CN109425609A - 一种用于定量测定腐植酸的色板及其制备方法和用途 - Google Patents

一种用于定量测定腐植酸的色板及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

一种用于定量测定腐植酸的色板及其制备方法和用途，所述腐植酸包括黄腐酸、游离腐植酸和/或总腐酸，所述制备方法包括：腐植酸提取、不同浓度的标准品配制和显色、反应腐植酸浓度与使用紫外可见分光光度法或者紫外荧光检测法对其进行检测时获得的吸光度的关系的标准曲线的制备以及依照标准曲线和显色颜色制作色板等步骤。利用本发明的测定方法可以快速测定不同来源的黄腐酸、游离腐植酸以及总腐酸的含量，其分析时间快速，硫酸和重铬酸钾的用量小，适于腐植酸的大规模测定；为本领域腐植酸测定提供了新的思路。

Description

一种用于定量测定腐植酸的色板及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于分析检测领域，特别涉及一种用于定量测定腐植酸的色板及其制备方法和用途。
背景技术
通常腐植酸的检测有重量法和容量法，重量法根据腐植酸的特性，除去水溶性的黄腐酸进行定量。而作为国家标准和部颁标准的容量法，存在着分析时间长，硫酸、重铬酸钾的用量大、测试废水量较大等现状。对于企业常规的生产检测控制，或仲裁机构的初步性判断检测，存在着资源浪费等问题。因此，探索一种简单、快速且不污染环境的腐植酸的检测方法至关重要。
发明内容
本发明为克服现有技术中腐植酸检测方法存在分析时间长，硫酸、重铬酸钾用量大等缺陷，提供了一种用于定量测定腐植酸的色板及其制备方法和用途；利用本发明的测定方法可以快速测定不同来源的黄腐酸、游离腐植酸以及总腐酸的含量，分析时间快速，硫酸和重铬酸钾的用量小，适于腐植酸的大规模测定；为本领域腐植酸测定提供了新的思路。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一为：一种用于定量测定腐植酸的色板的制备方法，所述腐植酸包括黄腐酸、游离腐植酸和/或总腐酸，所述制备方法包括如下步骤：
(1)提取不同来源的腐植酸的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸；
(2)根据已有的国家或行业标准测定所述黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的含量，并配制梯度浓度的各腐植酸的标准品溶液；
(3)在步骤(2)所得标准品溶液中依次加入K2Cr2O7溶液和H2SO4溶液进行显色反应得反应液，记录不同浓度的各标准品溶液的反应液对应的颜色；
(4)选择步骤(3)所得任一浓度的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸标准品溶液进行紫外可见分光光度法或者紫外荧光分析法检测，得灵敏波长；
(5)利用所得波长对不同浓度的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸标准品的反应液进行紫外可见分光光度或者紫外荧光检测；
(6)制定不同来源的腐植酸的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的浓度与吸光度的标准曲线；
(7)根据步骤(6)所得标准曲线对照步骤(3)中的颜色，制备来源于不同腐植酸的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的标准色板。
步骤(1)中所述腐植酸的来源可以为本领域常规的腐植酸的来源，较佳地为黑龙江泥炭、云南保山褐煤、云南尚呈黄腐酸盐、新疆哈密风化煤、福建绿洲腐植酸、山西风化煤、内蒙风化煤或者泉林腐植酸。
步骤(1)中所述提取的方法可采用本领域常规的酸碱提取法，例如参考行业标准HG/T 3278-2011腐植酸钠肥料标准测试中的提取方法。具体来说：在所述不同来源的腐植酸中分别加入a)H2SO4溶液、b)NaOH溶液或c)NaOH与Na4P2O7·10H2O的混合液，进行抽提，制得黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的标准品；较佳地，腐植酸与a)H2SO4的重量比为(0.2～1.6):1，所述H2SO4溶液浓度为0.1mol/L；腐植酸与b)NaOH的重量比为(0.05～1):1，所述NaOH溶液浓度为0.25mol/L；腐植酸与c)NaOH与Na4P2O7·10H2O的混合液的重量比为(0.002～0.12):1，混合液中NaOH与Na4P2O7·10H2O的溶液浓度分别为0.15mol/L和0.1mol/L；更佳地，所述抽提为超声波抽提；进一步更佳地，超声波的超声频率为20-100KHz，所述超声波的超声时间为1-15min。
步骤(2)中所述的浓度梯度较佳地为0.25g/ml、0.50g/ml、0.75g/ml和1g/ml。
较佳地，步骤(3)中所述K2Cr2O7溶液的浓度为0.1mol/L，所述H2SO4溶液的浓度为18.4mol/L，所述标准品溶液与所述K2Cr2O7溶液的体积比为1:(1～3)，所述标准品溶液与所述H2SO4溶液的体积比为1:(3～9)；反应时间较佳地为0.01-0.10min。
