CN101735330A - 一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途 - Google Patents
一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101735330A CN101735330A CN200910192993A CN200910192993A CN101735330A CN 101735330 A CN101735330 A CN 101735330A CN 200910192993 A CN200910192993 A CN 200910192993A CN 200910192993 A CN200910192993 A CN 200910192993A CN 101735330 A CN101735330 A CN 101735330A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- yew
- polysaccharide
- organic solvent
- preparation
- degreasing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明涉及一种南方红豆杉多糖的提取方法及其用途。其步骤包括:红豆杉经有机溶剂脱脂、热水提取,乙醇沉淀,Sevag法除蛋白后,透析,冷冻干燥后得到红豆杉多糖。得到的红豆杉多糖经硫酸-苯酚法测定糖含量,凝胶分子排阻色谱法测定分子量分布,凯式定氮法测定氮含量。所得红豆杉多糖对多种癌症具有缓解和治疗作用。
Description
技术领域:
本发明涉及一种红豆杉多糖的制备方法,具体的说是一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途。
技术背景:
红豆杉是当前世界上研究最热门的药用植物之一,现在围绕红豆杉的化学成分所作的研究当中,绝大多数集中在紫杉烷类化合物的研究上,对非紫杉烷类化合物,特别是对大极性成分之一——多糖的关注相对较少。多糖本身是一种重要的生物活性物质,具有广泛的药理活性,从多糖组分着手,寻找红豆杉中其它具有优良生物活性的成分,是一个极具潜力的研究领域,多糖研究已成为天然药物学和保健食品学的研究热点问题之一,它既是寻找天然活性药物分子的有效途径,也是保健食品功能因子的研究项目之一。
发明内容:
本发明的目的是提供一种具有肿瘤治疗作用的中草药有效部位——红豆杉多糖的制备方法与其药物应用。通过该制备方法制备得到的红豆杉多糖以苯酚-硫酸法测得总多糖>90%,以凯式定氮法测定,其含氮量<1%,分子量分面范围为:12.9KDa-74.5KDa。所制备的红豆杉多糖可制成软膏、凝胶、片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆剂、滴丸、注射剂等制剂。
本发明提供的技术方案如下:
一种具有肿瘤治疗作用的中草药有效部位——红豆杉多糖的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)脱脂
粉碎的红豆杉干燥枝叶,以有机溶剂脱脂,将脱脂过的原料晾干,挥发除去有机溶剂。
2)提取
加入蒸馏水提取,水提取液过滤后,离心取上清液。上清液浓缩,将浓缩的水提取液用乙醇调节至含醇量为70%,低温静置过夜后离心,取沉淀,用水复溶,冷冻结冰后,冻干。
3)除蛋白
将冻干的提取物用水重新溶解后,使用Sevag法或酶解法除蛋白。
4)除有机溶剂
除蛋白后的溶液装入透析袋进行透析以除去残留的有机溶剂。透析后的多糖溶液浓缩后冷冻干燥得到粗多糖。
根据上述制备方法,其特征在于更为具体的步骤为:
1)脱脂
粉碎的红豆杉干燥枝叶,以有机溶剂脱脂,将脱脂过的原料晾干,挥发除去有机溶剂。
2)提取
加入蒸馏水提取,水提取液过滤后,离心取上清液。清液减压浓缩,将浓缩的水提取液用乙醇调节至含醇量为70%,低温静置过夜后离心,取沉淀,用水复溶,冷冻结冰后,冻干。
3)除蛋白
将冻干的提取物用水重新溶解后,使用Sevag法或酶解法除蛋白。
4)除有机溶剂
除蛋白后的溶液装入透析袋进行透析以除去残留的有机溶剂。透析后的多糖溶液浓缩后冷冻干燥得到粗多糖。
以本发明所提供的制备方法简单,适于工业化生产,通过该制备方法制备得到的红豆杉多糖以苯酚-硫酸法测得总多糖>90%,以凯式定氮法测定,其含氮量<1%,分子量范围为12.9KDa-74.5KDa,经过体内外试验证明其具有很好的抗肿瘤作用,可在制备治疗各种肿瘤的药物中应用。可根据需要制成软膏、凝胶、片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆剂、滴丸、注射剂等制剂。
具体实施方式:
实施例1:红豆杉多糖的提取
取红豆杉干燥枝叶200g,粉碎后过20目筛,使用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)除脂后,在80℃进行热水提取,按照1∶3加入无水乙醇,在4℃醇沉24小时后,离心取沉淀,复溶后使用Sevag法除蛋白,将除蛋白后的糖溶液透析后冻干,得到红豆杉多糖26.04g,为浅褐色,产率为13.02%。取提取得到的红豆杉多糖,按照苯酚-硫酸法测定其糖含量,测定结果为93.2%,测得红豆杉多糖的分子量分布为12.9KDa-68.5KDa。
