发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷,提供一种细脚拟青霉人工培养方法,及其产物在制药中的用途。
本发明一方面提供了一种细脚拟青霉人工培养方法,包括下列步骤:
1)斜面菌种制备:将细脚拟青霉菌株接种到斜面培养基上,20~25℃下,培养7~10天;所述斜面培养基为PSA(马铃薯蔗糖琼脂培养基)、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)或YMB固体培养基。
2)摇瓶种子液的制备:从步骤1)中制得的斜面上刮取菌丝接种到以PSB(马铃薯蔗糖液体培养基)或PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基)为种子培养基的培养液中,24~26℃下,140~160rpm,培养3~5天即制得细脚拟青霉摇瓶种子液;
3)将步骤2)中制得的摇瓶种子液按重量百分比为5%~10%接入灭菌后的PSB或PDB液体培养基为种子培养基的发酵罐中,24~26℃下,140~160rpm,培养1~2天即制得细脚拟青霉发酵罐种子液;
4)将步骤3)中制得的发酵罐种子液按重量百分比为5%~10%接入灭菌后的固相培养基中,在温度为23~26℃,湿度为50~90%的条件下,静置封闭式培养30~35天;湿度优选为70-80%。
5)采收。
所述细脚拟青霉子实体的固相培养基的组分及各组分的重量份为:
大麦 30-40
H2O 70-60
用此种培养基培养出来的细脚拟青霉产量分别比用小米、小麦、大米、大麦加高粱、小麦加大麦为培养基培养的细脚拟青霉产量分别高90%、31%、200%、250%和30%。
步骤1)所述菌株优选菌种保藏号为CGMCC NO.4176的细脚拟青霉菌株。此菌种为申请人从采集的鳞翅目幼虫感病体中分离纯化后筛选获得。
该菌株已于2010年9月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为CGMCC No.4176,分类命名为:细脚拟青霉Paecilomyces tenuipes,保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
经中国科学院微生物研究所形态特征鉴定,细脚拟青霉菌CGMCC No.4176的主要形态特征为:
在马铃薯蔗糖琼脂培养基上菌落白色,致密,初期背面浅黄色,后期菌落上形成大量孢梗束,背面呈浅黄褐色。菌丝无色,分枝,平滑,具隔膜,宽1.5-3.0μm。分生孢子梗从菌丝上伸出,无色,平滑,分枝,长达110.0μm,宽达4.0μm。孢梗束白色至奶油黄色,长10-30厘米,产孢细胞瓶状,无色,2-6个簇生在孢子梗上呈帚状,顶部变细窄,5.0-8.0×2.5-3.2μm。分生孢子大部分圆柱形,部分椭圆形,也有腊肠形弯曲,单孢,无色,平滑,链生,5.0-6.7×2.0-2.5(3.0)μm。
在查氏培养基上,灰白色,拱起,蓬松,绒毛状,孢梗束生长差或不长。在萨氏培养基上未见菌落生长。
该菌生长最适温度为24-26℃,在pH 3-11之间均能够生长,但pH5.0-6.7之间生长最佳。在固体谷物培养基上发酵,菌苔灰白色,子实体(孢梗束)色泽鲜黄,生育甚佳,采收期30-40天。
此菌培养产物通过分析表明,化学组分均含天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等;微量元素含钾、钙、镁、铁、锌、铜、 锰、镍、硒等;此外,多糖、腺苷、甘露醇、甾醇、有机酸和生物碱类与冬虫夏草活性成分上基本一致或超过冬虫夏草。
优选的,步骤3)接种固体培养基后,静置固体发酵,加人工散射光源(连续增加光照强度100-150Lux),并定时通风排气(间隔6-8小时进行通风排气,每次送风、排气30-40分钟),调节空气中氧气、二氧化碳浓度。上述培养条件更利于形成子实体。
本发明的培养方法获得的细脚拟青霉子实体,腺苷含量可达1.4mg/g以上,虫草酸含量可达47mg/g,总糖含量可达186mg/g。
本发明第二方面提供了一种细脚拟青霉人工培养产物,为上述培养方法培养后采收获得。
进一步的,所述细脚拟青霉人工培养产物可以是采收获得的子实体。
本发明第三方面提供了上述细脚拟青霉人工培养产物在制备预防及治疗肝脏疾病的药物或保健品中的应用。
所述肝脏疾病可以是化学性肝损伤、病毒性肝炎或肝纤维化等。
