CN104387481A

CN104387481A - 一种熟附子多糖的提取方法及其新用途

Info

Publication number: CN104387481A
Application number: CN201410566573.0A
Authority: CN
Inventors: 李湧健; 陈嘉璐; 高静东; 张晓迪; 吴士良; 徐岚; 刘春亮
Original assignee: Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2015-03-04

Abstract

本发明公开了一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤：（1）预处理，得到滤液与滤渣；（2）滤渣加入超纯水继续煎煮小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并；（3）将合并后溶液于蒸发至溶液剩余10%～20%，转移至烧杯，冷却至室温；（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌；（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在烘干，得到熟附子多糖粉末；所述熟附子多糖具备良好的抗肿瘤作用，并且低毒，用于制备抗肿瘤药物；本发明的熟附子多糖的提取方法，该提取方法的预处理方法在传统的水浸沸煮的基础上进行了优化，大大提高提取效率。

Description

一种熟附子多糖的提取方法及其新用途

技术领域

本发明涉及一种多糖的提取方法及其新用途，尤其涉及一种熟附子多糖的提取方法及其用于制备抗肿瘤药物的新用途，属于天然药物技术领域。

背景技术

以四川江油为道地基点县，除四川江油县（现为市）等为附子的传统产区外，全国共有四川、陕西、贵州、湖南、湖北、甘肃、云南、广西、江西、安徽等10个省区的336个县市为附子适宜产区，适宜产区面积总和为294057．69km2。运用《中药材产地适宜性分析地理信息系统》（TCMGIS-Ⅰ），分析了附子的全国适宜产地。结果表明按附子药材生长所需要的气候、土壤条件分析。四川凉山州布拖县由于地处高原，气候较为寒冷，植株生产周期更长，有效成分的含量更高。现布拖附子的产量已占全国65%以上，2008年，布拖附子也被增加为道地药材。

近年来，肿瘤已经成为威胁人类健康的第一大疾病，对于肿瘤的治疗仍然以传统的细胞毒类药物为主，中药具备毒副反应低的特点已被逐步重视。近年来，国家日益重视中药现代化的投入，在传统的重要煎熬等治疗手段的背景下，结合现代分离提取工艺，获得有效成分。药用多糖的研究始于20 世纪50 年代末对微生物多糖抗癌效果的发现。科学家们从大量的药理和临床研究发现从天然产物中分离出来的多糖往往是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞而对正常细胞没有毒副作用。多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视，这已成为新药研究的热点之一。

本发明通过优化的熟附子多糖提取方法，将获得的熟附子多糖产物进行一系列鉴定，并通过药理实验对熟附子多糖的毒性作用和抗肿瘤作用进行研究，证明其可以用于制备抗肿瘤药物。

发明内容

针对上述存在的技术问题，本发明的目的是：提出了一种提取效率高的熟附子多糖的提取方法及其用于制备抗肿瘤药物的新用途。

本发明的技术解决方案是这样实现的：一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）将熟附子原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯水1800mL～2200 mL进行高温超声处理25～35分钟，收集滤液。

（2）滤渣加入超纯水1800mL～2200 mL继续煎煮1.5～2.5小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并。

（3）将合并后溶液于75℃～85℃蒸发至溶液剩余10%～20%，转移至烧杯，冷却至室温。

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为80%～90%。

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀22～24小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在60℃～70℃烘干，得到熟附子多糖粉末。

一种熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，所述熟附子多糖具备良好的抗肿瘤作用，并且低毒，用于制备抗肿瘤药物。

优选的，通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的KM小鼠在同一时间点体重与正常对照组无差异（P>0.05）。

优选的，通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的KM小鼠在解剖后的动物肝脏系数和脾脏系数与正常对照组无差异（P>0.05）。

优选的，通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的平均瘤重较模型组有显著降低（P<0.001）。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明的熟附子多糖的提取方法，该提取方法的预处理方法在传统的水浸沸煮的基础上进行了优化，将原料进行高速粉碎得到粉末后，再结合高温超声处理，有助于药材中的有效成分分离，大大提高提取效率。熟附子多糖具备良好的抗肿瘤作用，并且低毒，因此可以用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：

附图1为熟附子多糖的红外光谱鉴定图；

附图2为熟附子多糖对正常小鼠体重的影响的实验统计图；

附图3为熟附子多糖对正常小鼠脏器系数的影响的实验统计图；

附图4为熟附子多糖对荷瘤小鼠体重的影响的实验统计图；

附图5为熟附子多糖抗肿瘤作用效果的实验统计图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步说明。

1、熟附子多糖的提取方法

实施例1：一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）将熟附子原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯水1800mL进行高温超声处理25分钟，收集滤液。

（2）滤渣加入超纯水1800mL继续煎煮1.5小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并。

（3）将合并后溶液于75℃蒸发至溶液剩余10%，转移至烧杯，冷却至室温。

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为80%。

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀22小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在60℃烘干，得到熟附子多糖粉末。

实施例2：一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）将熟附子原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯水2000 mL进行高温超声处理30分钟，收集滤液。

（2）滤渣加入超纯水2000mL继续煎煮2小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并。

（3）将合并后溶液于80℃蒸发至溶液剩余15%，转移至烧杯，冷却至室温。

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为85%。

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀23小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在65℃烘干，得到熟附子多糖粉末。

实施例3：一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）将熟附子原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯水2200 mL进行高温超声处理35分钟，收集滤液。

