CN101735330A - 一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种南方红豆杉多糖的提取方法及其用途。其步骤包括：红豆杉经有机溶剂脱脂、热水提取，乙醇沉淀，Sevag法除蛋白后，透析，冷冻干燥后得到红豆杉多糖。得到的红豆杉多糖经硫酸-苯酚法测定糖含量，凝胶分子排阻色谱法测定分子量分布，凯式定氮法测定氮含量。所得红豆杉多糖对多种癌症具有缓解和治疗作用。

Description

一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途

技术领域：

本发明涉及一种红豆杉多糖的制备方法，具体的说是一种具有抗肿瘤作用的红豆杉多糖的制备方法及其用途。

技术背景：

红豆杉是当前世界上研究最热门的药用植物之一，现在围绕红豆杉的化学成分所作的研究当中，绝大多数集中在紫杉烷类化合物的研究上，对非紫杉烷类化合物，特别是对大极性成分之一——多糖的关注相对较少。多糖本身是一种重要的生物活性物质，具有广泛的药理活性，从多糖组分着手，寻找红豆杉中其它具有优良生物活性的成分，是一个极具潜力的研究领域，多糖研究已成为天然药物学和保健食品学的研究热点问题之一，它既是寻找天然活性药物分子的有效途径，也是保健食品功能因子的研究项目之一。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有肿瘤治疗作用的中草药有效部位——红豆杉多糖的制备方法与其药物应用。通过该制备方法制备得到的红豆杉多糖以苯酚-硫酸法测得总多糖＞90％，以凯式定氮法测定，其含氮量＜1％，分子量分面范围为：12.9KDa-74.5KDa。所制备的红豆杉多糖可制成软膏、凝胶、片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆剂、滴丸、注射剂等制剂。

本发明提供的技术方案如下：

一种具有肿瘤治疗作用的中草药有效部位——红豆杉多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)脱脂

粉碎的红豆杉干燥枝叶，以有机溶剂脱脂，将脱脂过的原料晾干，挥发除去有机溶剂。

2)提取

加入蒸馏水提取，水提取液过滤后，离心取上清液。上清液浓缩，将浓缩的水提取液用乙醇调节至含醇量为70％，低温静置过夜后离心，取沉淀，用水复溶，冷冻结冰后，冻干。

3)除蛋白

将冻干的提取物用水重新溶解后，使用Sevag法或酶解法除蛋白。

4)除有机溶剂

除蛋白后的溶液装入透析袋进行透析以除去残留的有机溶剂。透析后的多糖溶液浓缩后冷冻干燥得到粗多糖。

根据上述制备方法，其特征在于更为具体的步骤为：

1)脱脂

粉碎的红豆杉干燥枝叶，以有机溶剂脱脂，将脱脂过的原料晾干，挥发除去有机溶剂。

2)提取

加入蒸馏水提取，水提取液过滤后，离心取上清液。清液减压浓缩，将浓缩的水提取液用乙醇调节至含醇量为70％，低温静置过夜后离心，取沉淀，用水复溶，冷冻结冰后，冻干。

3)除蛋白

将冻干的提取物用水重新溶解后，使用Sevag法或酶解法除蛋白。

4)除有机溶剂

除蛋白后的溶液装入透析袋进行透析以除去残留的有机溶剂。透析后的多糖溶液浓缩后冷冻干燥得到粗多糖。

以本发明所提供的制备方法简单，适于工业化生产，通过该制备方法制备得到的红豆杉多糖以苯酚-硫酸法测得总多糖＞90％，以凯式定氮法测定，其含氮量＜1％，分子量范围为12.9KDa-74.5KDa，经过体内外试验证明其具有很好的抗肿瘤作用，可在制备治疗各种肿瘤的药物中应用。可根据需要制成软膏、凝胶、片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆剂、滴丸、注射剂等制剂。

