体的治疗目的完全与天然T细胞受体的抗原特异性无关。通过所给出的公开内容和所示出的实施方案，使本领域技术人员认识到，T载体的治疗特性不包括T载体的天然抗原受体。
T载体通过以下步骤来制备：用抗原刺激供体PBMC或供体脐带血，以激活对抗原具有天然抗原特异性之供体T细胞的生长，从而产生包含对抗原具有抗原特异性之抗原受体的抗原特异性T细胞群。通过选择不存在于正常细胞上的抗原，可以制备具有不能识别正常细胞之抗原受体的T细胞群。通过忽略可以从天然T细胞的抗原特异性获得的治疗益处，并将天然T细胞改变成具有以下治疗特性：即其不包括天然抗原受体识别能力，可产生一种T载体群，所述T载体群具有与抗原特异性识别无关的用途并且并不固有地易于或甚至不能够启动GVHD。
虽然T载体可包含多于一种天然抗原特异性T细胞群，但是由于T载体不依赖于其用于治疗目的的天然抗原特异性，所以可以将T载体输注到受者中，而与受者的血清型是否表现出与T载体的任何天然抗原受体阳性匹配无关。另外，T载体的关键特性包括其能够用于HLA不匹配的情况，或者由于得出T载体之天然T细胞群不具有固有的GVHD风险。这使得能够建立T载体的同种异体库，其可服务于广泛大众而不受限于现有技术方法中所要求的HLA匹配。当T载体具有HLA与受者不匹配性之天然抗原特异时，T载体的天然T细胞受体不能在受者中识别细胞和引发GVHD。尽管如此，T载体可以在HLA完全不匹配的情况下开始其治疗活性，因为其已被改变成具有不依赖于天然抗原受体的治疗特性，以实现其治疗目的。然而，T载体并不限于用于HLA不匹配的情况。通过产生由具有如下天然抗原受体之T细胞构成的T载体，尽管受者与T载体的天然抗原特异性之间具有部分HLA匹配，仍可避免引发GVHD疾病，所述天然抗原受体具有针对不在正常细胞上表达之抗原的高度受限的抗原特异性。为了在HLA匹配或HLA不匹配的情况下使用T载体，优选T载体的天然抗原特异性仅允许其识别不在正常细胞上存在的抗原，更优选正常人细胞，甚至更优选地仅能够识别不在正常哺乳动物细胞上存在的抗原的单一表位。
在T载体与受者HLA不匹配的情况下，预期受者会作出有力的免疫应答，最终将消除T载体。因此，通过递送一个或更多额外剂量的T载体可继续T载体的治疗目的。该过程可根据需要持续以获得期望的治疗目的。在该优选方法中，每个剂量的T载体的HLA都不同，使得患者的免疫系统在每次准备攻击新剂量的T载体时自身都需要重新应激(re-prime)，从而保持每个剂量的T载体之间的间隔都大致相同。
制备具有高度受限的抗原特异性之天然抗原受体的T细胞的方法：在历史上，以广泛应用于过继细胞疗法所需的规模制备T细胞群根本不可能。现有技术中用于将T细胞扩增成合适大小的治疗剂量的制备方法不切实际且不可控，这将细胞疗法限于极少数群体，他们必须在少数高度专业化的机构得到治疗。T载体的基本特性是其天然T细胞特征并不固有地造成受者遭受GVHD。因为优选T载体的天然抗原特异性仅允许其识别不在正常细胞上存在的抗原，更优选正常人细胞，甚至更优选地仅能够识别不在正常哺乳动物细胞上存在的抗原的单一表位，这些细胞的高效制备成为涉及T载体之方法的广泛应用的基石。这样的T细胞在供体PBMC或脐带血中仅以非常低并且有时检测不到的频率出现。因此，当试图产生最适用于T载体的T细胞群时，现有技术的T细胞制备方法固有的问题得到了解决。
我们发现了方法和装置，如于2012年5月18日提交的题为“IMPROVED METHODS OFCELL CULTURE FOR ADOPTIVE CELL THERAPY”的美国专利申请No.13/475,700(在下文中也称为Vera‘700，其通过引用并入本文)中所述，其与现有技术方法相矛盾，从而实现高效地制备具有天然特性但不造成受者固有地遭受GVHD的T细胞。由此，对在供体PBMC或脐带血中以低频率可见的T细胞之实际制备的长期需要得到了满足。而且，当与拥有非T细胞之天然抗原特异性所固有治疗特性的新概念T细胞组合时，充当生物载体之T载体的制备不仅成为可能，而且变得实际。
