CN101643735A - 月季eIF5A基因的编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种月季eIF5A基因的编码序列及其应用。本发明包括提供月季eIF5A基因的编码序列及其氨基酸序列；提供包含编码序列的重组植物表达载体和转基因纯系植株；提供获得此基因的核苷酸引物序列，以及对此基因的内源表达模式进行分析鉴定的引物序列和方法。本发明所述基因翻译的蛋白质可用于提高植物的非生物胁迫(高温，氧化和渗透胁迫)的抗性。

Description

月季eIF5A基因的编码序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在月季中表达的真核起始因子家族的eIF5A基因的核苷酸编码序列、包含上述基因的重组表达载体、转化或转导的细胞以及转基因植株。本发明还公开了eIF5A基因在提高植物非生物胁迫抗性方面的应用。

背景技术

植物在自然生长环境下会随着环境的变化而细胞内出现相应的调节机制以帮助其适应环境，当环境的变化超出植物自身的调节范围便可称为环境胁迫，也叫非生物胁迫。常见的非生物胁迫有高低温胁迫，干旱渗透胁迫，氧化胁迫以及重金属盐胁迫等。因此对植物细胞内响应环境胁迫机制的研究对于提高植物非生物胁的迫抗性非常有意义。

月季(Rosa chinensis)是属于被子植物木兰冈蔷薇科的一类双子叶植物，是全球应用范围最广的观赏性花卉之一，因此也被称为“花中皇后”。月季的最适生长温度为22--25℃，夏季高温对开花不利。如夏季高温持续30℃以上，则多数品种开花减少，品质降低，进入半休状态。本研究正是因2003年在上海植物园观察到大多数月季品种夏季的持续高温(35℃以上一个多月)下进入半休眠期，而有一个品种“曼哈姆宫殿”则依然花开如初，因此将该品种与对照月季品种“新十全十美”一起做了高温处理下的双向电泳，发现高温处理下的“曼哈姆宫殿”细胞内有一种蛋白质表达量上升，经分析发现它就是真核起始因子5A(eIF5A)。

真核起始因子是一类参与细胞内氨基酸翻译过程的高度保守性的蛋白质(Gordon，E.D.et al.1987)。真核起始因子5A(eIF5A)是在多肽翻译的延伸阶段所需的一类蛋白因子，是目前发现的唯一一种含有吡咯赖氨酸hypusine(第22号特殊氨基酸)的蛋白质(Cooper，H.L.et al.1983，Park，M.H.et al.1984，1993)。吡咯赖氨酸的形成是通过对未成熟eIF5A多肽的翻译后修饰来完成的。该修饰共分两步，分别由脱氧吡咯赖氨酸合酶(DHS)与脱氧吡咯赖氨酸羟化酶(DHH)两个酶参与将eIF5A多肽的第50位左右赖氨酸修饰成吡咯赖氨酸(Wolff，E.C.et al.1990，Hanauske-Abel，H.M.et al.1994，Shi，X.P.et al.1996)。

对eIF5A基因的研究最早开始于1990年代，但至今对它的研究大多都集中在动物和真菌领域，对植物中该基因的研究甚少。目前已经克隆该基因的作物有紫花苜蓿，烟草，玉米，番茄，水稻和拟南芥，但真正对该基因功能研究较多的物种只有水稻和拟南芥(Pay，A.et al.1991，Chamot，D.&Kuhlemeier，C.1992，Dresselhaus，T.et al.1999，Requejo，R.&Tena，M.2006，Wang，T.W.et al.2001，Mehta，A.M.et al.1994，Wang，T.W.et al.2003)。例如，在水稻中发现OseIF5A-1和OseIF5A-2可能和盐胁迫和重金属胁迫有关(Chou，W.C.et al.2004)；拟南芥中共有三个eIF5A同源基因，其中AteIF5A-1在木质部发育过程起重要作用(Liu，Z.et al.2008)，AteIF5A-2则是细胞生长和衰老的重要调控因子(Feng，H.et al.2007，Hopkins，M.T.et al.2008)。然而，对植物中eIF5A功能的研究才刚开始，该家族的基因在植物中的其他很多功能还有待发现。