具体实施方式：

实施例1：红豆杉多糖的提取

取红豆杉干燥枝叶200g，粉碎后过20目筛，使用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)除脂后，在80℃进行热水提取，按照1∶3加入无水乙醇，在4℃醇沉24小时后，离心取沉淀，复溶后使用Sevag法除蛋白，将除蛋白后的糖溶液透析后冻干，得到红豆杉多糖26.04g，为浅褐色，产率为13.02％。取提取得到的红豆杉多糖，按照苯酚-硫酸法测定其糖含量，测定结果为93.2％，测得红豆杉多糖的分子量分布为12.9KDa-68.5KDa。

实施例2：红豆杉多糖的提取

取红豆杉干燥枝叶200g，粉碎后过20目筛，使用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)除脂后，在90℃进行热水提取，按照1∶3加入无水乙醇，在4℃醇沉24小时后，离心取沉淀，复溶后使用酶解法除蛋白，将除蛋白后的糖溶液透析后冻干，得到红豆杉多糖25.48g，产率为12.74％。取提取得到的红豆杉多糖，按照苯酚-硫酸法测定其糖含量，测定结果为91.24％。取红豆杉多糖，按照凝胶排阻色谱的方法测定多糖的分子量分布。测得红豆杉多糖的分子量分布为14.5KDa-74.5KDa。通过凯式定氮测定红豆杉多糖的含氮量为0.856％。

实施例3：红豆杉多糖的提取

取红豆杉干燥枝叶1kg，粉碎后使用石油醚∶乙酸乙酯(1∶2)除脂，在80℃进行水提取，按照1∶3加入无水乙醇，在4℃放置24小时后，离心取沉淀，复溶后使用酶解法除蛋白，将除蛋白后的糖溶液透析后冻干，得到红豆杉多糖114.2g，产率为11.4％。凯式定氮得含氮量为0.81％。糖含量为93.05％，分子量分布为13.2Da-71.2KDa。

试验例1：红豆杉多糖的分子量分布

取上述实施例所制备的红豆杉多糖，按照凝胶排阻色谱的方法测定多糖的分子量分布。实验方法如下：

制作分子量标准曲线，选用凝胶柱层析填料Sephacyl S-300测定粗多糖分子量分布。分别称取5mg已知分子量的标准葡聚糖T3、T70、T500，溶于0.5ml洗脱液中，分次上柱，以蒸馏水作为洗脱液，流速18ml/h，自动部分收集器收集洗脱液，每管收集10min。用苯酚-硫酸法跟踪检测多糖洗脱液出峰情况，计算每种标准葡聚糖出峰的洗脱体积Ve。以已知分子量为200万的蓝色葡聚糖标定凝胶柱的空体积Vo，以葡萄糖确定凝胶柱的总体积Vt。以有效分配系数Kav为纵坐标，以1gMw为横坐标做标准曲线，其中分配系数Kav可由以下公式求得：

Kav＝(Ve-Vo)/(Vt-Vo)

其中Ve：待测样品的糖峰洗脱体积；Vo：凝胶过滤色谱层析柱的空体积；Vt：凝胶过滤色谱层析柱的总体积。

测定多糖分子量分布情况：分别称取红豆杉粗多糖TMP 5mg，溶于0.5ml洗脱液后分次上柱，测定多糖糖样的分子量分布，根据所得的多糖糖样的出峰洗脱体积，代入分子量标准曲线中，计算红豆杉粗多糖的分子量分布。

结果显示：实施例1所制备得到的红豆杉多糖的分子量分布为12.9KDa-68.5KDa；实施例2所制备得到的红豆杉多糖的分子量分布为14.5KDa-74.5KDa；实施例3所制备得到的红豆杉多糖的分子量分布为13.2Da-71.2KDa。

所得红豆杉多糖，分子量分布为12.9KDa-74.5KDa。

试验例2：红豆杉多糖的对肿瘤细胞的细胞毒作用

对上述实施例所制备的红豆杉多糖，按照下述方法考察对人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60的细胞毒作用。

1、肿瘤细胞的培养

在肿瘤细胞株人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60在含体积分数为10％的小牛血清中加入RPMI 1640或DMEM培养液，置于5％CO₂、37℃的培养箱中培养至对数生长期。