在一个示例性方法中，在培养开始时将多于一种所选抗原呈递给PBMC或脐带血(即，抗原特异性T细胞的原始库)，以刺激多于一种特殊抗原特异性T细胞群(每个群表达所呈递的某个抗原的抗原受体)的生长。这样做的目的是随后选择用于制备的最具增殖性和/或最期望的天然T细胞群，并终止其他T细胞群。随着开始后培养的进行，应答于多种抗原的多个T细胞群可能表现出不同水平的群扩增，这取决于其群的原始大小。此外，其中的一些或者全部可能继续检测不到。一段时间后，评估培养中的与任何所选抗原反应之T细胞群的可接受生长。这样的评估可仅针对对一种抗原具有特异性的一个群，或者针对对其他抗原具有特异性的其他群。如果一个抗原特异性T细胞群示出可接受的扩增，则通过仅向装置中添加其所识别的抗原再刺激该特定T细胞群将导致剩余的T细胞最终死亡，而特定的期望T细胞群继续增殖。然而，如果多于一种T细胞群示出可接受的扩增，则有两种选择：1)仅用那些特定T细胞与之反应的抗原再刺激培养物(从而终止增殖性较低之T细胞群的扩增)，或者2)可以将培养物分入多于一个培养装置，每个装置接受与所有其他装置不同的单一抗原，从而使得在每个装置中仅有一个T细胞群体增殖，除了最具增殖性的培养物以外其他均被终止。优选地，所有培养装置都是可透气的，并且如Wilson等的共同在审的美国公开No.2005/0106717A1(在下文中称为Wilson‘717)和Wilson的2008/0227176A1(在下文中称为Wilson‘176)中所述的类型，两篇专利均通过引用并入本文，并依赖于Vera‘700的方法。
经由另一个实例，可以向置于培养装置中的PBMC群呈递抗原A、抗原B和抗原C。一段时间后，可以评估培养物中与抗原A、B或C反应的群的存在和/或增殖。如果与抗原A反应的抗原特异性群是唯一的未表现出可接受的频率和/或群扩增的群，则可通过仅用抗原B和抗原C再刺激来将其终止。或者，如果与抗原B和抗原C反应的抗原特异性群大致等同地增殖，但不能确定哪个将以最佳速率继续增殖，则将培养物分到两个装置中，预期一个装置将最终继续制备，而另一将被终止。第一装置将接收抗原B，第二装置将接收抗原C。对抗原B表现出抗原特异性的T细胞在第一装置中增殖，但对抗原C表现出抗原特异性的T细胞最终死亡。反之在第二装置中亦然。可以在第一装置和第二装置中的培养发生后的一些时间点检测频率和/或群大小，以终止具有期望T细胞群之最小有效扩增的培养物。本领域技术人员可以认识到，在开始时起始具有多个抗原的培养物，相比于仅一个抗原的主要优点是，其增加了找到具有合适抗原特异性和生长速率之T细胞群的前景。此外，在一个装置使用多个抗原而非多个装置使用一个抗原是使PBMC或脐带血、培养基、细胞因子、实验室空间、劳动力和生物毒处置空间更高效地利用。
现在将描述选择T载体之优选的天然抗原特异性：虽然优选T载体的天然抗原特异性仅允许其识别不在正常细胞上存在的抗原，更优选正常人细胞，甚至更优选地仅能够识别不在正常哺乳动物细胞上存在的抗原的单一表位，但这是非限制性的，并且本领域技术人员可以考虑天然抗原受体的许多合适的特性。许多选择和特征是合适的。例如，T载体的天然抗原特异性可以包括多于一个具有天然抗原特异性的T细胞群。