步骤(4)中所述的波长为本领域进行紫外可见分光光度法或者紫外荧光分析检测时的波长；较佳地，所述的灵敏波长为400～780nm，更佳地为410～465nm；进一步更佳地，利用紫外可见分光光度法检测游离腐植酸或总腐酸时对应的灵敏波长为452nm，检测黄腐酸时对应的灵敏波长为430nm；进行所述紫外荧光检测时，黄腐酸的灵敏波长为410nm，游离腐植酸或总腐酸的灵敏波长为465nm。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二为：一种上述的制备方法制得的色板，所述色板包括不同来源腐植酸的标准品的色板。
其中，若标准品来源为黑龙江泥炭，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为草绿、军绿、深绿和湖绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为棕红、咖啡色、秋橘红和草绿；
若标准品来源为福建绿洲腐植酸，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为草绿、深草绿、深绿和森林绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、咖啡色、橘红和草绿；
若标准品来源为云南保山褐煤，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、暗黄和湖绿、荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为浅橘红、秋橘红、暗黄和浅黄。
若标准品来源为山西风化煤，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为浅橘红、薄荷绿、湖绿和荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为咖啡色、浅黄、湖绿和深绿；
若标准品来源为云南尚呈黄腐酸盐，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为咖啡色、暗绿、湖绿和荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、咖啡、暗黄和浅黄；
若标准品来源为内蒙风化煤，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为浅橘红、暗黄、湖绿和荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、咖啡色、暗黄和浅黄；
若标准品来源为新疆哈密风化煤，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为深咖啡色、军绿、湖绿和荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、咖啡色、暗绿和暗黄；
或者，若标准品来源为泉林腐植酸，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为暗黄、军绿、深绿和森林绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为暗绿、深绿、湖绿和荧光绿。
较佳地，若标准品为黑龙江泥炭中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度由低到高对应的颜色色号依次为385、370、348和354；若为黑龙江泥炭中黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为1605、1595、152和385；
若标准品为福建绿洲腐植酸中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为3975、3985、370和357；若为福建绿洲腐植酸中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为158、153、130和117；
若标准品为云南保山褐煤中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为165、397、354和361；若标准品为黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为；472、165、397和3965。
若标准品为山西风化煤中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为472、353、354和361；若标准品为黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为471、3965、355和347；
若标准品为云南尚呈黄腐酸盐中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为167、132、354和361；若标准品为黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为166、167、3975和3965；
若标准品为内蒙风化煤中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为123、397、354和361；若标准品为黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为152、138、397和3965；