实施例2:红豆杉多糖的提取
取红豆杉干燥枝叶200g,粉碎后过20目筛,使用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)除脂后,在90℃进行热水提取,按照1∶3加入无水乙醇,在4℃醇沉24小时后,离心取沉淀,复溶后使用酶解法除蛋白,将除蛋白后的糖溶液透析后冻干,得到红豆杉多糖25.48g,产率为12.74%。取提取得到的红豆杉多糖,按照苯酚-硫酸法测定其糖含量,测定结果为91.24%。取红豆杉多糖,按照凝胶排阻色谱的方法测定多糖的分子量分布。测得红豆杉多糖的分子量分布为14.5KDa-74.5KDa。通过凯式定氮测定红豆杉多糖的含氮量为0.856%。
实施例3:红豆杉多糖的提取
取红豆杉干燥枝叶1kg,粉碎后使用石油醚∶乙酸乙酯(1∶2)除脂,在80℃进行水提取,按照1∶3加入无水乙醇,在4℃放置24小时后,离心取沉淀,复溶后使用酶解法除蛋白,将除蛋白后的糖溶液透析后冻干,得到红豆杉多糖114.2g,产率为11.4%。凯式定氮得含氮量为0.81%。糖含量为93.05%,分子量分布为13.2Da-71.2KDa。
试验例1:红豆杉多糖的分子量分布
取上述实施例所制备的红豆杉多糖,按照凝胶排阻色谱的方法测定多糖的分子量分布。实验方法如下:
制作分子量标准曲线,选用凝胶柱层析填料Sephacyl S-300测定粗多糖分子量分布。分别称取5mg已知分子量的标准葡聚糖T3、T70、T500,溶于0.5ml洗脱液中,分次上柱,以蒸馏水作为洗脱液,流速18ml/h,自动部分收集器收集洗脱液,每管收集10min。用苯酚-硫酸法跟踪检测多糖洗脱液出峰情况,计算每种标准葡聚糖出峰的洗脱体积Ve。以已知分子量为200万的蓝色葡聚糖标定凝胶柱的空体积Vo,以葡萄糖确定凝胶柱的总体积Vt。以有效分配系数Kav为纵坐标,以1gMw为横坐标做标准曲线,其中分配系数Kav可由以下公式求得:
Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)
其中Ve:待测样品的糖峰洗脱体积;Vo:凝胶过滤色谱层析柱的空体积;Vt:凝胶过滤色谱层析柱的总体积。
测定多糖分子量分布情况:分别称取红豆杉粗多糖TMP 5mg,溶于0.5ml洗脱液后分次上柱,测定多糖糖样的分子量分布,根据所得的多糖糖样的出峰洗脱体积,代入分子量标准曲线中,计算红豆杉粗多糖的分子量分布。
结果显示:实施例1所制备得到的红豆杉多糖的分子量分布为12.9KDa-68.5KDa;实施例2所制备得到的红豆杉多糖的分子量分布为14.5KDa-74.5KDa;实施例3所制备得到的红豆杉多糖的分子量分布为13.2Da-71.2KDa。
所得红豆杉多糖,分子量分布为12.9KDa-74.5KDa。
试验例2:红豆杉多糖的对肿瘤细胞的细胞毒作用
对上述实施例所制备的红豆杉多糖,按照下述方法考察对人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60的细胞毒作用。
1、肿瘤细胞的培养
在肿瘤细胞株人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60在含体积分数为10%的小牛血清中加入RPMI 1640或DMEM培养液,置于5%CO2、37℃的培养箱中培养至对数生长期。
2、实验分组及处理
实验设1个空白对照组和6个不同浓度实验组,分别为12.5、25、50、100、200、400μg/ml。取对数生长期人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60以浓度1×104个/ml接种于25ml培养瓶培养,24h后加入前述不同浓度的多糖样品,作用48h后,胰酶消化离心,将细胞悬浮于PBS中,调浓度为1×105个/ml细胞悬液,备用。
3、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法测定
收集对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60接种于96孔板上,每个浓度设6个平行孔,在37℃,5%CO2条件下继续孵育24h,加入不同浓度的多糖溶液10μl,使终浓度分别12.5、25、50、100、200、400μg/ml,同时设阴性(0.9%NaCl)和阳性(顺铂)对照组。培养72h后,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,继续培养4h后终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入100μl二甲亚砜振荡10min,使结晶物充分溶解。用酶标免疫测定仪490nm处测定各孔光密度值A,根据公式计算抑制率:
抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%
4、MTT法测定红豆杉多糖对MCF-7细胞生长的影响:结果见表2。
表2.
