CN104359887A - 一种荧光法确定腐植酸产品原料的方法及快速检测腐植酸产品中腐植酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用荧光法测定腐植酸产品原料的方法，以及确认产品原料后，如何快速检测腐植酸的浓度，具体为，利用不同种类原料制备的腐植酸的荧光峰的特性，通过发射波长和激发波长的测定来判断产品的原料；通过一次容量法测定样品浓度后，利用其在一定浓度范围内，腐植酸浓度与荧光强度的线性关系测定得出二者的直线方程，之后，对于该原料制作的腐植酸产品，只需要测定其溶液的荧光强度，就能都根据线性关系计算得出产品的腐植酸含量。

Description

一种荧光法确定腐植酸产品原料的方法及快速检测腐植酸产品中腐植酸含量的方法

技术领域

本发明具体涉及利用荧光法确定腐植酸产品的原料的方法，以及适用于工业在线检测的快速检测腐植酸产品中腐植酸含量的方法，属于腐植酸检测技术领域。 

背景技术

腐植酸因其源于自然而又与自然紧密相连的天然特性以及多样的生物化学活性、无毒无害等优点，广泛地应用于农、林、牧、石油、化工、建材、医药、卫生、环保等各个领域。腐植酸作为具有生物活性的高分子物质已用于70多种行业。在农业领域可用作肥料、兽药、饲料添加剂、水产养殖的净化剂和杀菌剂；工业用做钻井液降滤失剂，防塌剂，泥浆处理剂，蓄电池添加剂，粘结剂等；医药行业的乌金口服液、黑金片等。最有希望加以开发利用的腐植酸资源是含有腐植酸的低阶煤（风化煤、褐煤和泥炭），其中的腐植酸含量达10-80％，但其产品往往不是单一的化合物，而是一组羟基芳香族羧酸的混合物。而且煤炭来源不同、生产工艺不同得到的腐植酸的分子量、化学成分、结构、官能团差异较大。给判断腐植酸原料及产品的定性定量带来很大困惑。目前主要存在两大问题。 

1、国际腐殖质协会（IHSS）推荐方法和中华人民共和国国家标准腐植酸含量测定方法均采取容量法。其核心是通过抽提待测样品的有机质进行氧化，根据氧化剂的消耗量和氧化剂相当的碳含量进行计算： 

HAs,ad = 

式中：C—不同煤种腐植酸的碳系数

腐植酸的原料主要来源于低阶煤——风化煤、褐煤和泥炭。经过大量统计测定，风化煤碳系数0.64，褐煤碳系数0.58，泥炭碳系数0.51。碳系数对计算结果影响非常大。然而目前腐植酸原料的定性主要是凭借经验，一旦制成腐植酸产品，就无法判断原料是褐煤还是风化煤。在不知道腐植酸原料类型的情况下，就需要首先对样品的碳系数进行测定，该实验繁冗复杂，花费大量的时间和试剂。因此，快速、准确地确定腐植酸样品的原料类型成为测定腐植酸含量的关键问题。

2、测定腐植酸含量依据国际腐殖质协会（IHSS）推荐方法和国家煤炭标准，采用容量法和重量法完成即用焦磷酸钠碱液或氢氧化钠溶液从煤样中抽提腐植酸，再在强酸性溶液中，用重铬酸钾将腐值酸中的碳氧化成二氧化碳，根据重铬酸钾消耗量和腐植酸含碳比计算腐植酸的产率的方法，该方法耗时长，无法快速给出腐植酸含量的数据，在企业生产线质量监控等方面的应用受到一定限制，所以研究快捷、方便、准确的定量方法具有非常重要的意义。 

另外，在腐植酸钾的出口贸易中，经常会有以下类似的情况发生：买卖双方签订的合同规定腐植酸的含量为60%。委托腐植酸检测中心出具检测报告给海关报关。这种情况来不及做碳系数检测，卖方告知腐植酸检测中心，该产品为以褐煤为原料生产的腐植酸，按照碳系数为0.58计算，腐植酸含量为61%，达到合同要求。货物到达买方港口，买方按照碳系数为0.64计算，腐植酸含量为54%，认为产品不合格，构成违约，造成严重的经济损失。如果能够在生产的时候就通过在线检测，监测产品的腐植酸含量，就能够有效的防止此类情况的发生。 

