CN104372012A - 一种牡丹PseIF5A基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牡丹PseIF5A基因及其应用，所述牡丹PseIF5A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明将所述PseIF5A基因转入烟草中表达，获得的转基因烟草在-10℃/3h冷胁迫处理后，转基因烟草植株未发生明显的形态变化，而野生型烟草出现严重萎蔫，结果显示转基因烟草比野生型烟草具有更强的耐冷性，表明本发明的牡丹PseIF5A基因在烟草中异源表达能显著提高转基因烟草对冷胁迫的耐性。

Description

一种牡丹PseIF5A基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、生理学以及基因工程等领域，具体涉及一种牡丹PseIF5A基因及其应用，特别涉及一种在牡丹中表达的PseIF5A(牡丹真核生物翻译起始因子：Paeoniasuffruticosa Andr.，PseIF5A)的克隆，转基因载体的构建，烟草的转化，以及所述牡丹PseIF5A基因在提高转基因植物的冷胁迫抗性中的应用。

背景技术

真核生物起始因子5A(eIF5A)是真核生物中目前发现的唯一一种含有特殊氨基酸残基-赖氨酸残基(hypusine)的高度保守性蛋白质。该赖氨酸残基是通过翻译后的两步修饰而成，参与这两步修饰的酶分别是脱氧羧腐胺赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase，DHS)(EC 2.5.1.46)和脱氧羟腐胺赖氨酸羟化酶(deoxyhypusine hydroxylase，DHH)(EC1.14.99.29)。成熟的eIF5A是经过赖氨酸残基翻译后修饰才起作用。

eIF5A是最早在哺乳动物的血红细胞中被发现，因其能在体外实验中促进翻译起始阶段第一个肽键的形成，因而被命名为翻译起始因子。然而，近期的研究发现eIF5A在细胞内其实主要参与翻译的延伸过程。eIF5A虽然在真核细胞中高度保守且组成型表达，然而，有研究表明敲除eIF5A基因的细胞的蛋白合成量仍能占同类正常细胞蛋白合成量的70％，这说明eIF5A并非所有蛋白合成过程所必需的因子，而可能只是在某些特殊代谢途径中合成蛋白所需。此外，还发现eIF5A作为一种核质穿梭蛋白，从核内向胞质中转运某些特殊mRNAs并参与其翻译过程。

在植物中，已经克隆出eIF5A基因的物种有紫花苜蓿、烟草、玉米、番茄、水稻和拟南芥。Wang等人(Wang T W等，Plant Mol Biol，2003)发现抑制拟南芥和番茄的DHS基因的表达能延缓植物的衰老，这意味着eIF5A有可能参与了植物细胞的程序性死亡途径。拟南芥中已知有三个eIF5A同源基因，其中，AteIF5A-1被证明参与植物木质部的发育过程，AteIF5A-2则在细胞的生长发育及程序性死亡过程中均发挥关键作用。然而，虽然eIF5A已经被证明参与翻译延伸，mRNA转运以及细胞的生长发育和程序性死亡，但在高等植物中，对其生理生化功能的研究报道仍然甚少。

牡丹(paeonia suffructicosa)是我国特有的木本名贵花卉，是中国国花，有数千年的自然生长和两千多年的人工栽培历史。牡丹素有"国色天香"、"花中之王"的美称，是重要的园林观赏花卉之一。随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物对温度逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牡丹PseIF5A基因及其应用，将该牡丹PseIF5A基因转化烟草，可以提高转基因烟草的冷胁迫抗性。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牡丹PseIF5A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为480bp。

所述的牡丹PseIF5A基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由159个氨基酸残基组成，分子量为17335.92道尔顿，pI为6.122。

一种牡丹PseIF5A基因在提高转基因烟草的冷胁迫抗性中的应用。将本发明所述牡丹PseIF5A基因的开放阅读框连接于载体pCAMBIA11300中，获得重组表达载体pCAMBIA11300-PseIF5A，并转化农杆菌GV3101，以农杆菌浸染法(叶盘法)转化烟草叶片，得到转基因烟草。结果显示转基因烟草(pCAMBIA1300-PseIF5A)比野生型烟草(CK)具有更强的冷胁迫抗性。

在本发明中，术语“牡丹PseIF5A基因的开放阅读框”指编码完整的牡丹PseIF5A蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-477位的核苷酸序列。

本发明的有益效果：

1、本发明首次从牡丹中克隆出如SEQ ID NO.1所示的PseIF5A基因，在核苷酸水平上，PseIF5A基因与葡萄真核生物翻译起始因子基因2(eukaryotic translation initiation factor5A-2-like)基因的mRNA编码序列有80％的同源性。在氨基酸水平上，PseIF5A基因与葡萄真核生物翻译起始因子基因2蛋白质的氨基酸残基有86％的相似性。

2、本发明将所述PseIF5A基因转化烟草得到转基因(pCAMBIA1300-PseIF5A)烟草，对该转基因(pCAMBIA1300-PseIF5A)烟草进行-10℃/3h冷胁迫处理后，转基因烟草植株的形态未发生明显变化，而野生型烟草出现严重萎蔫，结果显示转基因烟草(pCAMBIA1300-PseIF5A)比野生型烟草具有更强的耐冷性，表明本发明的牡丹PseIF5A基因在烟草中异源表达能显著提高转基因烟草对冷胁迫的抗性，可见该基因与植物的耐冷性相关。