本实验室通过前期对两个不同耐热性的月季品种(“曼哈姆宫殿”和“新十全十美”)高温处理3小时后进行双向电泳，发现耐热品种“曼海姆宫殿”在高温下(38℃)eIF5A蛋白表达量远远高于非耐热品种“新十全十美”以及常温下的两个品种，因此初步认为此蛋白是耐热品种月季对环境响应的体现。为了证明如上的推论，本研究以耐热型月季品种“曼海姆宫殿”为材料，钓取其eIF5A基因，并设计特异引物检测该基因在月季中的表达模式，发现该基因在高温，氧化和渗透胁迫下都有更高的表达。于是将该基因转入模式植物拟南芥，经过实验发现含该基因的转基因植株大大提高了对高温，氧化和渗透三种胁迫的抗性。本研究为提高月季等观赏或应用性植物的非生物胁迫抗性以及研究其在逆境中分子与生理方面的机制奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于获得一种从月季中克隆出的eIF5A基因，其编码序列以及其应用。

本发明提供了一种新的月季基因，记为RceIF5A，已注册于GenBank/EMBL/DDBJ，登陆号为：EF177192。RceIF5A为具有特定序列的DNA分子，得到的表达序列全长765bp，包含一个480bp的开放阅读框(ORF)(1-480bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述基因编码翻译出的蛋白质分子，具有159个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了用于获取月季样品中RceIF5A基因的一对核苷酸引物。该引物根据RceIF5A基因编码序列两端非保守区域设计。具体的引物序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了用于分析RceIF5A基因在月季中表达模式的一对核苷酸引物。该引物根据RceIF5A基因的ORF的5’端和3’-UTR非保守区域设计。具体的引物序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种含有上述RceIF5A基因的编码序列的植物表达载体PHB载体。该载体可以转入农杆菌，然后侵染拟南芥等植物，完成转基因过程。

本发明提供了几种含有上述RceIF5A基因的编码序列的基因工程宿主细胞，具体为：含有PHB载体的大肠杆菌DH5a菌株和含有PHB载体的农杆菌GV3101菌株。

本发明还提供了一种基因组中含有RceIF5A基因编码序列的转基因拟南芥纯系植株。具体为两类：一是组成型过量表达该基因的转基因拟南芥纯系植株，该类植株可以比正常野生型植株更耐高温，氧化和渗透胁迫；二是组成型表达反义插入的RceIF5A基因编码序列的转基因拟南芥纯系植株，该类植株比正常野生型植株更不耐高温，氧化和渗透胁迫。

附图说明

图1RceIF5A氨基酸序列的比对。用软件Clustal X对RceIF5A和其他已经报道的植物eIF5A氨基酸序列进行比对分析。Rc：月季；At：拟南芥；Ms：紫花苜蓿；Nt：烟草；Os：水稻；Sl：番茄；Zm：玉米。该图结果说明了eIF5A家族高度保守(同源性在82％-96％之间)，以上序列的GenBank登录号分别为：RceIF5A(EF177192)，AteIF5A-1(NM_101261)，AteIF5A-2(NM_102425)，AteIF5A-3(NM_105608)，MseIF5A(X59441)，NeIF5A-1(X63541)，NeIF-5A2(X63542)，OseIF5A-1(AF094773)，OseIF5A-2(AJ312906)，SleIF5A-1(AF296083)，SleIF5A-2(AF296084)，SleIF5A-3(AF296085)，SleIF5A-4(AF296086)，ZmeIF5A(NM_001112080)。

图2 RceIF5A氨基酸序列的聚类分析。用软件Mega 3对RceIF5A和其他已经报道的植物eIF5A氨基酸序列进行系统进化分析。Rc：月季；At：拟南芥；Ms：紫花苜蓿；Nt：烟草；Os：水稻；Sl：番茄；Zm：玉米。该图结果说明了月季RceIF5A与紫花苜蓿和烟草的eIF5A在进化上更同源，而与拟南芥和水稻等的eIF5A在进化距离上更远。