T载体的天然抗原特异性可以针对整个抗原，也可以针对自身抗原或非自身抗原的单一表位；爬行动物、两栖动物、鱼类或鸟类；无脊椎动物，如海绵动物、腔肠动物、蠕虫、节肢动物、软体动物或棘皮动物；细菌、真菌、寄生虫和海绵动物；病毒包括但不限于腺病毒、Epstein-Barr病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒(Adv)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、人类疱疹病毒6(HHV6)、人类疱疹病毒7(HHV7)、BK病毒、JC病毒、流感病毒、H1N1病毒、副流感病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、细小病毒B19、冠状病毒、Metanpneumovirus、博卡病毒(Bocavirus)或KI病毒/WU病毒；或生存素、gp100、酪氨酸酶、SSX2、SSX4、CEA、NY-ESO-1、PRAME、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、Claudin-6、Cyclin-B1、Her2/neu-ErbB2、组蛋白H1.2、组蛋白H4、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、Myc、p53、ras、PSA、PSMA、PSCA、Sox2、Stromelysin-3、Trp2、WT1、蛋白酶3、Muc1、甲胎蛋白、CA-125、bcr-abl、hTERT或前列腺酸性磷酸酶-3。
为了促进供体细胞之合适的天然T细胞群生长，本领域技术人员可以参阅美国公开No.2011/0182870A1(在下文中称为Leen‘870，其通过引用并入本文)，还可以考虑使用抗原呈递细胞(APC)来刺激，所述抗原呈递细胞例如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、PBMC或人工抗原呈递细胞例如改造的k562，其中任意一者均能够呈递期望的抗原以产生供体天然T细胞群的期望抗原特异性，从而产生T载体的天然抗原特异性；通过使用含期望抗原的细胞裂解物、含期望抗原的纯化蛋白、含期望抗原的重组蛋白、编码期望抗原的质粒DNA、编码所述期望抗原的质粒RNA和/或含期望抗原的肽文库、和/或含期望抗原的单一合成肽来使用抗原在供体细胞中诱导期望的免疫应答。
T细胞群的制备优选采用Vera‘700和/或本文给出的方法来进行，最优选利用Wilson‘717和/或Wilson‘176中所述类型的透气性培养装置来进行。本领域技术人员能够认识到，所述工作主体中的多种方法可能或多或少是合适的，这取决于每种应用的具体目的。例如，可以利用多种表面密度、培养基高度、培养基体积与生长表面积等，以及用细胞因子例如IL2、IL15、IL21、IL12、IL7、IL27、IL6、IL18和/或IL4刺激，以及多种频率和浓度，可以采用任何来源的抗原联合任何呈递抗原的方法来进行反复体外刺激，通过包括但不限于γ捕获、磁分离、单细胞克隆和/或流式细胞术的方法进行细胞分选或者不进行细胞分选。
实施例9：具有识别CMV表位NLV之天然T细胞受体的T载体不能识别非自体细胞靶标
12天之内，采用前述方法将对NLV-CMV具有天然抗原特异性之抗原特异性T细胞从在PBMC中0.03％的频率扩增到87％。然后将这些细胞与来自三位HLA不匹配的呈递靶CMV抗原之NLV肽的供体的细胞一起培养。
图17示出T载体不能识别来自不匹配同种异体供体的细胞，无论它们是否表达NLV肽(“allo1”和“allo1pep”，“allo2”和“allo2pep”，“allo3”和“allo3pep”)，但它们识别和杀伤呈递NLV肽的自体细胞(“Auto4pep”)，并避免杀伤不呈递NLV肽的自体细胞(“Auto4”)的能力证明了它们具有完全的功能。