本发明第四方面,提供一种预防及治疗肝脏疾病的中药制剂,所述中药制剂的主要药效成分为所述细脚拟青霉人工培养产物或所述细脚拟青霉人工培养产物的有效成分提取物。
本发明还提供了所述预防及治疗肝脏疾病的中药制剂的制备方法,所述制备方法选自如下方法中的任一种:
1)粉碎:将所述细脚拟青霉人工培养产物干燥后直接粉碎,过筛制得所述中药制剂;
2)将所述细脚拟青霉人工培养产物提取有效成分后干燥获得所述中药制剂。
所述细脚拟青霉人工培养产物提取有效成分的方法可以采用常规的中药有效成分提取方法来提取其有效成分,如采用溶剂提取。
较佳的,所述采用溶剂提取为采用有机溶剂、水或有机溶剂与水的混合液提取;所述有机溶剂可选自乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮和石油醚中的一种或多种的混合物;所述有机溶剂和水的混合溶液优选为乙醇水溶液。进一步优选为水提。
较佳地,所述水提的方法为:将所述细脚拟青霉人工培养产物加水煎煮(所用水量为细脚拟青霉人工培养产物重量的6-10倍),过滤,浓缩至适量。所述煎煮次数较佳为2~3次,每次煎煮时间为15~60分钟。
优选地,所述水提法中,煎煮后得到的煎液先过80目筛,抽滤除杂。
优选地,所述水提法中,所述浓缩为减压薄膜浓缩。
进一步的,水提法浓缩后采用喷雾干燥法干燥。
本发明的中药制剂中除含有所述细脚拟青霉人工培养产物或细脚拟青霉人工培养产物的有效成分提取物外,还可含有药物可接受的载体,载体的重量百分比含量可为1-50%,优选为20%-38%。
本发明的中药制剂可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的制剂形式,包括口服制剂。优选的是胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、糖浆剂,最优选为胶囊剂。
本发明的中药制剂可用于预防及治疗化学性肝损伤、病毒性肝炎、肝纤维化等肝脏疾病。安全有效、无明显毒副作用。
本发明的发酵方法而获得的细脚拟青霉人工培养产物人具有产量高的优势。用此种发酵方法培养出来的细脚拟青霉产量分别比用小米、小麦、大米、大麦加高粱、小麦加大麦为培养基培养的细脚拟青霉产量高90%、31%、200%、250%和30%。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 细脚拟青霉的人工培育。
将细脚拟青霉菌株(CGMCC NO.4176)接种到PSA斜面培养基上,22℃下,培养10天;从斜面上刮取菌丝接种到以PDB液体为基础的三角瓶液体培养基中,24℃下,140rpm,培养3天即可制得蝉拟青霉摇瓶种子液;将细脚拟青霉摇瓶种子液按体积百分比为10%接入灭菌后的PSB液体为种子培养基的发酵罐中,24℃下,搅拌速率140rpm,培养2天即可制得细脚拟青霉发酵罐种子液;将制得的发酵罐种子液按重量百分比为5%接入灭菌后的所述固相培养基中,在温度为24℃,湿度为70%的条件下,固体发酵时,增加人工散射光源(连续增加光照强度150Lux),并定时通风排气(间隔8小时进行通风排气,每次送风、排气30分钟)静置封闭式培养35天后采收。
本实施方式所述的固体培养基配比为大麦40重量份,水为60重量份;其制备方法为:将大麦和水按比例混合,高压蒸汽灭菌后,即得。
实施例2
细脚拟青霉的人工培育
将细脚拟青霉菌株(CGMCC NO.4176)接种到PSA斜面培养基上,23℃下,培养9天;从斜面上刮取菌丝接种到以PSA液体为基础的三角瓶液体培养基中,25℃下,150rpm,培养3天即可制得蝉拟青霉摇瓶种子液;将细脚拟青霉摇瓶种子液按体积百分比为5%接入灭菌后的PSB液体为种子培养基的发酵罐中,25℃下,搅拌速率150rpm,培养2天即可制得细脚拟青霉发酵罐种子液;将制得的发酵液按重量百分比为10%接入灭菌后的所述固相培养基中,在温度为25℃,湿度为75%的条件下,固体发酵时,固体发酵时,增加人工散射光源(连续增加光照强度140Lux),并定时通风排气(间隔6小时进行通风排气,每次送风、排气40分钟)静置封闭式培养33天后采收。
本实施方式所述的固体培养基配比为大麦30重量份,水为70重量份;其制备方法为:将大麦和水按比例混合,高压蒸汽灭菌后,即得。
实施例3
细脚拟青霉的人工培育