若标准品为新疆哈密风化煤中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为471、4505、354和361；若标准品为黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为165、167、399和397；
或者，若标准品为泉林腐植酸中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为397、3995、371和350；若标准品为黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色色号依次为3985、370、334和354；所述色号为潘通C色卡中的色号。
需了解，上述色号与不同浓度的不同腐植酸的颜色之间的对应关系并非绝对，即不同浓度的不同腐植酸的颜色可以与其对应的色号大致相同、也可以接近或者无限接近上述色号。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三为：一种腐植酸的测定方法，所述腐植酸包括黄腐酸、游离腐植酸和/或总腐酸，所述测定方法为色阶定量快速测定法，其包括如下步骤：
(1)精确称量不同来源的腐植酸待测样品3份；
(2)分别提取待测样品中的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸，在各取提溶液中依次加入K2Cr2O7溶液和H2SO4溶液进行显色反应；
(3)将步骤(2)中待测黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸各自显色反应的颜色与权利要求6或7所述的色板比对，分别得到不同腐植酸的浓度区间。
上述测定方法较佳地还包括步骤(4)：对步骤(2)所得反应液进行紫外可见分光光度法和/或紫外荧光分析法检测得吸光度，对应上述定量测定腐植酸的色板的制备方法的步骤(6)中制定的标准曲线得准确浓度。此处需要说明的是：理论上，介于上述四个浓度梯度点值之间的浓度值对应的颜色为相应四种颜色之间的颜色，例如黑龙江泥炭来源的、浓度为0.4g/ml的黄腐酸的标准品颜色介于棕红与咖啡色之间。
其中，步骤(2)所述提取的方法为本领域常规的提取法，即：在所述不同来源的腐植酸中分别加入a)H2SO4溶液、b)NaOH溶液或c)NaOH与Na4P2O7·10H2O的混合液，进行抽提，分别制得黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸标准品。
较佳地，腐植酸与a)H2SO4的重量比为(0.2～1.6):1，所述H2SO4溶液浓度为0.1mol/L；腐植酸与b)NaOH的重量比为(0.05～1):1，所述NaOH溶液浓度为0.25mol/L；腐植酸与c)NaOH与Na4P2O7·10H2O的混合液的重量比为(0.002～0.12):1，混合液中NaOH与Na4P2O7·10H2O的溶液浓度分别为0.15mol/L和0.1mol/L；更佳地，所述抽提为超声波抽提；进一步更佳地，超声波的超声频率为20-100KHz，所述超声波的超声时间为1-15min。
较佳地，所述K2Cr2O7溶液的浓度为0.1mol/L，所述H2SO4溶液的浓度为18.4mol/L，所述标准品溶液与所述K2Cr2O7溶液的体积比为1:(1～3)，所述标准品溶液与所述H2SO4溶液的体积比为1:(3～9)；反应时间较佳地为0.01-0.10min。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
利用本发明的测定方法可以快速测定不同来源的黄腐酸、游离腐植酸以及总腐酸的含量，分析时间快速，硫酸和重铬酸钾的用量小，适于腐植酸的大规模测定；为本领域腐植酸测定提供了新的思路。另外，利用本发明色板还可以区分矿源性腐植酸以及非矿源性腐植酸。
附图说明
图1为利用紫外可见分光光度法分析不同来源的黄腐酸和总腐酸时的最灵敏波长确定；其中，1y-8y分别为黑龙江泥炭、云南保山褐煤、云南尚呈黄腐酸盐、新疆哈密风化煤、福建绿洲黄腐酸(BFA)、内蒙风化煤和泉林来源的黄腐酸，11y-88y分别为上述来源对应的总腐酸，Ty和Dy分别为红糖和蛋白胨。
图2为利用紫外荧光检测不同来源的黄腐酸和总腐酸时的最灵敏波长确定，1y-8y、11y-88y以及Ty和Dy的注释同上。
图3中A为黑龙江泥炭来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色，颜色下方的数值为其对应的潘通C色卡中的色号，其中下述图4-10中的数值及简写的含义同图3。
图4中A为云南保山褐煤来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
图5中A为云南尚呈黄腐酸盐来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
图6中A为新疆哈密风化煤来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
图7中A为福建绿洲腐植酸来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
