CN104404133A - 与猪生长速度相关的snp标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与猪生长速度相关的SNP标记及其应用，其位于猪LXRα基因第5外显子的201bp处，此处碱基为A的猪的生长速度显著高于此处碱基为C的猪的生长速度。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与猪生长速度相关的SNP标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测猪的基因型，根据基因型进行生长速度快的优势猪品种的选育，从而加快猪的育种进程。

Description

与猪生长速度相关的SNP标记及其应用
技术领域
本发明属于猪分子标记遗传育种领域，具体地说，涉及一种与猪生长速度相关的SNP标记及其应用。
背景技术
养猪业是我国畜牧业生产的主体，其产值长期以来始终都是畜牧业总产值的第一位。随着人们生活水平的提高，对肉食品的数量和质量需求不断提高，如何培育出生长速度快并且肉质风味好的猪种是当前猪育种工作的热点。
我国猪种资源丰富，为猪育种提供良好的素材，也为研究重要经济性状的基因和分子标记提供良好的材料。藏猪是我国特有的高原型猪种，体小皮薄、肉嫩味美，风味浓郁，肉质细腻、风味独特，素有“高原之珍”的美誉(刘轩，强巴央宗，王强等.藏猪繁殖性状多基因效应分析.遗传，2010，32(5):480-485)。藏猪产于我国青藏高原海拔2500～4300m区域，对高原低氧、低温和粗放的饲养环境有较强的适应性，是发展我国高海拔地区养猪业的重要品种资源。滇南小耳猪是云南省西双版纳州小型地方品种，具有适应热带雨林的区高温潮湿的生态环境，早熟易肥、屠宰率高、抗逆性强、皮薄骨细、肉质鲜嫩、营养丰富等优点(马俊松，马启文，段勇，连林生.原生态养殖版纳小耳猪肥育性能、胴体及肉质测定.养猪，2009，(2)：37-38)。藏猪和滇南小耳猪均属于小型地方品种，是研究猪生长和肉质性状基因的良好材料。
随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标记辅助选择的研究被广泛开展，并在畜禽育种中应用，产生了巨大的影响。生长性状是猪育种中选择的主要目标之一，不同品种或类型的猪生长速度有明显的差别。从分子水平上鉴定影响生长速度的基因或标记是目前猪功能基因研究的热点之一(姜运良，李宁，杜立新，吴常信.猪肌肉生长抑制素基因5’调控区T→A突变与生长性状的关系分析.遗传学报.2002，29(5):413～416；Aslan O,Hamill R,Davey G,McBryan J,Mullen A,Gispert M,Sweeney T:Variation in theIGF2gene promoter region is associated with intramuscular fat content inporcine skeletal muscle.MolBiol Rep，2012,9(4):4101–4110)。研究者曾通过对基因的多态性与生长性状的关联分析，认为生长激素基因(Paszek A A，Wilkie P J，Wilkie P J，Flickinger G H，et al.Intervalmapping of growth in divergent swine cross.MammGenome.1999，10(02)：117～122；Bidanel J P，Milan D，Iannuccelli N，et al.Detectionof quantitative trait loci for growth and fatness in pigs.Genet SelEvol.2001，5-6，33(03)：289～309；LEE S J，McPherron A C.Myostatinand the control of skeletal muscle mass.CurrOpin Genet Dev.1999，9(05)：604-607)、类胰岛素生长因子II基因(Burgos C,Galve A,MorenoC,et al.The effects of two of IGF2on fat content in pig carcasses andpork.Meat Sci,2012,90(2):309-313)、PIT1基因(Yu T P，Schmitz C B，Rothschild M F，Tuggle C K.Association of PIT1polymorphisms withgrowth and carcass traits in pigs.J Anim Sci.1995,73(05):1282～1288)、MC4R基因(Kim K S，Larsen N，Short T，et al.Amissense variant of the porcine melanocortin-4receptor(MC4R)gene isassociated with fatnsee growth,and feed intake traits.Mamm Genome.2000，11:131～135)和瘦素受体(Kennes Y M，Murphy B D，PothierF，Palin M F.Characterization of swine leptin(LEP)polymorphisms andtheir association with production traits.Anim Genet.2001,32(04):215-218)等与猪的生长速度有关。但目前，在猪分子育种实践中仍然缺少功能明确、效应显著主效基因和分子标记。