5、MTT法测定红豆杉多糖对HT1080细胞生长的影响:结果见表3。
表3.
6、MTT法测定红豆杉多糖对Hela细胞生长的影响:结果见表4。
表4.
7、MTT法测定红豆杉多糖对K562细胞生长的影响:结果见表5。
表5.
8、MTT法测定红豆杉多糖对PC3细胞生长的影响:结果见表6。
表6.
9、MTT法测定红豆杉多糖对SMMC7721细胞生长的影响:见表7。
表7.
10、MTT法测定红豆杉多糖对HL-60细胞生长的影响:结果见表8。
表8
结果显示,不同浓度的红豆杉多糖溶液对人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60均有抑制作用,且抑制作用与浓度呈线性关系。
Claims (5)
1.一种红豆杉多糖的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)脱脂
粉碎的红豆杉干燥枝叶,以有机溶剂脱脂,将脱脂过的原料晾干,挥发除去有机溶剂。
2)提取
使用蒸馏水提取,水提取液过滤后,高速离心,取上清液。上清液减压浓缩,将浓缩的水提取液用乙醇调节至含醇量为70%,低温静置过夜后离心,取沉淀,用水复溶,冷冻结冰后,冻干。
3)除蛋白
将冻干的提取物用水重新溶解后,使用Sevag法或酶解法除蛋白。
4)除有机溶剂
除蛋白后的溶液装入透析袋进行透析以除去残留的有机溶剂。透析后的多糖溶液浓缩后冷冻干燥得到多糖。
根据上述制备方法,其特征在于更为具体的步骤为:
1)脱脂
粉碎的红豆杉干燥枝叶,以有机溶剂脱脂,将脱脂过的原料晾干,挥发除去有机溶剂。
2)提取
加入蒸馏水提取,水提取液过滤后,离心取上清液。清液减压浓缩,将浓缩的水提取液用乙醇调节至含醇量为70%,低温静置过夜后离心,取沉淀,用水复溶,冷冻结冰后,冻干。
3)除蛋白
将冻干的提取物用水重新溶解后,使用Sevag法或酶解法除蛋白。
4)除有机溶剂
除蛋白后的溶液装入透析袋进行透析以除去残留的有机溶剂。透析后的多糖溶液减压浓缩后冷冻干燥得到粗多糖。
2.如权利要求1所述的一种红豆杉多糖的制备方法,其特征在第(1)步骤中脱脂所用的有机溶剂为乙酸乙酯、石油醚、丙酮、乙醇。
3.如权利要求1所述的一种红豆杉多糖的制备方法,其特征在第(3)步骤中多糖的除蛋白方法为Sevag法或酶解法或者两者联合使用。
4.如权利要求1所述的一种红豆杉多糖的制备方法,其特征在于用该工艺制备得到的红豆杉多糖的含量为>90%,含N量为<1%,分子量分布范围为12.9KDa-74.5KDa。
5.如权利要求1所述的一种红豆杉多糖的制备方法,其特征在于用该工艺制备得到的红豆杉多糖对肿瘤具有治疗作用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200910192993A CN101735330A (zh) | 2009-10-12 | 2009-10-12 | 一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200910192993A CN101735330A (zh) | 2009-10-12 | 2009-10-12 | 一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101735330A true CN101735330A (zh) | 2010-06-16 |
Family
ID=42459405
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200910192993A Pending CN101735330A (zh) | 2009-10-12 | 2009-10-12 | 一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101735330A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104774276A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-07-15 | 浙江大学 | 一种红豆杉多糖及其制备方法和应用 |
CN106176837A (zh) * | 2016-08-15 | 2016-12-07 | 江苏红豆杉药业有限公司 | 一种药物组合物、其制备方法及应用 |
CN107469379A (zh) * | 2016-06-07 | 2017-12-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种样品中残留水溶性有机溶剂的去除方法 |
CN110511290A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-29 | 武汉紫杉红技术开发有限公司 | 一种具有降高尿酸作用的红豆杉多糖的制备方法及其应用 |
-
2009