图3 RceIF5A在月季中表达模式和转基因拟南芥阳性植株分子鉴定的RT-PCR分析。A，月季样品在各种处理胁迫3小时下的表达模式。该图说明在高温(38℃)，氧化(H₂O₂)和渗透(Mannitol)三种胁迫下RceIF5A的表达量上升，而其他几种胁迫下(干旱胁迫-PEG，盐胁迫-NaCl，钠离子毒性胁迫-LiCl和重金属胁迫-CdCl₂)则表达量变化不明显。B，反转RceIF5A的拟南芥株系A4的分子鉴定，可以看到该植株内的三个内源AteIF5A的表达量都降低了，说明RceIF5A与内源AteIF5A同源性高，因此相互结合沉默内源基因的表达。C，过表达RceIF5A的两个转基因拟南芥株系S17和S21的分子鉴定，可以看出两个转基因植株都有外源目的基因的表达，且S17的表达量比S21更高。

图4转基因RceIF5A拟南芥的高温处理。A4：反转RceIF5A的拟南芥株系；WT：野生型拟南芥；S17，S21：过表达RceIF5A转基因拟南芥株系。该图可明显看出经过45℃高温处理一天后，A4和WT都已经严重黄化(尤其是A4)，而S17，S21则所受影响不大(尤其是S17)，说明过表达RceIF5A能提高转基因植株的耐热性而反转RceIF5A则会降低转基因植株的耐热性，进一步说明AteIF5A也同胁迫相关。

图5转基因拟南芥高温处理后的生理指标测定。植株经高温45℃处理24小时后的相对莲座叶鲜重值。

图6转基因拟南芥高温处理后的生理指标测定。植株经高温45℃处理24小时后的相对电导率值。

图7转基因拟南芥高温处理后的生理指标测定。植株经高温45℃处理24小时并恢复生长2周后的相对单株果夹数。

图8转基因拟南芥高温处理后的生理指标测定。植株经高温45℃处理24小时并恢复生长2周后的相对单株果夹重。

图5-图8的生理指标结果进一步证明图4所说的结论。

图9转基因拟南芥的氧化胁迫处理。MS培养皿氧化胁迫处理后的相对成活率。

图10转基因拟南芥的氧化胁迫处理。植株氧化胁迫处理后的相对电导率值。

图11转基因拟南芥的氧化胁迫处理。植株氧化胁迫处理后的相对SOD(超氧化物岐化酶)活性值。

图9-图11可证明过表达RceIF5A能提高转基因植株的氧化胁迫抗性而反转RceIF5A则会降低转基因植株的氧化胁迫抗性。

图12转基因拟南芥的渗透胁迫处理。MS培养皿渗透胁迫处理后的相对根长。

图13转基因拟南芥的氧化胁迫处理。植株渗透胁迫处理后的相对莲座叶鲜重。

图14转基因拟南芥的氧化胁迫处理。植株渗透胁迫处理后的相对脯氨酸含量。

图12-图14可证明过表达RceIF5A能提高转基因植株的渗透胁迫抗性而反转RceIF5A则会降低转基因植株的渗透胁迫抗性。

具体实施方式

实施例1月季eIF5A基因的克隆：

1.月季(Rosa chinensis)品种“曼哈姆宫殿”和“新十全十美”来自上海植物园；生长条件为光周期16h/8h(L/D)，22-23℃。

2.植物RNA的提取是用天泽基因工程有限公司的“Plant RNAout”试剂盒，反转录的完成是用TaKaRa公司的“PrimeScriptTM RT Reagent”试剂盒。

3.以反转录获得的cDNA链为模板，用引物(SEQ ID NO.3)来PCR获得RceIF5A的ORF，然后连接入TaKaRa公司的pMD18-T载体测序；再以TaKaRa公司的“3’-FullRACE Core Set”试剂盒获得RceIF5A的3’-UTR，同样连入pMD18-T载体测序，最终获得全长cDNA(SEQ ID NO.1)。