选择和产生期望的治疗特性：有许多选择可用于将抗原特异性T细胞群改变成具有至少一个治疗特性。下述实例是非限制性的，但意在为本领域技术人员提供以下认识：治疗特性的选择如何取决于治疗目的以及为何治疗特性与其治疗目的与T载体天然抗原受体的抗原特异性无关。
实施例10：加载有作为佐剂施用的重组蛋白用于免疫疗法的T载体
免疫疗法是一类被设计成触发或放大患者的免疫应答的疗法。实例包括施用设计成激活针对在癌细胞上表达的肿瘤抗原的免疫应答的疫苗或者递送离体扩增的T细胞或NK细胞。重组蛋白例如细胞因子如IL2、IL7、GM-CSF已被全身施用以促进这些细胞在体内生长、扩增、驻留和/或发挥功能，但一些细胞因子(例如，IL2)的全身施用与体内毒性相关，包括重度粘膜炎、恶心、腹泻、水肿、呼吸窘迫、肝和肾功能障碍以及损伤诱导的/输注的T细胞功能的调节性T细胞的扩增。施用加载有重组蛋白(包括细胞因子)的T载体可以通过迁移到炎症部位和将这些重组蛋白直接递送到炎症部位(通过免疫治疗剂诱导)来克服这些毒性。
本领域技术人员能够认识到可以使用T载体来靶向递送这些细胞因子代替传统的非特异性全身施用。例如，进行了实验来制备能够产生细胞因子IL7和表达CD34A的截短形式(其可用于检测转导细胞的百分比及选择转基因群)的T载体。在这种情况下，如图18所示，对CMV病毒的NLV表位具有98％天然抗原特异性的供体T细胞被成功地改变成具有CD34A-IL7细胞因子表达之治疗特性的T载体，如通过流式分析所确定的。进一步的测试表明，仅有用逆转录病毒载体(CD34A-IL7细胞因子)改造的T载体能够产生IL7，如通过ELISA所确定的。
为了在IL7细胞因子的体内效应和体内分布方面评估用逆转录病毒载体(CD34A-IL7细胞因子)改造的治疗性T载体，将小鼠分成两组(每组5只动物)。在第1组，通过IV全身施用2000ng的IL7细胞因子来处理肿瘤小鼠。在第2组，通过单次IV注射10E+06T载体来处理小鼠。然后在第1周和第2周处死各组的随机对象，通过ELISA评估不同部位的细胞因子浓度，包括心脏、肝、肾、脾、腹膜、肿瘤和血液。
图19A示出组1中各部位的IL7细胞因子累积。IL7细胞因子ELISA分析表明，在肾检测到较高的细胞因子水平，而在肿瘤部位该水平低于可检出限。
图19B示出组2中各部位的IL7细胞因子累积。IL7细胞因子ELISA分析表明，与其他器官相比，肿瘤部位的细胞因子浓度较高，而且在施用T载体后的至少两周，在肿瘤处细胞因子持续产生。因此，T载体能够迁移到肿瘤部位，并且优选递送细胞因子IL7，持续一段时间。这清楚地证明了T载体具有递送细胞因子之治疗特性的的能力，与现有技术全身施用的细胞因子递送方法相比提供了优越的治疗益处。如所预期的，T载体具有受限的体内存在，正如从第一周至第二周细胞因子浓度降低所表明的那样。可以将此看做T载体的额外益处，因为它们并不留在受者内。优选地，可以根据需要施用额外剂量的T载体，直到获得了治疗成果，而若无额外剂量，则T载体将会从受者中被清除。
实施例11：可以将供体T细胞改造以制备出具有如下治疗特性的T载体：为靶向特定抗原的嵌合抗原受体(CAR)