图8中A为山西风化煤来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
图9中A为内蒙风化煤来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
图10中A为泉林来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
图11中A为红糖来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
图12中A为蛋白胨来源的黄腐酸和总腐酸的吸光度关于浓度的标准曲线，B为4种不同浓度的总腐酸和黄腐酸对应的颜色。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1标准品和色板的制备方法
(1)腐植酸的提取
可采用本领域常用的酸碱法，例如HG/T 3278-2011腐植酸钠肥料标准测试中的抽提方法，其中可将电热恒温水浴热抽提改成超声波抽提。
精密称量特定来源的腐植酸样本，精确到0.0001±0.0002g，0.20-0.80g置于50-100mL A试剂(0.1mol/L H2SO4)、0.05～0.50g置于50-100mL B试剂(0.25mol/L NaOH)或者0.01～0.30g置于50-100mL C试剂(0.15mol/L NaOH+0.1mol/LNa4P2O7·10H2O)后超声震荡(超声频率20-100KHz)溶解1-15min，过滤1-15min，即提取得到黄腐酸、游离腐植酸或者总腐酸。
(2)标准品溶液的配制以及颜色的记录
根据国家标准或者行业标准HG/T 3278-2011腐植酸钠肥料标准测试、MTT-1159-2011煤基腐植酸测定的标准技术、含腐植酸水溶肥NY1106-2010质量标准，或者ISO2013-5073褐煤腐植酸质量标准测定上述黄腐酸、游离腐植酸以及总腐酸的绝对含量。利用去离子水对上述标准品进行不同倍数的稀释，配制浓度梯度(0.25g/mL、0.50g/mL、0.75g/mL和1g/mL)的各标准溶液；先后加入1-3mL D试剂(0.1mol/L K2Cr2O7)和3-9mL E试剂(18.4mol/L H2SO4)，反应0.01-0.10min，并记录不同浓度标准品溶液所对应的颜色。
(3)标准曲线的制定
A.灵敏波长的确定
选择任一浓度的黄腐酸、游离腐植酸以及总腐酸的标准品的反应液进行紫外可见分光光度法或者紫外荧光分析法检测，得灵敏波长。本发明中，将来源于黑龙江泥炭、云南宝山褐煤、云南尚呈黄腐酸盐、新疆哈密风化煤、福建绿洲腐植酸、山西风化煤、内蒙风化煤以及泉林的黄腐酸和腐植酸在紫外可见分光光度法和紫外荧光分析法检测时的灵敏波长进行了统一测定，结果如图1和图2所示：紫外可见分光光度法分析时，黄腐酸的灵敏波长为430nm，总腐酸的灵敏波长为452nm；紫外荧光分析法检测时，黄腐酸的灵敏波长为410nm，总腐酸的灵敏波长为465nm。
B.制定标准曲线
将上述不同浓度的标准品溶液进行紫外荧光检测，得到不同浓度的黄腐酸、游离腐植酸以及总腐酸标准品的吸光度。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于不同腐植酸的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的标准色板。
由于本发明选用的几种煤种中游离腐植酸与总腐植酸的结果相似，故下述实施例中仅列举不同来源、不同浓度的黄腐酸和总腐酸的色板的制备。
实施例2黑龙江泥炭中腐植酸的色板的制备
(1)腐植酸的提取
根据实施例1记载的标准品的制备方法：精密称量2份重量分别为0.250g和0.160g的黑龙江泥炭腐植酸样本，分别置于50ml A试剂(0.1mol/L H2SO4)和50mL C试剂(0.15mol/L NaOH+0.1mol/LNa4P2O7·10H2O)中20KHz超声震荡1min，使用0.05-8μm的定量过滤膜分别过滤1min后得黄腐酸和总腐酸。
(2)标准品溶液的配制
根据上述国家行业标准测定所得黄腐酸和总腐酸的绝对含量，然后使用去离子水将得到的黄腐酸和总腐酸均稀释为4个浓度：0.25g/mL、0.50g/mL、0.75g/mL和1g/mL的标准品溶液。先后加入1mL D试剂(0.1mol/L K2Cr2O7)和3mL E试剂(18.4mol/L H2SO4)，反应0.01min，并记录不同浓度标准品溶液所对应的颜色。
(3)标准曲线的制定
将上述4种浓度的标准品溶液进行紫外可见分光光度法分析，得到4种浓度的黄腐酸以及总腐酸标准品的吸光度。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于黑龙江泥炭的黄腐酸和总腐酸的标准色板(图3)。
实施例3云南保山褐煤中腐植酸的色板的制备
(1)腐植酸的提取
根据实施例1记载的标准品的制备方法：精密称量2份重量分别为0.688g和0.144g的云南宝山褐煤腐植酸样本，分别置于100ml A试剂(0.1mol/L H2SO4)和100mL C试剂(0.15mol/L NaOH+0.1mol/LNa4P2O7·10H2O)中100KHz超声震荡15min，使用0.05-8μm的定量过滤膜分别过滤15min后得黄腐酸和总腐酸。
(2)标准品溶液的配制