《腐植酸、黄腐酸碳系数和检测方法存在的问题及改进意见》（邹德乙等，腐植酸2013年第04期，54-56页）中也对相关的问题进行了详细阐述。 

发明内容

本发明的目的，一是克服现有碳系数法确定腐植酸产品原料实验繁冗复杂、时间长、试剂需求量大的缺陷，提供一种能够快速、直接确定腐植酸产品原料的方法；二是克服现有容量法测定腐植酸含量实验过程复杂，耗时长的缺陷，提供一种简单快捷，能够适用于工业在线检测腐植酸含量的检测方法。 

我们在研究过程中发现，不同原料（泥炭、褐煤或者风化煤）制备而成的腐植酸产品，不论是腐植酸盐还是类黄腐酸等，其激发、发射光谱与其原料和加工方式有一定关联性，通过对全国七个不同地区泥炭、褐煤、风化煤以氧化法、碱抽提法制备的12种腐植酸产品的荧光光谱特性，考察了浓度、酸度、不同金属离子对其荧光性质的影响。结果表明：泥炭腐植酸激发、发射波长位于312～325 nm和428～433 nm区段，褐煤腐植酸激发、发射波长位于320～350 nm和450～470 nm区段，风化煤腐植酸激发、发射波长集中在420～470 nm和500～530 nm区段。同一煤种作为原料以氧化降解法制备的类黄腐酸其激发波长和发射波长小于腐植酸钾；12种腐植酸在不同的浓度范围内，腐植酸的浓度和其荧光强度呈现良好的线性关系。 

在实验中还发现，上述特性的表现，尤其是激发、发射波长的位置，基本与腐植酸产品中的腐植酸含量以及产品溶液的浓度无关。 

因此，通过简单的荧光光谱扫描就能够顺利的判定腐植酸产品的原料类型。 

具体方法如下： 

1）将腐植酸产品用二次蒸馏水配制成待测溶液A；

2）扫描荧光光谱，利用荧光分光光度计对待测溶液A进行荧光光谱扫描，反复以不同的激发波长扫描其发射光谱，再以最大强度对应的发射波长扫描其激发光谱，确定激发、发射强度最大且匹配的一组为其荧光峰；操作参数为：闪烁式氙灯；PMT电压：600V；激发和发射狭缝：5nm；扫描速度：600nm/min；平均时间：0.1000s；数据间隔：1.0000nm；激发和发射狭缝均为10nm；

3）根据步骤2）的测定结果判定腐植酸产品的原料；判定标准为，

泥炭制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于312～325 nm和428～433 nm区段；

褐煤制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于320～350 nm和450～470 nm区段；

风化煤制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于420～470 nm和500～530 nm区段。

同时，在研究过程中，通过对不同种类的不同地方原料的腐植酸产品荧光强度和腐植酸浓度的研究发现，在一定的浓度范围内，腐植酸的荧光强度与腐植酸的浓度（请注意不是腐植酸产品的浓度）表现出良好的线性关系，因此，可以通过线性方程的建立，得到腐植酸含量的快速检测方法。 

首先，对于不知道原料的腐植酸产品，需要根据上述方法对一份抽检样品进行检测，确定其原料是泥炭、褐煤还是风化煤。 

然后再利用现有的容量法测定上述抽检样品的腐植酸含量，具体方法见背景技术。 

确定抽检样品的腐植酸含量后就可以建立直线方程了。 

根据我们的研究，不同原料的腐植酸产品，不论是腐植酸盐还是类黄腐酸，其腐植酸的荧光强度和腐植酸的浓度，都符合以下特性： 

泥炭制备的腐植酸产品，腐植酸的荧光强度和腐植酸的浓度在浓度范围1-20mg/L或者在40-150mg/L，具有良好的线性关系；

褐煤制备的腐植酸产品为10-20mg/L或者为40-60mg/L；

风化煤制备的腐植酸产品则为20-45mg/L。

在进行这一步时，为了操作的方便，最好是依据上述容量法测定的腐植酸含量，先用二次蒸馏水配制成500mg/L的基准溶液，再根据需要稀释至相应的浓度。 

建立直线方程，需要三组坐标，因此，就需要X、Y、Z三种不同腐植酸浓度的待测液，待测液的腐植酸浓度按顺序依次计为c1、c2、c3。 

以泥炭制备的腐植酸产品为例，X、Y、Z三种浓度均落在40-150mg/L范围内，然后对三种待测液分别进行荧光光谱扫描，根据激发峰、发射峰的强度计算出各自的荧光强度F，按顺序依次计为F1、F2、F3； 

再以荧光强度F为纵轴，腐植酸浓度c为横轴，根据坐标点（c1，F_-1）、（c2，F2）、（c3，F3）确立直线方程：F=kc+b，其中，F为荧光强度，k为斜率，c为腐植酸浓度，b为纵轴截距。