实施例2月季RceIF5A基因的表达模式分析：

土中生长一个月大的月季苗用以下不同方式处理：38℃高温处理3小时，H₂O₂(20mM)、甘露醇Mannitol(500mM)、聚乙二醇(PEG)-8000(20％)、NaCl(200mM)、LiCl(30mM)和CdCl₂(50μM)以上溶液全部分别倒灌处理3小时。分别取样提RNA(方法同实施例1)，以反转录获得的cDNA链为模板，用根据3’-UTR序列设计的特异引物(SEQ ID NO.4)来PCR分析RceIF5A基因的表达模式。

实施例3RceIF5A基因植物表达载体的构建，转基因及转基因拟南芥分子鉴定：

1.将RceIF5A的ORF序列5’端加上Xba I限制酶切位点及3’端加上Sac I酶切位点，然后以反义方式连入植物表达载体pHB；同时将RceIF5A的ORF序列3’端加上XbaI限制酶切位点及5’端加上Sac I酶切位点，以正义方式连入植物表达载体pHB。

2.将两类重组载体以冻融法转入农杆菌GV3101，再用浸花法侵染野生型拟南芥，收获T0代种子，在潮霉素MS培养皿上筛选出阳性植株T1代，然后移入土中获得T2代种子，继续在潮霉素MS培养皿上筛选出能全部成活的纯合株系，即用于实验处理的T3代转基因植株。

3.选取两个正义转基因RceIF5A纯合株系S17和S21和一个反义转基因RceIF5A纯合株系A4，经过RT-PCR的分子鉴定，证实为含有外源目的基因表达的植株(图3B，C)。

实施例4转基因拟南芥各种胁迫处理方法：

1.高温处理：一个月大的拟南芥苗45℃高温处理24h，拍照，测莲座叶鲜重和电导率；剩下的实验组恢复生长两周后计算单株果夹数和果夹重。结果见图7，8。

2.氧化胁迫处理：a)MS培养皿上生长4d的苗移入含20mM H₂O₂的新培养皿垂直培养，3d后拍照并计算成活率；b)一个月大的拟南芥苗用20mM H₂O₂溶液倒灌处理5d后测莲座叶的电导率和SOD(超氧化物岐化酶)活性值。结果见图9，10，11。

3.渗透胁迫处理：a)MS培养皿上生长4天的苗移入含500mM Mannitol的新培养皿垂直培养，7d后拍照并计算相对根长；b)一个月大的拟南芥苗用500mM Mannitol溶液倒灌处理18h后测莲座叶鲜重和脯氨酸含量。结果见图12，13，14。

实施例5各种生理指标测定方法：

1.电导率的测定：取拟南芥莲座叶片，用打孔器打出三个圆孔，放入1.5ml的去离子水中，摇床上轻摇3h，用电导率仪测电导率值；测完再沸水水浴10min，冷却至室温，再测电导率值。前者除以后者获得获得最终的电导率值。

2.脯氨酸含量测定：取0.1g莲座叶，加入5ml 3％磺基水杨酸，沸水水浴10min，冷却后静置。吸取2ml提取液，加入2ml冰醋酸、2ml酸性茚三酮，沸水水浴30min。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，吸上清，3000rpm离心5min。以甲苯为空白对照，于520nm下比色，得吸光度。与对照组相比获得相对脯氨酸含量值。

3.SOD(超氧化物岐化酶)活性测定：取0.1g叶片于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰上研磨成浆，再加4ml磷酸缓冲液，混匀，吸取其中1.5-2ml，1000rpm低温离心20min，取上清。