肝X受体(包括LXRα和LXRβ)是核激素受体超家族的成员，在动物的肝脏、脂肪组织和骨骼肌中表达水平较高(Joyce J.Repa,Guosheng Liang,JiafuOu,et al.Regulation of mouse sterol regulatoryelement-binding protein-1c gene(SREBP-1c)by oxysterol receptors,LXRαand LXRβ[J].Mol CellBiol,2000,14:2819～2830)，对骨骼肌细胞内脂肪沉积起重要作用(George E.O.Muscat,Brandee L.Wagner,JinzhaoHou,et al.Regulation of cholesterol homeostasis and lipidmetabolism in skeletal muscle by liver X receptors[J].JBiolChem,2002,277,40722～40728)。Malek等(MassoudMalek,Jack C.M.Dekkers,Hakkyo K.Lee,et al.A molecular genome scan analysis toidentify chromosomal regions influencing economic traits in the pig.I.Growth and body composition[J].MammGenome,2001,12(8):630～636)报道，猪眼肌面积、大理石纹的QTL和背最长肌总脂肪含量的QTL在LXRα和LXRβ基因区域。Yu等发现猪LXRα基因Exon 2的Bsl I位点多态性与瘦肉率相关(M.Yu,B.Geiger,N.Deeb,et al.Liver X receptoralpha and beta genes have the potential role on loin lean and fat content inpigs[J].J Anim Breed Genet，2006(123)：81～88)。李庆岗等(李庆岗,王志秀,张博等.淮猪新品系LXRα基因Bsl I位点多态性及其与生长性能的相关性分析[J].养猪,2013,5:46～48)进一步分析发现LXRα基因Exon2-Bsl I基因型猪生长速度相关。祝继原等(祝继原,刘娣,俄广鑫等.猪LXRα基因多态性及其与生长性状的相关性分析[J].东北农业大学学报,2011,42(3):127～130.)发现猪LXRα基因Intron2内一个SNP对法系长白猪个体的出生胸围有显著影响。然而，目前已经报道的猪LXRα基因多态位点，要么基因型效应不高，要么检测方法不够准确方便。因此，需要继续对该基因进行功能SNP位点的筛选和鉴定，开发快速准确的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种与猪生长速度相关的SNP标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明将猪LXRα基因作为生长相关的候选基因，采用PCR测序技术筛选不同类型猪群体间差异的SNP位点，建立了快速检测方法，在品种间和品种内鉴定SNP位点与猪生长速度的相关性，获得了影响猪生长性状的SNP位点及基因型效应。
本发明的一种与猪生长速度相关的SNP标记，其位于猪LXRα基因第5外显子的201bp处(或如SEQ ID No.1所示序列的172bp处)，此处碱基为A的猪的生长速度显著高于此处碱基为C的猪的生长速度。
本发明还提供用于检测所述与猪生长速度相关的SNP标记的引物，包括正向引物F5’-AAGAAACTGAAGCGGCAAGAG-3’和反向引物R5'-ATCGCAGAGGTCTTTAGGAGG-3'。
本发明还提供所述与猪生长速度相关的SNP标记在鉴定快速生长的优势猪品种中的应用，其包括步骤：
1)提取待测猪的基因组DNA；
2)以待测猪的基因组DNA为模板，利用引物F和R，通过PCR反应扩增出猪LXRα基因462bp片段；
3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中172bp处的碱基为A，则待测猪属于快速生长的优势猪品种。
PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：100ng/μL模板DNA 1μL，5pmol/μL引物F和R各1μL，10mmol/L dNTP mix 2.0μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.5μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，余量为水。
PCR反应使用的条件为：95℃5分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃20秒，36个循环；72℃7分钟。
检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为：用内切酶Taq I对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果为两条带，则判定基因型为AA型，待测猪属于生长快速的优势猪品种；检测结果出现三条带，则判定基因型为CC型，待测猪属于普通品种；检测结果为四条带，则判定基因型为AC型，待测猪属于生长快速的优势猪品种。