将98％的对病毒CMV的表位NLV具有天然抗原特异性之T细胞的供体T细胞(如通过五聚体分析评估的)，转导以制备具有表达能够识别前列腺干细胞抗原(PSCA)的CAR之治疗特性的T载体。该T载体的治疗目的是破坏前列腺肿瘤细胞。如图20所示，在E2象限，57.23％的供体T细胞被成功改变以制备出具有CAR-PSCA治疗特性的T载体，如通过流式分析所确定的。为了测试具有CAR-PSCA治疗特性的T载体的杀伤效力，将未经改变的供体T细胞和通过用CAR-PSCA修饰供体T细胞而制备的T载体以1∶1的比值与对抗原PSCA呈阳性(GFP+)或PSCA阴性(mOrange+)的靶细胞一起培养，培养72小时后，通过流分析对残余PSCA阳性肿瘤细胞的数量进行定量。图21示出在72小时时的实验结果，其中，A1象限示出PSCA阴性细胞的数量，A3象限示出T载体的数量，A4象限示出PSCA阳性肿瘤细胞的数量。如所预期的，72小时后，未经改变的供体T细胞不改变原始培养组合物。然而，相反的是，表达CAR-PSCA的T载体几乎能够清除整个PSCA阳性肿瘤细胞群，同时通过保留PSCA阴性细胞不受伤害示出对PSCA抗原的精确选择。这清楚地表明T载体能够产生与其天然抗原特异性不相关的治疗益处。
实施例12：可以将供体T细胞改造为制备具有如下治疗特性的T载体：成为能够在受体中去除非期望细胞因子的受者
肿瘤细胞通过产生抑制内源T细胞之抗肿瘤效应的免疫抑制细胞因子来免受免疫系统侵袭。可以将供体T细胞改变以制备具有如下治疗特性的T载体：表达提供治疗目的所需的任何特定细胞因子受体，从而具有使肿瘤环境更容纳免疫治疗策略的治疗益处，所述治疗目的在于从肿瘤清除非期望的特定细胞因子。图22A和图22B示出该方法的一个图示。在图22A的描述中，具有受体能够结合IL4之治疗特性的T载体邻近表达IL4细胞因子的肿瘤细胞。在图22B的描述中，T载体已经结合了IL4细胞因子，并且保护肿瘤细胞之IL4细胞因子的量大大降低。应注意，T载体的治疗特性、治疗目的和治疗益处不包括T载体的天然抗原受体并且与其无关。进行实验来评价具有表达胞外重组细胞因子受体IL4R/7之治疗特性的T载体消除IL4细胞因子的能力。通过将供体T细胞改变成对CMV病毒的NLV表位具有天然特异性来制备T载体。在24孔板于2ml培养基体积中于2000pg/ml的IL4的存在下培养5E+05T载体，并与供体T细胞进行比较。在24、48和72小时，通过ELISA评价细胞因子IL4的浓度。结果示于图23中。明显的是，T载体能够满足其治疗目的，因为经过72小时的时间段，免疫抑制肿瘤生长因子IL4细胞因子的减少非常突出。相反，供体T细胞(即，标记为“未经改造T载体”的直方图)未示出能够减少IL4的存在。
本领域技术人员能够认识到，T载体可以具备多种治疗特性以能够满足旨在为受者提供治疗益处的治疗目的。现在将通过若干其他实施例来增加所公开的可能性。
改变成具有用于靶向治疗癌症的化学治疗剂之治疗特性的T载体：多种不同的化学治疗剂或抗肿瘤药物被用于治疗不同类型的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、脑部癌症、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓瘤。大多数化学治疗剂经静脉内递送，但一些药剂也可以经口施用，然后循环通过全身。化学治疗剂通过杀伤快速分裂(大多数癌细胞的主要特征之一)之细胞来发挥作用。这意味着化学治疗剂也会伤害在正常环境下快速分裂的细胞(例如，骨髓、消化道和毛囊中的细胞)。这导致化学治疗剂最常见的副作用是骨髓抑制(血细胞的产生减少，因此发生免疫抑制)、粘膜炎(消化道内层(lining)的炎症)和脱发(毛发减少)。化学治疗诱发的恶心和呕吐也是常见的治疗副作用。施用加载有这些药物的T载体有可能抵消这些毒性。这可通过向T载体加载化学治疗剂，将其输注入受者，其从而迁移到趋化梯度下的炎症(癌症)部位。以这种方式，使化学治疗剂置于邻近肿瘤细胞，与以全身方式施用于受者相反。在HLA不匹配的情况下，受者免疫系统将攻击T载体，导致其被破坏，但仍在肿瘤细胞部位释放化学治疗剂。因此，载荷(即，化学治疗药物)可以直接在靶部位沉积，而非以全身方式施用，从而降低与化学治疗相关的脱靶毒性。