根据国家行业标准测定所得黄腐酸和总腐酸的绝对含量，然后使用去离子水将得到的黄腐酸和总腐酸均稀释为4个浓度：0.25g/mL、0.50g/mL、0.75g/mL和1g/mL的标准品溶液。先后加入3mL D试剂(0.1mol/L K2Cr2O7)和9mL E试剂(18.4mol/L H2SO4)，反应0.10min，并记录不同浓度标准品溶液所对应的颜色。
(3)标准曲线的制定
将上述4种浓度的标准品溶液进行紫外可见分光光度法分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于云南宝山褐煤的黄腐酸和总腐酸的标准色板(图4)。
实施例4云南尚呈黄腐酸盐中腐植酸的色板的制备
精密称量2份重量分别为0.695g和0.160g云南尚呈黄腐酸盐腐植酸样本，根据实施例2记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸，配置浓度梯度的标准溶液，加入D试剂和E试剂，记录不同浓度标准溶液颜色后，对不同浓度的标准液进行紫外可见分光光度分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于云南尚呈黄腐酸盐中的黄腐酸和总腐酸的标准色板(图5)。
实施例5新疆哈密风化煤中腐植酸的色板的制备
精密称量2份重量分别为0.698g和0.155g新疆哈密风化煤腐植酸样本，根据实施例2记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸，配置浓度梯度的标准溶液，加入D试剂和E试剂，记录不同浓度标准溶液颜色后，对不同浓度的标准液进行紫外可见分光光度分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于新疆哈密风化煤的黄腐酸和总腐酸的标准色板(如图6)。
实施例6福建绿洲腐植酸中腐植酸的色板的制备
精密称量2份重量分别为0.816g和0.1642g的福建绿洲腐植酸样本，根据实施例1记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸，配置浓度梯度的标准溶液，加入D试剂和E试剂，记录不同浓度标准溶液颜色后，对不同浓度的标准液进行紫外可见分光光度分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于福建绿洲腐植酸来源的黄腐酸和总腐酸的标准色板(如图7)。
实施例7山西风化煤中腐植酸的色板的制备
精密称量2份重量分别为0.455g和0.145g山西风化煤腐植酸样本，根据实施例2记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸，配置浓度梯度的标准溶液，加入D试剂和E试剂，记录不同浓度标准溶液颜色后，对不同浓度的标准液进行紫外可见分光光度分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于山西风化煤来源的黄腐酸和总腐酸的标准色板(如图8)。
实施例8内蒙风化煤中腐植酸的色板的制备
精密称量2份重量分别为0.723g和0.2211g内蒙风化煤腐植酸样本，根据实施例2记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸，配置浓度梯度的标准溶液，加入D试剂和E试剂，记录不同浓度标准溶液颜色后，对不同浓度的标准液进行紫外可见分光光度分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于内蒙风化煤来源的黄腐酸和总腐酸的标准色板(如图9)。
实施例9泉林腐植酸色板的制备
精密称量2份重量分别为0.500g和0.25g泉林腐植酸样本，根据实施例2记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸，配置浓度梯度的标准溶液，加入D试剂和E试剂，记录不同浓度标准溶液颜色后，对不同浓度的标准液进行紫外可见分光光度分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
根据所得标准曲线对照不同浓度标准品溶液的颜色制备来源于泉林来源的黄腐酸和总腐酸的标准色板(如图10)。
应用实施例1
精密称量2份重量分别为0.7883g和0.1735g的福建绿洲腐植酸样本，根据实施例2记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸。分别吸取1ml所得黄腐酸和总腐酸，均先后加入1ml D试剂和3ml E试剂，反应0.01分钟，记录所得两种反应液的颜色：前者介于草绿与深草绿之间，后者介于秋橘红与咖啡色之间。初步判断该样本中黄腐酸和总腐酸的浓度均介于0.25～0.50g/ml之间；再根据溶液的体积，得到黄腐酸和总腐酸的含量。同时，对其进行紫外可见分光光度分析，测得上述黄腐酸和总腐酸的吸光度分别为0.16L/(g·cm)和0.35L/(g·cm)，分别利用拟合方程y＝0.773x+0.1195和y＝0.0776x+0.0466计算得到黄腐酸和总腐酸的浓度均为0.4g/ml。
应用实施例2
精密称量重量为0.186g的红糖样本，根据实施例1记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸，配置浓度梯度的标准溶液，记录不同浓度标准溶液颜色后，对不同浓度的标准液进行紫外可见分光光度分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