3、将本发明的牡丹PseIF5A基因转入不耐冷的牡丹品种或其它植物，可以提高转基因宿主对冷胁迫抗性，从而为获得耐冷植物新品种或改良品质提供有用基因。

附图说明

图1为本发明的牡丹PseIF5A基因在烟草中异源表达提高转基因烟草的冷胁迫耐性实验结果，其中，CK为野生型烟草，pCAMBIA1300-PseIF5A为转基因烟草。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。

实施例1 牡丹PseIF5A基因的克隆

根据葡萄eIF5A基因(登录号：XM_002285469)与沙冬青eIF5A基因(登录号：JN885967)的同源序列设计一对兼并引物：5’端兼并引物：5’-atgtcggaYgaRgaRcaYca-3’，3’端兼并引物：5’-YtacttgggRccaatRtcctt-3’。将耐冷牡丹品种‘凤丹白’的盆栽苗(五年嫁接苗)进行4℃/3h低温胁迫处理，取其嫩叶提取RNA(“Plant RNAout”试剂盒，TianDZ，中国)，逆转录成cDNA(逆转录的试剂盒为PrimeScript^TM RT Reagent Kit(TaKaRa，中国大连))。采用RT-PCR在凤丹白中扩增出480bp条带。小量胶回收法将PCR产物进行割胶回收，连接到pGEM T-Vector上，构建重组质粒pGEM T-PseIF5A。转化大肠杆菌DH5α，测序，将测序结果提交至NCBI非冗余数据库进行BLAST检索。BLAST结果表明该序列和其他物种中相应的eIF5A的序列高度保守。

实施例2 牡丹PseIF5A基因的序列信息与同源性分析

对上述获得的480bp条带进行测定，其序列如SEQ ID NO.1所示，即为本发明的牡丹PseIF5A基因的核苷酸序列。该牡丹PseIF5A基因编码蛋白质的氨基酸序列由159个氨基酸残基组成，分子量17335.92道尔顿，pI为6.122，序列如SEQ ID NO.2所示。

将上述牡丹PseIF5A基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank CDStranslations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与葡萄eukaryotic translation initiation factor 5A-2-like(真核生物翻译起始因子基因2)(LOC100247352)存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与葡萄eukaryotic translationinitiation factor 5A-2-like基因的mRNA编码序列(GeneBank AccessionNo.XM_002285469.2)有80％的同源性(参看表1)，在氨基酸水平上，它与葡萄eukaryotictranslation initiation factor 5A-2-like蛋白质的氨基酸残基有86％的相似性(参看表2)。因此，该牡丹PseIF5A基因与葡萄eukaryotic translation initiation factor 5A-2-like基因存在较高的同源性。

表1 为牡丹PseIF5A基因与葡萄eukaryotic translation initiation factor 5A-2-like的核苷酸序列的同源性比较表

其中，Query为牡丹PseIF5A基因核苷酸序列，Sbjct为葡萄eukaryotic translation initiation factor5A-2-like基因核苷酸序列(GenBank Accession No.XM_002285469.2)。

表2 为牡丹PseIF5A蛋白与葡萄eukaryotic translation initiation factor 5A-2-like蛋白的氨基酸序列的同源性比较表

其中，Query为本发明的牡丹PseIF5A氨基酸序列，Sbjct为葡萄真核生物翻译起始因子蛋白eukaryotic translation initiation factor 5A-2-like氨基酸序列(GenBank Accession No.XP_002285505.1)。相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

实施例3 牡丹PseIF5A基因在烟草中异源表达提高转基因烟草的冷胁迫耐性实验重组表达载体pCAMBIA1300-PseIF5A的构建及烟草转化

以如SEQ ID NO.1所示的牡丹PseIF5A基因的ORF设计引物，其中，正向引物序列为：5‘-ATGTCGGATGAGGAACACCA-3’，反向引物序列：5‘-TTACTTGGGGCCAATATC-3’。正向引物引入EcoR I酶切位点，反向引物引入Sac I酶切位点。以实施例1中获得的‘凤丹白’cDNA为模板，进行PCR扩增；割胶回收PCR产物，连接到pGEM T-Vector构建成重组质粒pGEM T-PseIF5A；转化大肠杆菌DH5α，PCR检测阳性克隆，提取质粒pGEM T-PseIF5A；EcoR I、Sac I双酶切质粒pGEMT-PseIF5A，电泳分离，割胶回收酶切产物的小片段，与同样经EcoR I、Sac I双酶切的植物表达载体pCAMBIA1300连接，构建pCAMBIA1300-PseIF5A重组质粒；转化大肠杆菌DH5α，PCR检测阳性克隆，并测序证明插入片段PseIF5A序列正确，无移码发生；提取质粒pCAMBIA1300-PseIF5A。

将重组表达载体质粒pCAMBIA1300-PseIF5A转化农杆菌GV3101，以农杆菌浸染法(叶盘法)转化烟草叶片；潮霉素(15mg/L)筛选阳性植株，获得T0代转基因(pCAMBIA1300-PseIF5A)烟草植株。选取5叶期的转基因(pCAMBIA1300-PseIF5A)烟草植株土培盆苗，进行-10℃/3h冷胁迫处理后，转基因烟草植株(pCAMBIA1300-PseIF5A)未发生明显的形态变化，而野生型烟草(CK)出现严重萎蔫(参见图1)，结果显示转基因烟草(pCAMBIA1300-PseIF5A)比野生型烟草(CK)具有更强的耐冷性。表明牡丹PseIF5A基因在烟草中异源表达能提高转基因烟草对冷胁迫的耐性。

Claims (3)

1.一种牡丹PseIF5A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的牡丹PseIF5A基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的牡丹PseIF5A基因在提高转基因烟草的冷胁迫抗性中的应用。