确立直线方程之后，进行该产品其他样品的腐植酸含量检测时，只需要将样品用二次蒸馏水溶解成腐植酸浓度为40-150mg/L的溶液，检测得出其荧光强度，就能够根据直线方程F=kc+b确定腐植酸的浓度，进而确定产品中的腐植酸含量。由于检测前不知道腐植酸的浓度，因此可以根据估测多准备几组浓度的待测液，经过计算核实就能够得出较为准确的腐植酸含量。 

只要能够确定待测产品的原料与已经建立直线方程的原料一样，就能利用已经建立的直线方程进行腐植酸含量的测定。例如对同一批原料生产的不同批次产品的检测。 

与现有技术相比本发明具有以下有益效果。 

1、本发明能够快速、准确地确定了腐植酸的原料，在定量计算时带入正确的碳系数，保证了结果的准确性。现有技术只能根据生产企业提供的数据确定碳系数或用碳系数检测法历时2个工作日检测碳系数。 

2、本发明确定直线方程之后，利用分子荧光光谱仪测定腐植酸含量的过程，5分钟就能够得到分析结果，快捷方便，能够应用于工业生产过程的在线检测。现有腐植酸测定方法，在明确碳系数条件下，利用容量法，需要历经腐植酸抽提2小时，定容、过滤、氧化半小时、氧化还原滴定过程，一般需要5小时左右才能得到准确结果。而腐植酸生产过程通常为3小时，生产过程中的质量监控无法依靠现有的腐植酸测定方法实施。 

3、目前国标的容量法的灵敏度为万分之一。检测限为0.1%。误差范围1%。因此在1%以下，不准确性很高，为化学分析范畴。而本发明的方法利用的是荧光法，荧光法的灵敏度为百万分之一，检测限为10^-9次方，误差为百万分之一。准确度很高。属分析化学的仪器分析范畴。 

4、对于某一种原料的腐植酸产品的检测，只需要进行一次容量法测定样品浓度后，根据建立的直线方程，就能够实现对该原料制备的其他腐植酸产品中的腐植酸浓度。而不用像现有技术这样，每个样都需要重新采用容量法测定，严重消耗和浪费人力物力。 

5、在腐植酸检测中心的工作中发现，一些企业为了提高腐植酸的品质，人为把以风化煤为原料生产的腐植酸作为以褐煤为原料生产的腐植酸，腐植酸含量可以提高1.1倍。作为以泥炭为原料生产的腐植酸，腐植酸含量可以提高1.3倍。例如以风化煤为原料生产的腐植酸含量为50%，如果界定为以褐煤为原料生产的腐植酸，其含量为55%；如果界定为以泥炭为原料生产的腐植酸，其含量为65%；这个错误递延到腐植酸应用企业会导致更恶劣的后果。例如肥料生产企业用50%的腐植酸配置4%的腐植酸水溶性肥料。每吨腐植酸水溶性肥料需添加80公斤50%的腐植酸钾。如果界定为以泥炭为原料生产的腐植酸，按照含量为65%加入腐植酸水溶性肥料中，生产出的水溶性肥料的实际含量为3.07%，这批肥料即被视为伪劣产品。如果肥料企业可以自行确定腐植酸原料的碳系数，就可以避免该类事故发生。 

[0028] 现有检测方法耗时太长，需要的设备和试剂并不适宜企业单独购备，因此需要委托检测中心检测。本发明利用荧光分析的方法实现原料的检测和腐植酸含量的在线检测，企业完全可以自行购买荧光分光光度计和试剂，而且对产品的实时检测有利于及时发现问题，对生产条件进行调整，避免了伪劣产品的成批出现。

附图说明

图1为12种腐植酸的荧光光谱图。 

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。 

1、仪器及试剂 

Cary Eclipec荧光分光光度计（美国，VARIAN公司）。

实验所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 

2、腐植酸产品制备方法 

以七个不同地区的泥炭、褐煤、风化煤为原料，保持pH值在5左右以氧化的方法制备类黄腐酸，用氢氧化钾抽提制备腐植酸钾，所得产品列于表1。

3、荧光分析方法 

准确称取一定量的腐植酸用二次蒸馏水配制成有效含量为500mg/L的溶液。实验时在10mL比色管中稀释至所需浓度，转移至1cm比色皿中，置于荧光仪上扫描其荧光光谱。基本操作参数如下：闪烁式氙灯；PMT 电压：600 V； 激发和发射狭缝：5 nm；扫描速度：600 nm/min；平均时间：0．100 0 s；数据间隔：1．000 0 nm；激发和发射狭缝均为10 nm。