根据所得标准曲线的斜率，获得不同矿源黄腐酸、总腐植酸质量浓度与吸光度之间的定量关系。从标准曲线图可以看出，(1)纯度较高的矿源黄腐酸、矿源总腐植酸质量递增与吸光度之间斜率呈正比关系明显。(2)矿源黄腐酸含量低的和非矿源的黄腐酸浓度与吸光度斜率之间变化小、灵敏度低，可以通过紫外和荧光分析进一步区分。(3)矿源总腐酸、包括福建、泉林的生化总腐酸的质量递增与吸光度之间斜率递增也明显，而红糖样品，其质量浓度与吸光度之间的斜率低。因此，在紫外和荧光定性的基础上，在已知原料或产品定位的基础上，通过标准曲线的建立，可区分黄腐酸以及总腐酸来源为非矿源性的(如图11)，也可以快速地定量。
应用实施例3
精密称量重量为0.222g的蛋白胨，根据实施例1记载的方法：提取样本中的黄腐酸和总腐酸，配置浓度梯度的标准溶液，记录不同浓度标准溶液颜色后，对不同浓度的标准液进行紫外可见分光光度分析，得不同浓度的标准品与吸光度的对应关系。
同应用实施例2，根据所得标准曲线的斜率低，可知该黄腐酸以及总腐酸的来源为非矿源性(如图12)。

Claims (10)

1.一种用于定量测定腐植酸的色板的制备方法，所述腐植酸包括黄腐酸、游离腐植酸和/或总腐酸，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)提取不同来源的腐植酸的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸作为标准品；
(2)根据已有的国家或行业标准测定所述黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的含量，并配制成梯度浓度的各腐植酸的标准品溶液；
(3)在步骤(2)所得标准品溶液中依次加入K2Cr2O7溶液和H2SO4溶液进行显色反应得反应液，记录不同浓度的各标准品溶液的反应液对应的颜色；
(4)选择步骤(3)所得任一浓度的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸标准品溶液进行紫外可见分光光度法或者紫外荧光分析法检测，得灵敏波长；
(5)利用所得波长对不同浓度的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸标准品的反应液进行紫外可见分光光度或者紫外荧光检测；
(6)制定不同来源的腐植酸的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的浓度与吸光度的标准曲线；
(7)根据步骤(6)所得标准曲线对照步骤(3)中的颜色，制备来源于不同腐植酸的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的标准色板。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述腐植酸的来源为黑龙江泥炭、云南宝山褐煤、云南尚呈黄腐酸盐、新疆哈密风化煤、福建绿洲腐植酸、山西风化煤、内蒙风化煤或者泉林腐植酸。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述提取的方法为：在所述不同来源的腐植酸中分别加入a)H2SO4溶液、b)NaOH溶液或c)NaOH与Na4P2O7·10H2O的混合液，进行抽提，制得黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的标准品；较佳地，腐植酸与a)H2SO4的重量比为(0.2～1.6):1，所述H2SO4溶液浓度为0.1mol/L；腐植酸与b)NaOH的重量比为(0.05～1):1，所述NaOH溶液浓度为0.25mol/L；腐植酸与c)NaOH与Na4P2O7·10H2O的混合液的重量比为(0.002～0.12):1，混合液中NaOH与Na4P2O7·10H2O的溶液浓度分别为0.15mol/L和0.1mol/L；较佳地，所述抽提为超声波抽提；更佳地，所述超声波的超声频率为20-100KHz，所述超声波的超声时间为1-15min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的浓度梯度为0.25g/ml、0.50g/ml、0.75g/ml和1g/ml；和/或，步骤(3)中所述K2Cr2O7溶液的浓度为0.1mol/L，所述H2SO4溶液的浓度为18.4mol/L，所述标准品溶液与所述K2Cr2O7溶液的体积比为1:(1～3)，所述标准品溶液与所述H2SO4溶液的体积比为1:(3～9)；和/或，所述反应时间为0.01-0.10min。
5.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的灵敏波长为400～780nm，较佳地为410～465nm；更佳地，进行所述紫外可见分光光度检测时，黄腐酸对应的灵敏波长为430nm，游离腐植酸和总腐酸对应的灵敏波长均为452nm，进行所述紫外荧光检测时，黄腐酸的灵敏波长为410nm，游离腐殖酸和总腐酸的灵敏波长均为465nm。
6.一种如权利要求1～5任一项所述的制备方法制得的色板，所述色板包括不同来源腐植酸的标准品的色板。