- 2009-10-12 CN CN200910192993A patent/CN101735330A/zh active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104774276A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-07-15 | 浙江大学 | 一种红豆杉多糖及其制备方法和应用 |
CN107469379A (zh) * | 2016-06-07 | 2017-12-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种样品中残留水溶性有机溶剂的去除方法 |
CN107469379B (zh) * | 2016-06-07 | 2020-03-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种样品中残留水溶性有机溶剂的去除方法 |
CN106176837A (zh) * | 2016-08-15 | 2016-12-07 | 江苏红豆杉药业有限公司 | 一种药物组合物、其制备方法及应用 |
CN106176837B (zh) * | 2016-08-15 | 2020-02-21 | 江苏红豆杉药业有限公司 | 一种药物组合物、其制备方法及应用 |
CN110511290A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-29 | 武汉紫杉红技术开发有限公司 | 一种具有降高尿酸作用的红豆杉多糖的制备方法及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102417544B (zh) | 一种紫阳富硒绿茶含硒多糖及其制备方法和用途 | |
CN108530551B (zh) | 贝母多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN105859903B (zh) | 一种北沙参多糖及其制备方法和应用 | |
CN109276576A (zh) | 白肉灵芝多糖在制备抗肿瘤药物中的用途 | |
CN102977114B (zh) | 桑黄中单体成分-纤孔菌素a及其制备方法和应用 | |
CN103316096A (zh) | 一种黑种草子总黄酮提取物及其制备方法和用途 | |
CN102617718B (zh) | 一种谷糠抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用 | |
CN101735330A (zh) | 一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途 | |
CN104042623A (zh) | 一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用 | |
CN107722131B (zh) | 一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖及其制备方法和应用 | |
CN103113489B (zh) | 一种新疆骏枣多糖提纯的方法 | |
CN113667027A (zh) | 一种人参多糖组合物及其制备方法和应用 | |
CN101084979B (zh) | 一种用于癌症辅助治疗药物制剂及其制备方法 | |
CN113717296B (zh) | 一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备抗结肠癌药物中的应用 | |
Chen et al. | Liposome‐Based Delivery Systems in Plant Polysaccharides | |
CN107519327A (zh) | 一种桑黄中药组合物及其提取方法和在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN103169844B (zh) | 具有抗肺癌和肝癌作用的中药组合物 | |
CN100546601C (zh) | 水杨梅根抗肿瘤提取物及其制备方法和用途 | |
CN100393326C (zh) | 中华补血草用于制备抗肿瘤药物的用途 | |
CN104523740B (zh) | 一种石上柏多糖提取物制备方法及其应用 | |
CN104163874B (zh) | 一种桑黄多糖zdt及其制备方法 | |
CN103705550B (zh) | 一种猕猴桃素及其制备方法和应用 | |
CN103230456A (zh) | 一种中药提取物及其制备方法 | |
CN115141288B (zh) | 知母活性多糖、知母粗多糖及制备方法和应用 | |
CN113599403B (zh) | 西番莲提取物在制备防治乳腺癌药物中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100616 |