显色反应：

3ml反应液中：

试剂	用量ml	终浓度
			50mM磷酸缓冲液(pH 7.8)	1.5
130mM甲硫氨酸溶液	0.3	13mM
			750μM氮蓝四唑(NBT)溶液	0.3	75μM
100μM EDTA-Na2溶液	0.3	10μM
			20μM核黄素溶液	0.3	2μM
酶液	0.05
			蒸馏水	0.25
总体积	3

混匀后，于4000lux日光下反应20min(温度高时缩短光照时间)，暗保存；以不加酶液的对照管作空白于560nm处测定吸光度。与对照组相比获得相对SOD活性值。

参考文献

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序列表

SEQ ID NO.1：

ATGTCGGATGAGGAGCATCACTTCGAATCTAAGACCGACGCCGGAGCCTCCAAGACC

TATCCTCAGCAGGCCGGCACCATCCGAAAGAACGGTTACATTGTCATCAAAAACAGG

CCCTGCAAGGTTGTGGAGGTTTCCACTTCCAAAACCGGCAAGCACGGACATGCCAA

GTGCCACTTTGTTGGTATTGACATCTTCACTGCCAAGAAGCTTGAGGATATTGTTCCCT

CTTCCCACAATTGTGATGTTCCCCATGTCAACCGTACCGACTACCAGCTGATTGATATC

TCTGAGGATGGATTTGTGAGTCTGCTGACTGAGAATGGTAACACCAAGGATGACCTG

AGGCTTCCAACCGATGACAATCTGCTTACGCAGATCAAGGATGGCTTTGCTGAGGGG

AAAGACCTGGTTGTGTCTGTGATGTCTGCTATGGGCGAGGAGCAGATTTGTGCTCTCA

AGGATATTGGCCCCAAGTAATTGTCTTTATTCCTCCAAAATGCTTTTAGACTTAAAATT

TGAATTGGAACGGTTTAATAGTATCTTGAAGGGTCACCATTCAGGAGCTATTCTTGATT

GTAGTTGGCCTTGGATTATATGTTGATGTTGCCATTAATTAGCTTGTCATCCATACGTTT

TTCTGTTTACTGTCTGGACCATATGCCCTATTTCATGGTGTTGGTAAGTCATTTTAAGA

CTGTATAGTGTCCTCTCTGGTTTGAAGTTATCTATGGTTTCTACCAAA

SEQ ID NO.2：

MSDEEHHFESKTDAGASKTYPQQAGTIRKNGYIVIKNRPCKVVEVSTSKTGKHGHAKC

HFVGIDIFTAKKLEDIVPSSHNCDVPHVNRTDYQLIDISEDGFVSLTENGNTKDDLRLPT

DDNLLTQIKDGFAEGKDLVVSVMSAMGEEQICALKDIGPK

SEQ ID NO.3：

正义链引物：5’-ATGTCGGATGAGGAGCATCA-3’

反义链引物：5’-TTACTTGGGGCCAATATCCTT-3’

SEQ ID NO.4：

正义链引物：5’-ATGTCGGATGAGGAGCATCA-3’

反义链引物：5’-ATGGTCCAGACAGTAAACAGAA-3’

Claims (7)

1.一种月季eIF5A基因的核苷酸序列，其特征为DNA序列全长765bp，其中含有一个480bp的开放阅读框，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种如权利要求1所述的eIF5A基因所编码的蛋白质分子，其特征为长159个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种用于获取月季样品中eIF5A基因的引物序列，其特征在于根据权利要求1所述eIF5A基因ORF两端非保守区域设计，其序列为SEQ ID NO.3。

4.一种用于分析eIF5A基因在月季中表达模式的引物序列，其特征在于根据权利要求1所述eIF5A基因的ORF的5’端和3’-UTR非保守区域设计，其序列为SEQ ID NO.4。

5.一种含有如权利要求1所述基因的编码序列的植物表达载体PHB，其特征在于载体PHB中含有eIF5A基因的ORF序列。

6.一种基因工程宿主细胞，其特征在于如含有权利要求5所述的载体。

7.如权利要求2所述的eIF5A基因所编码的蛋白质在提高植物非生物胁迫抗性方面的应用。

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