7.如权利要求6所述的色板，其特征在于，所述不同来源的腐植酸的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸的标准品，4个如权利要求4所述的制备方法中浓度梯度由低到高对应的颜色具体如下所述：
若标准品来源为黑龙江泥炭，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为草绿、军绿、深绿和湖绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为棕红、咖啡色、秋橘红和草绿；
若标准品来源为福建绿洲腐植酸，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为草绿、深草绿、深绿和森林绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、咖啡色、橘红和草绿；
若标准品来源为云南保山褐煤，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、暗黄和湖绿、荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为浅橘红、秋橘红、暗黄和浅黄；
若标准品来源为山西风化煤，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为浅橘红、薄荷绿、湖绿和荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为咖啡色、浅黄、湖绿和深绿；
若标准品来源为云南尚呈黄腐酸盐，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为咖啡色、暗绿、湖绿和荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、咖啡、暗黄和浅黄；
若标准品来源为内蒙风化煤，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为浅橘红、暗黄、湖绿和荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、咖啡色、暗黄和浅黄；
若标准品来源为新疆哈密风化煤，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为深咖啡色、军绿、湖绿和荧光绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为秋橘红、咖啡色、暗绿和暗黄；
或者，若标准品来源为泉林腐植酸，其中的总腐酸或游离腐植酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为暗黄、军绿、深绿和森林绿；其中的黄腐酸，4个浓度梯度由低到高对应的颜色依次为暗绿、深绿、湖绿和荧光绿。
8.一种腐植酸的测定方法，所述腐植酸包括黄腐酸、游离腐植酸和/或总腐酸，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)精确称量不同来源的腐植酸待测样品3份；
(2)分别提取待测样品中的黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸，在各取提溶液中依次加入K2Cr2O7溶液和H2SO4溶液进行显色反应；
(3)将步骤(2)中待测黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸各自显色反应的颜色与权利要求6或7所述的色板比对，分别得到不同腐植酸的浓度区间。
9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述测定法还包括步骤(4)：对步骤(2)所得反应液进行紫外可见分光光度法和/或紫外荧光分析法检测得吸光度，对应权利要求1所述制备方法的步骤(6)中制定的标准曲线得准确浓度。
10.如权利要求8或9所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)所述提取包括：在所述不同来源的腐植酸中分别加入a)H2SO4溶液、b)NaOH溶液或c)NaOH与Na4P2O7·10H2O的混合液，进行抽提，分别制得黄腐酸、游离腐植酸或总腐酸标准品；较佳地，腐植酸与a)H2SO4的重量比为(0.2～1.6):1，所述H2SO4溶液浓度为0.1mol/L；腐植酸与b)NaOH的重量比为(0.05～1):1，所述NaOH溶液浓度为0.25mol/L；腐植酸与c)NaOH与Na4P2O7·10H2O的混合液的重量比为(0.002～0.12):1，混合液中NaOH与Na4P2O7·10H2O的溶液浓度分别为0.15mol/L和0.1mol/L；较佳地，所述抽提为超声波抽提；更佳地，所述超声波的超声频率为20-100KHz，所述超声波的超声时间为1-15min；和/或，
所述显色反应的时间为0.01-0.10min，所述K2Cr2O7溶液的浓度为0.1mol/L，所述H2SO4溶液的浓度为18.4mol/L，所述标准品溶液与所述K2Cr2O7溶液的体积比为1:(1～3)，所述标准品溶液与所述H2SO4溶液的体积比为1:(3～9)。
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