该方法描绘于图24A、图24B和图24C中。如图24A所示，加载有化学治疗剂的T载体向炎症部位(即，肿瘤细胞)迁移，由于T载体与受者细胞之间的HLA不匹配，T载体的天然抗原受体不识别受体细胞，从而到达肿瘤细胞而不引发GVHD。如图24B所示，受者免疫系统已经靶向位于肿瘤细胞部位的T载体。如图24C所示，在受到受者免疫系统攻击时，T载体已在肿瘤细胞的部位释放化学治疗剂，从而避免现有技术的化学治疗剂递送方法所固有的脱靶毒性。
改变成具有抗微生物剂之治疗特性的T载体：抗微生物剂是杀灭微生物(例如细菌、真菌或原生动物)或抑制这些微生物生长的物质。这些试剂通常全身性施用并且如果加载到能够到达炎症部位以递送其载荷的T载体上的话则可以以更靶向的方式递送。
改变成具有产生作为佐剂与免疫疗法一起施用之重组蛋白的治疗特性的T载体：除加载外源重组蛋白以外，还可使用病毒(例如，腺病毒、逆转录病毒、慢病毒)或非病毒转染方法来改造T载体以转基因表达重组蛋白，包括细胞因子、趋化因子、酶、肿瘤抗原和细胞因子受体，所述重组蛋白还可以设计为其他免疫治疗干预的佐剂以增强T细胞驻留、促进扩增、诱导归巢等。
改变成具有表达赋予细胞肿瘤特异性之转基因分子的治疗特性的T载体：可以利用重组蛋白例如细胞因子以相同的方式改造T载体，还可以利用病毒(例如，腺病毒、逆转录病毒、慢病毒)或非病毒转染方法改造T载体以使其转基因地表达嵌合T细胞受体(CAR)。
改变成加载有或者改造成具有用于治疗自身免疫疾病之重组蛋白的治疗特性的T载体：自身免疫疾病起源于机体对正常存在于机体中的物质和组织的不适当免疫应答。换言之，免疫系统将机体的某部分错当成病原体并攻击其自身细胞。其可限于某些器官。加载有将抑制炎症的重组蛋白(例如IL10、TGFB、IL13细胞因子)的T载体的施用可以通过将这些重组蛋白直接递送到炎症部位从而将载荷直接递送至有此需要的部位而非不加选择地分散重组蛋白而克服这些自身免疫效应。
可以将T载体改造为表达自杀基因：为了快速且完全消除输注细胞，可以向T载体并入可触发产生毒性的安全开关或自杀基因。经过最佳验证的自杀基因是来自单纯疱疹病毒I的胸苷激酶(HSV-tk)。该酶使无毒前药更昔洛韦磷酸化，然后通过内源激酶将其磷酸化为GCV三磷酸，导致链终止，单链在并入DNA后断裂，从而杀伤分裂细胞。一些I-II期研究已表明，更昔洛韦的施用可以在体内安全消除转移的经HSV-tk改造的细胞。最近，诱导型Fas、Fas相关含死亡结构域蛋白(FADD)和半胱天冬酶9已被认为是可替选的非免疫原性自杀基因。每个这些分子在与FK结合蛋白(FKBP)变体融合时均可充当自杀开关，所述FKBP变体结合二聚体化学性诱导物(CID)，AP1903，其为已证实在健康志愿者中安全的合成药物。施用该小分子导致促凋亡靶分子交联和活化。高达90％的转导有诱导型Fas或FADD的T细胞在暴露于CID之后经历凋亡。虽然有前景，但是消除90％的经转导细胞可能不足以确保体内经遗传改造细胞的安全性。推测通常在B细胞上表达的CD20分子的转基因表达是用于T细胞疗法的自杀基因。该策略依赖于人源化抗CD20抗体(Rituximab)的临床应用，所述人源化抗CD20抗体(Rituximab)广泛用于消除表达CD20抗原的正常B细胞和肿瘤B细胞二者。因此，转基因表达人CD20的T细胞的输注及Rituximab的后续体内施用应高效消除输注的T细胞群，但这也将消除正常的B细胞。因此，可以改造T载体以表达这些不同的自杀基因之一或其组合以控制载荷的消除和递送。