本发明还提供含有上述引物F和R的用于检测猪生长速度的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明进一步提供所述与猪生长速度相关的SNP标记在猪分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供了一种与猪生长速度相关的SNP标记及其应用，既采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与猪生长速度相关的SNP标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测猪的基因型，根据基因型进行生长速度快的优势猪品种的选育，从而加快猪的育种进程。
本发明优点在于：(一)本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于猪的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行筛选，可大大缩短世代间隔，加快猪的育种进程；(二)检测方法快速、准确。
附图说明
图1为本发明实施例1中猪LXRα基因Exon5位置测序图。
图2为本发明实施例2中猪LXRα基因Exon5扩增结果；琼脂糖胶浓度为1％；图中Marker为DM2000Plus；1-12泳道片段大小均为462bp。
图3为本发明实施例2中猪LXRα基因PCR-Taq I-RFLP检测结果；琼脂糖胶浓度为3％；图中Marker为DM2000Plus；泳道1、2、3、6、7、9、10、13、14为AA基因型；泳道4、5、8、11、12为AC基因型；泳道15、16为CC基因型。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 猪LXRα基因SNP位点的筛选
选择中国地方品种“藏猪”(采自西藏农牧学院教学实习牧场)、
“滇南小耳猪”(采自云南省西双版纳州滇南小耳猪资源保护场)和引进品种“大约克猪”(采自安徽科鑫养猪育种有限公司)的耳组织样本，采用苯酚/氯仿法提取组织基因组DNA。
从NCBI上下载猪LXRα基因序列(GenBank登录号：NC_010444.3)，利用软件Primer Premier 5.0，根据从NCBI上下载的LXRα基因的DNA序列，设计以下引物：
正向引物F：5'-ATCTCTTCCTTGTCTTTACCC-3'
反向引物R：5'-CAATCCCTTTGTGATCTCAG-3'
用上述引物在藏猪、滇南小耳猪、大约克猪基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，其中10×PCR反应缓冲液2.5μL，10mmol/L dNTP mix 2.0μL，5pmol/μL的正反向引物各1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板1μL(DNA约100ng)，加dd H2O至25μL。PCR反应条件为：第1步95℃变性5min；第2步95℃变性30s；第3步58℃复性30s；第4步72℃延伸30s；重复第2至第4步36个循环；然后72℃延伸7min，最后降温至4℃保存。
对上述3个猪种的PCR产物经Gel Extraction Kit试剂盒(购自上海生物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作)纯化。每个猪种分别选10个个体进行PCR扩增，每个体的PCR产物各取8μL，混池成一个样本进行测序(北京诺赛生物科技公司)。扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
三个猪种的测序结果经Chromas和DNAMAN软件比对，在如SEQID No.2所示的序列中第323bp处存在一个A碱基到C碱基的突变(图1)，该位点位于LXRα基因外显子5区域的第201bp处，因此记为Exon5-A201C。经序列分析LXRα基因Exon5-A201C为错义突变，导致编码蛋白的氨基酸由丙氨酸突变为丝氨酸。
实施例2 猪LXRα基因Exon5-A201C位点PCR-RFLP检测方法的建立
为了快速方便的检测猪LXRα基因Exon5-A201C处多态性，经序列限制性内切酶分析，发现该位点突变可以被Taq I内切酶(TCGA)识别。针对Exon5-A201C突变位点的位置，根据LXRα基因序列(GenBank登录号：NC_010444.3)，利用软件Primer Premier 5.0设计新的扩增引物，引物序列为：
正向引物F：5'-AAGAAACTGAAGCGGCAAGAG-3'
反向引物R：5'-ATCGCAGAGGTCTTTAGGAGG-3'
用该对引物对藏猪、滇南小耳猪、大约克猪等基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，其中10×PCR反应缓冲液2.5μL，10mmol/L dNTP mix 2.0μL，5pmol/μL的引物各1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板1μL(DNA约100ng)，加dd H2O至25μL。PCR反应条件为：第1步95℃变性5min；第2步95℃变性30s；第3步58℃复性30s；第4步72℃延伸20s；重复第2至第4步36个循环；然后72℃延伸7min，最后降温至4℃保持。
PCR扩增产物用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察PCR扩增效果，可见到片段大小为462bp的清晰条带(图2)。该PCR产物用Taq I内切酶酶切，反应体系为：10×酶切缓冲液1μL，Taq I内切酶0.25μL(浓度为10U/μL)，PCR产物4μL，加dd H2O至10μL。65℃酶切4-8h。然后，将得到的酶切产物在3％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察(图3)，判断基因型。当扩增片段的172bp处碱基均为C时，Taq I内切酶可识别该位点，可将PCR扩增片段切成三个片段，长度分别为290bp，113bp和58bp，该基因型记为CC型；当172bp处的碱基都为A时，PCR扩增片段切成两个片段，长度分别为348bp和113bp，该基因型记为AA型；当172bp处既含有C碱基又含有A碱基时，即凝胶电泳中含有四条带，长度分别为348bp，290bp，113bp和58bp，该基因型记为杂合型AC型。
