CN104342465B - 三种拟青霉对何首乌的微生物转化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用三种拟青霉发酵转化何首乌的方法。该方法主要包括:(1)三种拟青霉的制备;(2)三种拟青霉固体发酵培养基的制备;(3)三种拟青霉固体发酵培养;(4)三种拟青霉固体发酵培养物后处理。本发明所提出的利用三种拟青霉发酵转化何首乌的方法,培养物同时含有药用多糖、甘露醇、3ˊ‑脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚,其中何首乌中主要成分二苯乙烯苷含量提高了20%。本发明操作简便,效果良好,可进行大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属微生物技术领域,具体是利用三种拟青霉对中药何首乌进行微生物转化的方法。
背景技术
蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel.)Samson、蛹草拟青霉Paecilomycesmilitaris Liang、蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen&Dai是三种重要的药用真菌,其主要发酵产物是多糖、甘露醇、3ˊ-脱氧腺苷和腺苷等,具有免疫调节、治疗肾衰、抗肿瘤、抗炎症、调节内分泌、抗心律失常、延缓衰老、耐缺氧等方面的作用。
何首乌是一味传统的中药,为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的块根,性味苦、甘、涩、微温,为补益类中药,入肝、心和肾经。《本草纲目》记载何首乌“养血益肝,固精益肾,健筋骨,乌须发,为滋补良药,不寒不燥,功在地黄、天门冬诸药之上”。何首乌含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、磷脂类、糖类、多种氨基酸、多种维生素及微量元素等,具有抗衰老、增强免疫、降血脂、抗心肌缺血、改善脑缺血、神经保护、抗骨质疏松等作用。
临床应用有生首乌和制首乌之别。生首乌因含有结合型蒽醌而具有轻度泻下作用,制首乌是生首乌炮制而成,在此过程中,结合型蒽醌可转变为游离型(彭晓波,中国现代药物应用,2008,2(19):117)。所以,生首乌有小毒,而制首乌毒性甚微。杜晨晖等人利用毛霉和米根霉对何首乌进行微生物发酵,其目的主要是降低何首乌的毒性(杜晨晖等,天然产物研发与开发,2008,20:540-544)。本发明选用的材料是制首乌,应用三种药用真菌进行发酵,使培养物兼具微生物和中药的功效成分,提高治疗和保健的功效,是颇具发展潜力的研发领域。该发明主要是利用蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen&Dai、蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang和蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel.)Samson对何首乌进行生物转化,一次发酵可同时获得药用多糖、甘露醇、3ˊ-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚,其中何首乌中主要成分二苯乙烯苷含量提高20%。
发明内容
本发明提供一种利用三种拟青霉发酵转化何首乌,同时获得拟青霉和何首乌活性成分,且提高何首乌主要成分二苯乙烯苷含量的方法。
该方法的操作步骤如下:
(1)生产菌株为蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel.)Samson;蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang;蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen&Dai。
(2)菌种制备:将步骤(1)所述菌株蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel.)Samson;蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang;蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyceshepiali Chen&Dai分别接种到PPDA斜面培养基,于20~25℃恒温培养7~10d,用无菌水洗下孢子,稀释调整使孢子终浓度达到5×107个/毫升。
(3)固体发酵培养基制备:固体培养基配方为何首乌粉30~40g(制首乌粉碎获得);蔗糖2g;蛋白胨1g;洋芋粉5g;粗麸皮10~20g,混匀,装入1000ml三角瓶中,加入去离子水,使最终培养基的水料比为1.2:1,121℃高压灭菌30min。
(4)固体发酵培养:将步骤(2)中制备好的菌种分别按2.5ml/瓶的量接入步骤(3)三角瓶固体培养基中,于10~25℃,静置培养20~30天。
(5)固体发酵物后处理:将步骤(4)中培养好的固体发酵物取出,55℃恒温干燥至恒重,然后粉碎至80目粉末,采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量;HPLC法测定3ˊ-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量。
本发明关键点在于:使用三种拟青霉对植物药材何首乌进行微生物转化,一次发酵过程同时获得药用真菌药效成分和何首乌药效成分,且明显提高何首乌中二苯乙烯苷含量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不是对本发明的限制。
实施例1:不同培养温度对发酵产物有效成分种类和含量的影响
(1)菌种制备:将蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel.)Samson;蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang;蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen&Dai接种到PDA斜面培养基,于23℃恒温培养10d,用无菌水洗下孢子,稀释调整使孢子终浓度达到5×107个/毫升。
(2)固体共发酵培养基的制备:固体培养基的配方为何首乌40g;蔗糖2g;蛋白胨1g;洋芋粉5g;粗麸皮10g,装入1000ml三角瓶中,水料比为1.2:1,121℃灭菌30min。
(3)固体共发酵培养:将制备好的菌种分别按2ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中,于10℃和30℃,静置培养25天,(注:空白对照未接菌,其余条件相同)。
(4)固体发酵物后处理:将步骤(3)中培养好的固体发酵物取出,55℃恒温干燥至恒重,然后粉碎至80目粉末,采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量;采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量;HPLC法测定3ˊ-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量,其结果见表1。
表1不同培养温度对发酵产物有效成分种类和含量的影响
实施例2:不同培养时间对发酵产物有效成分种类和含量的影响
(1)菌种制备:将蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel.)Samson;蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang;蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen&Dai接种到PDA斜面培养基,于25℃恒温培养10d,用无菌水洗下孢子,稀释调整使孢子终浓度达到5×107个/毫升。
(2)固体共发酵培养基的制备:固体培养基的配方为:何首乌30g;蔗糖2g;蛋白胨1g;洋芋粉5g;粗麸皮20g,装入1000ml三角瓶中,水料比为1.2:1,121℃灭菌30min。
(3)固体共发酵培养:将制备好的菌种分别按2ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中,于25℃,静置培养10~30天。
(4)固体发酵物后处理:将步骤(3)中培养好的固体发酵物取出,55℃恒温干燥至恒重,然后粉碎至80目粉末,采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量;HPLC法测定腺苷、3ˊ-脱氧腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量,其结果见表2。
表2不同培养时间对发酵产物有效成分种类和含量的影响
Claims (1)
1.一种利用三种拟青霉发酵转化何首乌的方法,其特征在于该方法包括:
(1)菌种制备:将蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel.)Samson;蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang;蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen&Dai三种菌株,分别接种到PDA斜面培养基,于20~25℃恒温培养7~10d,用无菌水洗下孢子,稀释调整使孢子终浓度达到5×107个/毫升;
(2)固体发酵培养基的制备:固体培养基的配方为:何首乌30~40g;蔗糖2g;蛋白胨1g;洋芋粉5g;粗麸皮10~20g,装入1000ml三角瓶中,水料质量比为1.2:1,121℃灭菌60min;
(3)固体发酵培养:将制备好的拟青霉分别按2ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中,静置培养;培养的时间和温度为:三种拟青霉分别在25℃培养30天或三种拟青霉分别在30℃培养25天或蝉拟青霉在10℃培养25天。
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