改变成加载有和/或改造为体内成像的治疗特性的T载体：正电子放射断层扫描(PET)是一种核医学成像技术，其产生机体的三维图像或功能过程图片。该系统检测由发射正电子的放射性核素(示踪剂，通过生物活性分子引入机体)间接发出的γ射线对。然后通过计算机分析构建机体中示踪剂浓度的三维图像。由于T载体能够迁移到肿瘤部位，可以向T载体加载放射性同位素以使得进行体内检测并确定肿瘤部位的位置。
类似地，碘-123(123I或I-123)是在核医学成像中使用的碘的放射性同位素，包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。其为最适合用于甲状腺疾病之诊断研究的同位素。对于24h(小时)碘摄取测试而言，约13.3h(小时)的半衰期是理想的，而且123I在甲状腺组织和甲状腺癌转移的诊断成像方面具有其他优点。由于通过酶甲状腺过氧化物酶(TPO)产生的过氧化氢而进行的碘在“碘截留”中的选择性捕获，碘可以安全地用于成像或治疗甲状腺肿瘤。这样，可以用甲状腺过氧化物酶(TPO)改造T载体以截留可用于成像和/或杀伤T载体的碘。
本领域技术人员能够认识到，可以通过许多技术来产生T载体的用于任何给定治疗目的之治疗特性，所述技术包括但不限于：
a)用病毒载体进行遗传改造，例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒，和/或
b)通过非病毒载体进行遗传改造，包括利用通过物理和/或化学技术(例如使用转座子和转座酶(例如，Sleeping Beauty)和/或Piggybac技术的电穿孔和/或脂质转染方法)并入的DNA和/或RNA载体，和/或
进行遗传改造以包含进一个或更多个转基因，所述转基因改进T载体迁移、并入自杀基因、改进受者免疫重构(例如，细胞因子产生)和/或引发直接抗病毒或抗肿瘤效应(例如，嵌合抗原受体)或抑制免疫应答以治疗自身免疫疾病，和/或
d)进行遗传改造以通过表达一个或更多个趋化因子受体来改进T载体迁移，所述趋化因子受体例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3-A、CXCR5、CXCR6、CX3CR1和/或XCR1以改进T载体的迁移，和/或
e)进行遗传改造以通过T载体表达一个或更多个细胞因子或者通过表达或过表达共刺激分子CD80、CD86、41BBL、OX40L来改进受者免疫重构，所述细胞因子例如GM-CSF、TNFα、INFγ、IL2、IL8、IL15、IL7、IL12、IL21或IL26，和/或
f)进行遗传改造以通过表达一个或更多个自杀基因来诱导T载体死亡，所述自杀基因例如胸苷激酶TK基因、CD20、CD19或iCaspase9，和/或
g)进行遗传改造以引发直接抗病毒或抗肿瘤效应，包括但不限于表达一个或更多个转基因，例如嵌合抗原受体(CAR)，其通过分离自特异性抗体的单链可变片段(scFv)识别肿瘤靶标，所述特异性抗体与如下相连：i)胞外间隔物，例如通过使用来源于IgG-FC区的CH2CH3序列；或ii)跨膜组分，包括但不限于CD28、CD4、CD3或CD8的序列；iii)CD3ζ内结构域(endodomain)；或iv)通过表达天然配体，例如编码CD3ζ内结构域的细胞因子或细胞因子受体，和/或
h)进行遗传改造来抑制免疫应答以治疗自身免疫疾病，例如通过表达产生一个或更多个免疫抑制细胞因子的转基因，或通过表达竞争配体，例如CTLA-4、PD1，所述细胞因子例如IL4、IL6、IL10、IL13、TFGβ。
本领域技术人员能够认识到T载体的治疗目的可以是广泛的，包括但不限于以下任一种：
a)作为生物载体携带DNA、RNA、重组蛋白、肽或适体(aptamer)