4、腐植酸的激发与发射光谱 

图1为12种腐植酸的荧光光谱图。不同腐植酸的激发、发射光谱峰形、位置及强度均有一定差异。以风化煤制得的腐植酸激发、发射峰只有一个；以泥炭和褐煤制得的腐植酸激发、发射均有两个峰，其中内蒙古泥炭制备的腐植酸钾NMPK在280 nm、312nm处各有一个激发峰，发射峰位于428nm和623nm，云南褐煤制的YNLK在254 nm、340 nm处各有一个激发，发射峰位于470 nm和655 nm，YNLF在220 nm、325 nm各有一个激发峰，内蒙古褐煤制的NMLF在230nm、350nm处各有一个激发峰，在460 nm和710 nm有发射。

12种腐植酸产品的激发、发射峰位置列于表2。12种腐植酸产品的激发波长集中在310-350 nm和420-470 nm两个区段，发射波长集中在430-470 nm和500-530 nm两个区段。总体来看：以泥炭为原料制备的产品其激发波长和发射波长最小，激发波长集中在310-325nm区段，发射波长集中在425-435nm区段；以褐煤为原料制得的产品又小于以风化煤为原料制备的产品，激发波长集中在320-350nm区段，发射波长集中在450-470nm区段；以风化煤为原料制备的产品其激发波长和发射波长最大，激发波长集中在420-470nm区段，发射波长集中在500-530nm区段。同一煤种作为原料制备的黄腐酸其激发波长和发射波长小于腐植酸钾。 

物质的激发光谱、发射光谱与其刚性结构、取代基、大Π键、生色官能团等因素密切相关。结构中有较大的刚性平面结构，较大的共轭体系，则其荧光峰移向长波长方向。各种腐植酸荧光峰位置的不同表明了其结构方面的差异，这种差异与腐植酸形成的时间性和地域性有关 。由于风化煤的煤化程度高于褐煤，褐煤高于泥炭，因此其中提取的腐植酸腐植化程度高、结构复杂，与褐煤、泥炭比较它们的芳构化程度深、不饱和键多、共轭程度高，其激发、发射波长的顺序为风化煤腐植酸>褐煤腐植酸>泥炭腐植酸。这与申请人对腐植酸产品的元素分析结果和紫外可见光谱分析结果一致。 

腐植酸制备方法也会对其结构产生影响。氧化降解法可能会破坏原有结构中的不饱和键或者以氢键形成的共轭体系，所以其激发发射波长较碱提法得到的腐植酸钾短。 

但是，不论是何种产品，其激发波长和发射波长均落在各自特有的区段内，由此认为，通过腐植酸产品的荧光特性分析可以简便、快捷地鉴别腐植酸产品的原料性质、确定产品与加工方式的关系，为区分煤种提供有用信息。 

我们在得出上述结论之后，对中国腐植酸工业协会的腐植酸产品进行了抽检，结果列于表3。 

测定的激发波长和发射波长的值允许与给出的标准范围有些微出入，但是其出现的区域要能够与标准范围对应，如俄罗斯托姆斯克泥炭制备的黄腐酸的发射波长423nm就略低于标准值下限425nm。其不影响对于原料的判断。 

5、浓度对腐植酸荧光特性的影响 

配制不同浓度的腐植酸溶液系列各10 ml，以其最大激发扫描发射光谱，考察浓度与荧光强度的关系。

结果发现，各种腐植酸在荧光增强和猝灭的过程中都在一定范围内浓度和强度呈良好的线性关系。线性范围宽，表明其结构在一定的浓度范围内具有稳定性，有利于用于腐植酸定量分析，可为进一步使用荧光分析手段定量测定腐植酸提供依据。 

通常相关系数R的 绝对值大于0.75时就认为两个变量有很强的线性相关关系，因此，总结上表4，可以得出以下结论： 

泥炭制备的腐植酸产品，其溶液有效腐植酸浓度在1-20mg/L范围内或者在40-150mg/L范围内与其荧光强度具有良好的线性关系；

褐煤制备的腐植酸产品，其溶液有效腐植酸浓度在10-20mg/L或者在40-60mg/L范围内与其荧光强度具有良好的线性关系；

风化煤制备的腐植酸产品，其溶液有效腐植酸浓度在20-45mg/L范围内与其荧光强度具有良好的线性关系。

根据上述实验及结论能够确定，只需要按照本发明的方法确定原料（对于确切已知原料的可省略此步骤）、容量法测一次样品腐植酸含量、配制三组样品待测液、测定待测液的荧光强度、根据荧光强度和待测液腐植酸浓度确定二者的线性关系方程。 