（2）滤渣加入超纯水2200 mL继续煎煮2.5小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并。

（3）将合并后溶液于85℃蒸发至溶液剩余20%，转移至烧杯，冷却至室温。

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为90%。

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀24小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在70℃烘干，得到熟附子多糖粉末。

上述提取方法的实施例，预处理方法在传统的水浸沸煮的基础上进行了优化，将原料进行高速粉碎得到粉末后，再结合高温超声处理，有助于药材中的有效成分分离，大大提高提取效率。

2、熟附子多糖总含量的测定

首先进行5%苯酚的配制，方法为称取12.5 g苯酚用超纯水定容至250 mL。然后进行标准溶液的配制，方法为准确称取100 mg葡萄糖，定容至100 mL，得到葡萄糖浓度为1000 mg/L的储备液。分别精密吸取储备液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL容量瓶中，得到浓度为10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L的系列标准溶液。准备样品，方法为准确称取提取的熟附子多糖粉末10 mg，用超纯水定容至100 mL，80℃水浴溶解。进行样品含量测定，分别取系列标准溶液、样品溶液及空白（以超纯水作空白）1 mL，于具塞比色管中，加入1 mL 5%的苯酚，摇匀，垂直迅速加入3 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴15分钟。取出后迅速冷却。在490 nm波长下进行测定。以吸光度A对浓度C回归得方程： A = 0.00794C + 0.01559，r = 0.99。测得提取粉末总糖含量为89.6%。熟附子多糖得率为13.4%。

3、熟附子多糖的鉴定

借助红外光谱和紫外光谱测定技术，对熟附子多糖成分进行鉴定。红外光谱鉴定借助Thermo NICOLET is10 FTIR进行。方法为取干燥后的粉末约1 mg与100 mg KBr固体粉末在玛瑙研钵中研磨均匀，压片后在400～4000cm-1区波数范围内进行红外光谱扫描。为了判断多糖中核酸和蛋白质杂质的成分，利用紫外光谱进行多糖的鉴定，借助贝克曼DU800紫外分光光度计对多糖样本进行检测。结果如图1和下表所示：

4、熟附子多糖对小鼠毒性试验

选择KM小鼠24只，基于体重随机化区层分组（分组之日记做day0），分为2组：阴性对照组、熟附子多糖（2g/kg）；每组12只，雌、雄各半。采用单次口服给药，给药体积为20mL/kg，给药后观察7天。期间测体重及记录临床症状等指标，观察结束后解剖动物，称量肝脏重量和脾脏重量，计算肝脏系数和脾脏系数。图2中可以看出，多糖给药组动物在同一时间点体重与正常对照组无差异（P＞0.05），说明附子多糖以2g/kg高剂量给药对动物体重没有影响，结合图3进一步判断，各给药组在解剖后对动物肝脏系数和脾脏系数均无差异（P＞0.05），这充分说明了熟附子多糖对小鼠无毒副作用。

5、熟附子多糖的抗肿瘤作用

为了研究熟附子多糖的抗肿瘤作用，将熟附子多糖以1000mg/kg剂量给药。阳性对照药物选择阿霉素。

小鼠肿瘤模型利用肝癌H22接种获得，首先从液氮中复苏H22腹水瘤细胞，将0.5 mL细胞注射至生长状况良好的KM小鼠腹腔。1周后取腹水生长良好的小鼠，安乐死后抽取腹水，腹水无血方可用于接种实验。选择80只KM小鼠，雌雄各半，动物经体重随机化区层分为3组后，将0.1mL腹水瘤源细胞接种至小鼠腋窝处皮下，并开始给药，每日观察荷瘤鼠生存状况和瘤子大小情况。连续给药7-10后动物进行安乐死，剥离肿瘤并称重拍照，计算抑瘤率。计算公式IR%=1-T/C%，T为治疗组平均瘤重，C为模型组平均瘤重。

图4可以看出，阿霉素给药组荷瘤动物体重在给药后期出现体重下降的现象，说明阿霉素毒性作用较强，这是由于细胞毒类抗肿瘤药物的严重毒性反应所致；而熟附子多糖组和阴性对照组动物体重增长趋势基本一致。图5可以看出，与模型组比较，各给药组平均瘤重均显著低于模型组平均瘤重（P<0.001），熟附子抗肿瘤作用明显。

综上所述，熟附子多糖具备良好的抗肿瘤作用，并且低毒，因此可以用于制备抗肿瘤药物。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种熟附子多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将熟附子原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将粉碎后的粉末加入超纯水1800mL～2200 mL进行高温超声处理25～35分钟，收集滤液；

（2）滤渣加入超纯水1800mL～2200 mL继续煎煮1.5～2.5小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并；

（3）将合并后溶液于75℃～85℃蒸发至溶液剩余10%～20%，转移至烧杯，冷却至室温；

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为80%～90%；

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀22～24小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。

2.滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在60℃～70℃烘干，得到熟附子多糖粉末。

3.一种熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：所述熟附子多糖具备良好的抗肿瘤作用，并且低毒，用于制备抗肿瘤药物。

4.根据权利要求2所述的熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的KM小鼠在同一时间点体重与正常对照组无差异（P>0.05）。

5.据权利要求2所述的熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的KM小鼠在解剖后的动物肝脏系数和脾脏系数与正常对照组无差异（P>0.05）。

6.据权利要求2所述的熟附子多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：通过动物实验得出：熟附子多糖给药组的平均瘤重较模型组有显著降低（P<0.001）。