2、实验分组及处理

实验设1个空白对照组和6个不同浓度实验组，分别为12.5、25、50、100、200、400μg/ml。取对数生长期人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60以浓度1×10⁴个/ml接种于25ml培养瓶培养，24h后加入前述不同浓度的多糖样品，作用48h后，胰酶消化离心，将细胞悬浮于PBS中，调浓度为1×10⁵个/ml细胞悬液，备用。

3、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法测定

收集对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60接种于96孔板上，每个浓度设6个平行孔，在37℃，5％CO₂条件下继续孵育24h，加入不同浓度的多糖溶液10μl，使终浓度分别12.5、25、50、100、200、400μg/ml，同时设阴性(0.9％NaCl)和阳性(顺铂)对照组。培养72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，继续培养4h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入100μl二甲亚砜振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标免疫测定仪490nm处测定各孔光密度值A，根据公式计算抑制率：

抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％

4、MTT法测定红豆杉多糖对MCF-7细胞生长的影响：结果见表2。

表2.

5、MTT法测定红豆杉多糖对HT1080细胞生长的影响：结果见表3。

表3.

6、MTT法测定红豆杉多糖对Hela细胞生长的影响：结果见表4。

表4.

7、MTT法测定红豆杉多糖对K562细胞生长的影响：结果见表5。

表5.

8、MTT法测定红豆杉多糖对PC3细胞生长的影响：结果见表6。

表6.

9、MTT法测定红豆杉多糖对SMMC7721细胞生长的影响：见表7。

表7.

10、MTT法测定红豆杉多糖对HL-60细胞生长的影响：结果见表8。

表8

结果显示，不同浓度的红豆杉多糖溶液对人乳腺癌细胞MCF-7、人纤维瘤细胞HT1080、人宫颈癌细胞Hela、人慢性髓性白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC3、人肝癌细胞SMMC7721、人急性早幼粒白血病细胞HL-60均有抑制作用，且抑制作用与浓度呈线性关系。

Claims (5)

1.一种红豆杉多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)脱脂

粉碎的红豆杉干燥枝叶，以有机溶剂脱脂，将脱脂过的原料晾干，挥发除去有机溶剂。

2)提取

使用蒸馏水提取，水提取液过滤后，高速离心，取上清液。上清液减压浓缩，将浓缩的水提取液用乙醇调节至含醇量为70％，低温静置过夜后离心，取沉淀，用水复溶，冷冻结冰后，冻干。

3)除蛋白

将冻干的提取物用水重新溶解后，使用Sevag法或酶解法除蛋白。

4)除有机溶剂

除蛋白后的溶液装入透析袋进行透析以除去残留的有机溶剂。透析后的多糖溶液浓缩后冷冻干燥得到多糖。

根据上述制备方法，其特征在于更为具体的步骤为：

1)脱脂

粉碎的红豆杉干燥枝叶，以有机溶剂脱脂，将脱脂过的原料晾干，挥发除去有机溶剂。

2)提取

加入蒸馏水提取，水提取液过滤后，离心取上清液。清液减压浓缩，将浓缩的水提取液用乙醇调节至含醇量为70％，低温静置过夜后离心，取沉淀，用水复溶，冷冻结冰后，冻干。

3)除蛋白

将冻干的提取物用水重新溶解后，使用Sevag法或酶解法除蛋白。

4)除有机溶剂

除蛋白后的溶液装入透析袋进行透析以除去残留的有机溶剂。透析后的多糖溶液减压浓缩后冷冻干燥得到粗多糖。

2.如权利要求1所述的一种红豆杉多糖的制备方法，其特征在第(1)步骤中脱脂所用的有机溶剂为乙酸乙酯、石油醚、丙酮、乙醇。

3.如权利要求1所述的一种红豆杉多糖的制备方法，其特征在第(3)步骤中多糖的除蛋白方法为Sevag法或酶解法或者两者联合使用。

4.如权利要求1所述的一种红豆杉多糖的制备方法，其特征在于用该工艺制备得到的红豆杉多糖的含量为＞90％，含N量为＜1％，分子量分布范围为12.9KDa-74.5KDa。

5.如权利要求1所述的一种红豆杉多糖的制备方法，其特征在于用该工艺制备得到的红豆杉多糖对肿瘤具有治疗作用。