应用于在线检测时，只需要根据实际腐植酸浓度需求大致配制出几个浓度的待测液，用荧光法测定出其荧光强度之后，就能够判断产品的腐植酸含量是否符合要求。 

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。 

Claims (5)

1.一种荧光法确定腐植酸产品原料的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将腐植酸产品用二次蒸馏水配制成待测溶液A；

2）扫描荧光光谱，利用荧光分光光度计对待测溶液A进行荧光光谱扫描，反复以不同的激发波长扫描其发射光谱，再以最大强度对应的发射波长扫描其激发光谱，确定激发、发射强度最大且匹配的一组为其荧光峰；操作参数为：闪烁式氙灯；PMT电压：600V；激发和发射狭缝：5nm；扫描速度：600nm/min；平均时间：0.1000s；数据间隔：1.0000nm；激发和发射狭缝均为10nm；

3）根据步骤2）的测定结果判定腐植酸产品的原料；判定标准为

泥炭制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于312～325 nm和428～433 nm区段；

褐煤制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于320～350 nm和450～470 nm区段；

风化煤制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于420～470 nm和500～530 nm区段。

2.根据权利要求1所述的荧光法确定腐植酸产品原料的方法，其特征在于：所述待测溶液A的浓度为0-500mg/L。

3.一种快速检测腐植酸产品中腐植酸含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步，确定腐植酸产品的原料

1）将待测的腐植酸产品的样品1，取用一部分用蒸馏水配制成待测溶液；

2）扫描荧光光谱，利用荧光分光光度计对待测溶液进行荧光光谱扫描，反复以不同的激发波长扫描其发射光谱，再以最大强度对应的发射波长扫描其激发光谱，确定激发、发射强度最大且匹配的一组为其荧光峰；操作参数为：闪烁式氙灯；PMT电压：600V；激发和发射狭缝：5nm；扫描速度：600nm/min；平均时间：0.1000s；数据间隔：1.0000nm；激发和发射狭缝均为10nm；

3）根据步骤2）的测定结果判定腐植酸产品的原料；判定标准为，

泥炭制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于312～325 nm和428～433 nm区段；

褐煤制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于320～350 nm和450～470 nm区段；

风化煤制备的腐植酸产品激发、发射波长分别位于420～470 nm和500～530 nm区段；

第二步，测定确定样品1的腐植酸含量

利用容量法测定出样品1中的腐植酸含量；

第三步，确定样品1的腐植酸含量测定荧光强度与腐植酸浓度的直线方程

1）根据第二步测定的腐植酸含量称取样品1，加二次蒸馏水配制成腐植酸含量为500mg/L的基准溶液；

2）将分别取基准溶液，并稀释为X、Y、Z三种不同浓度的待测液，浓度依次计为c1、c2、c3，待测液的浓度基准为：

泥炭制备的腐植酸产品的待测液浓度在1-20mg/L；

褐煤制备的腐植酸产品的待测液浓度在10-20mg/L；

风化煤制备的腐植酸产品的待测液浓度在20-45mg/L范围内；

3）扫描荧光光谱，分别确定X、Y、Z三种待测液的荧光强度，依次计为F1、F2、F3；

4）以荧光强度F为纵轴，腐植酸浓度c为横轴，根据步骤2）和3）的数据（c1，F_-1）、（c2，F2）、（c3，F3）确立直线方程：F=kc+b，其中，F为荧光强度，k为斜率，c为腐植酸浓度，b为纵轴截距；

第四步，荧光法测定腐植酸含量

1）称取一定重量的待测样品，加入二次蒸馏水溶解后，取溶液扫描荧光光谱，确定其荧光强度；

2）根据直线方程F=kc+b，计算出腐植酸浓度，再根据腐植酸浓度、溶液的体积和待测样品的重量计算出待测样品的腐植酸含量；

上述涉及的扫描荧光光谱操作条件均同第一步的步骤2）。

4.根据权利要求3所述的一种快速检测腐植酸产品中腐植酸含量的方法，其特征在于：

第三步步骤2）待测液的浓度基准，泥炭制备的腐植酸产品的待测液浓度在40-150mg/L范围内。

5.根据权利要求3所述的一种快速检测腐植酸产品中腐植酸含量的方法，其特征在于：

第三步步骤2）待测液的浓度基准，褐煤制备的腐植酸产品的待测液浓度在40-60mg/L范围内。