b)作为生物载体携带化合物，和/或
c)作为生物载体携带具有治疗目的的化合物，包括但不限于化学治疗药物、小分子、纳米颗粒、激素激动剂或拮抗剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂，和/或
d)作为生物载体携带没有治疗目的但有继发收获的化合物，所述收获包括但不限于将使得能够鉴定疾病转移部位的体内鉴定和成像。
在本申请中引用的每篇申请、专利和文章及在每篇申请、专利和文章(包括每篇授权专利的审查期间；“申请引用的文件”)、在审的美国公开No.2005/0106717A1和2008/0227176A1中引用的每篇文件或参考文献，对应于或者要求这些申请和专利的任一篇的优先权的PCT和国外申请或专利的每一篇以及在每篇申请所引用文件中所引用或参考的文件的每一篇均通过引用明确并入本文。
任何上述通过引用文献的并入都限于并入的主题均不会与本文明确公开的内容相矛盾。任何上述通过引用文献的并入还限于文献中所含的权利要求均未通过引用并入本文。任何上述通过引用文献的并入还限于在文献中提供的任何定义均不通过引用并入本文，明确说明包括在本文中的除外。
为了解释本发明的权利要求，明确指出不依据35U.S.C.112节第六段的规定，除非在权利要求中记载有特定术语“意为”或“...的步骤”。
本领域技术人员将认识到，可以对本公开内容作出许多改变而不脱离本文所述发明的精神。因此，无意于将本发明的范围限制在所述的实施方案和实施例。而是，本发明的范围由所附权利要求及其等同变化形式来解释。
Claims (15)
1.一类被称为T载体的治疗用细胞，其用于在受者体内使用，其中所述T载体的特征在于其包含：
人T细胞，其具有识别非人抗原的天然T细胞受体，并且
在不知道所述人T细胞的HLA是否与人T细胞供体不匹配、部分匹配或匹配时所述人T细胞已被改造以包含至少一种治疗特性。
2.权利要求1所述的一类治疗用细胞，其中所述治疗特性是表达嵌合抗原受体。
3.权利要求1所述的一类治疗用细胞，其中所述治疗特性是表达重组蛋白。
4.权利要求3所述的一类治疗用细胞，其中所述重组蛋白是细胞因子。
5.权利要求4所述的一类治疗用细胞，其中所述细胞因子是IL2、IL7或GM-CFS。
6.权利要求1所述的一类治疗用细胞，其中所述治疗特性是表达识别细胞因子的受体。
7.权利要求6所述的一类治疗用细胞，其中所述细胞因子是IL4。
8.权利要求1至7中任一项所述的一类治疗用细胞，其中所述治疗用细胞表达自杀基因。
9.权利要求8所述的一类治疗用细胞，其中所述自杀基因是来自单纯疱疹病毒I的胸苷激酶或者Fas相关含死亡结构域蛋白(FADD)或者半胱天冬酶9。
10.权利要求1至9中任一项所述的一类治疗用细胞，其中所述治疗用细胞具有仅仅识别所述非人抗原之单一表位的天然抗原受体。
11.权利要求1至10中任一项所述的一类治疗用细胞，其中所述非人抗原来自病毒、来自细菌或者来自真菌。
12.权利要求11所述的一类治疗用细胞，其中来自病毒的所述非人抗原来自巨细胞病毒、腺病毒、Epstein-Barr病毒、BK病毒、人类疱疹病毒6或人类疱疹病毒7。
13.权利要求1所述的一类治疗用细胞，其中所述人T细胞已被逆转录病毒载体改造。
14.权利要求1所述的一类治疗用细胞，其中所述人T细胞获自外周血单核细胞。
15.权利要求1所述的一类治疗用细胞，其中所述人T细胞获自脐带血。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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