实施例3 与猪生长速度相关的SNP标记在不同猪群中的多态性检测
采集藏猪(西藏林芝工布江达县)、滇南小耳猪(云南西双版纳)、大蒲莲黑猪(山东嘉祥)、大约克猪(安徽科鑫养猪育种有限公司)、长白猪(北京中顺景盛养殖有限公司)和杜洛克猪(安徽科鑫养猪育种有限公司)耳组织样品，采用苯酚/氯仿法提取猪个体基因组DNA样品。
采用实施例2中建立的PCR-RFLP技术，测定藏猪个体LXRα基因Exon5-A201C的PCR-Taq I-RFLP基因型，检测结果如表1所示。
表1猪LXRα基因Exon5-A201C位点多态性分布
藏猪、滇南小耳猪、大蒲脸猪均属生长速度慢的中国地方猪品种，生长速度低于引进猪种。表1中可见这些中国地方猪种LXRα基因Exon5-A201C位点优势基因型为CC，等位基因C频率与长白猪、大约克猪和杜洛克猪差别很大。生长速度较快的猪种(大白、长白、杜洛克)在该位点的优势基因型均为AA；而在我国地方小型猪种(藏猪和滇南小耳猪)的优势基因型为CC，大蒲脸黑猪优势基因型为AC。由此初步判断Exon5-A201C位点AA型为生长速度快的基因型，CC型为生长速度慢的基因型。结果表明该基因位点的基因型和等位基因分布在不同生长性能的猪群间差异明显，可能与生长性能相关。
实施例4 淮猪新品系LXRα基因型与生长速度的关联分析
采集117头淮猪新品系(采自安徽科鑫养猪育种有限公司，为该新品系的4世代群体)耳组织样品，个体间无亲缘关系，所有个体测定和计算达30kg体重的日龄和达90kg体重的日龄2个生长速度性状指标(表2)。
表2淮猪新品系生长速度性状指标
采用实施例2中建立的PCR-RFLP技术测定117头淮猪新品系的LXRα基因Exon5-A201C位点的基因型，结果见表3。淮猪新品系群体中LXRα基因Exon5-A201C位点出现的3种基因型中AA型频率58.11％，CC型频率4.27％，AC型频率较低，为37.6％。
表3淮猪新品系4世代LXRα基因Taq Ⅰ基因型分布
对淮猪新品系群体中LXRα基因Exon5-A201C位点基因型与生长速度性状进行了相关性分析，结果见表4。CC型猪的30kg日龄和90kg日龄均比CA型猪大，说明CC型猪的早期(30kg前)和生长期(30kg-90kg)的生长速度均低于CA型猪，CC型猪比CA型猪推迟3.4天达到30kg体重，推迟31.5天达到90kg体重，可见等位基因C是生长速度慢的分子标记，可以用于猪分子标记辅助育种。
表4淮猪新品系4世代LXRα基因Exon5-A201C位点不同基因型对生长性能的效应分析
注：CC,CA代表两种基因型，n代表统计个数，表中数值为平均数±标准误
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种与猪生长速度相关的SNP标记，其特征在于，其位于猪LXRα基因第5外显子的201bp处，此处碱基为A的猪的生长速度显著高于此处碱基为C的猪的生长速度。
2.用于检测权利要求1所述与猪生长速度相关的SNP标记的引物，其特征在于，包括正向引物F5’-AAGAAACTGAAGCGGCAAGAG-3’和反向引物R5'-ATCGCAGAGGTCTTTAGGAGG-3'。
3.权利要求1所述与猪生长速度相关的SNP标记在鉴定快速生长的优势猪品种中的应用，其包括步骤：
1)提取待测猪的基因组DNA；
2)以待测猪的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物F和R，通过PCR反应扩增出猪LXRα基因462bp片段；
3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中172bp处的碱基为A，则待测猪属于快速生长的优势猪品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：100ng/μL模板DNA1μL，5pmol/μL引物F和R各1μL，10mmol/L dNTP mix2.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，余量为水。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的条件为：95℃5分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃20秒，36个循环；72℃7分钟。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为：用内切酶Taq I对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果为两条带，则判定基因型为AA型，待测猪属于生长快速的优势猪品种；检测结果出现三条带，则判定基因型为CC型，待测猪属于普通品种；检测结果为四条带，则判定基因型为AC型，待测猪属于生长快速的优势猪品种。
7.含有权利要求2所述引物的用于检测猪生长速度的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
10.权利要求1所述与猪生长速度相关的SNP标记在猪分子标记辅助育种中的应用。
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