将细脚拟青霉菌株(CGMCC NO.4176)接种到PSA斜面培养基上,24℃下,培养8天;从斜面上刮取菌丝接种到以PDA液体为基础的三角瓶液体培养基中,26℃下,160rpm,培养3天即可制得蝉拟青霉摇瓶种子液;将细脚拟青霉摇瓶种子液按体积百分比为8%接入灭菌后的PSB液体为种子培养基的发酵罐中,26℃下,搅拌速率160rpm,培养1天即可制得细脚拟青霉发酵罐种子液;将制得的发酵液按重量百分比为10%接入灭菌后的所述固相培养基中,在温度为26℃,湿度为80%的条件下,固体发酵时,固体发酵时,增加人工散射光源(连续增加光照强度130Lux),并定时通风排气(间隔6小时进行通风排气,每次送风、排气40分钟)静置封闭式培养30天后采收。
本实施方式所述的固体培养基配比为大麦30重量份,水为70重量份;其制备方法为:将大麦和水按比例混合,高压蒸汽灭菌后,即得。
实施例4 细脚拟青霉人工培养产物的有效成分检测
1、腺苷含量测定
1.1仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(1525BINARY HPLC PUMP,2998 Photodiode Array Detector,美国Waters公司);SB25-12DT超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);Millipore Simplicity 超纯水仪(美国Millipore公司);乙腈(HPLC级,Fisher);磷酸二氢钾(AR级,国药集团化学试剂有限公司);石油醚(AR级,60-90℃,国药集团化学试剂有限公司);腺苷(A9251-1G,Sigma公司)。
1.2方法
1.2.1色谱条件
色谱柱:XBridge C18色谱柱(Waters,4.6mm×250mm,5μm);XBridge C18Guard4.6mm×20mm,5μm;流动相:乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾(5:95);流速:1.0mL/min;检测波长:260nm;柱温:35℃;进样量:20μL。
1.2.2对照品溶液的制备
精密称取50mg腺苷对照品,置50mL容量瓶中,加超纯水溶解并稀释至刻度制成1mg/mL溶液。精密移取适量1mg/mL腺苷对照品溶液,分别配制成100μg/mL、50μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和1μg/mL腺苷对照品溶液,备用。
1.2.3供试品溶液的制备
精密称取1.0118g细脚拟青霉样品粉末(实施例1采收子实体),于100mL具塞锥形瓶中,加10mL石油醚(60-90℃),超声30min。过滤,挥干石油醚,连同滤纸一并放入瓶中。在瓶中加入20mL超纯水,称总重(包括锥形瓶重量),超声30min。快速冷却后称重,以超纯水补至总重,混匀后离心,取上清液,过针筒式滤器得样品提取液。
1.2.4标准曲线绘制
将对照品1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL溶液进样,按1.2.1项下色谱条件测定,以样品浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积(微伏·秒)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程。
1.2.5供试样品腺苷含量测定
取1.2.3项下制备的供试样品溶液与超纯水以1:1的比例混匀,制成待测液。取待测液按1.2.1项下色谱条件进样,由回归方程得待测液腺苷浓度X,根据下列公式得到供试品腺苷含量(mg/g)。计算公式:
1.3结果
1.3.1腺苷标准曲线
腺苷标准曲线y=7.08e+004x-1.05e+004,R2=0.999978,在1~100μg/mL与峰面积线性关系良好
1.3.2细脚拟青霉样品腺苷含量测定结果
2、虫草酸含量测定
2.1仪器与试药
紫外可见分光光度计;电子天平;离心机H-1650;电热恒温水箱CU600型;可调式封闭电炉。甘露醇标准品、醋酸铵、乙酰丙酮、冰醋酸、高碘酸钾、L-鼠李糖,均为AR级、国药集团化学试剂有限公司生产。
2.2试剂配制
高碘酸钾溶液:15mmol(即3.45g)高碘酸钾溶于1L0.12mol/L盐酸溶液中。Nash试剂:150g醋酸铵+2mL冰醋酸+2mL乙酰丙酮,用蒸馏水稀释至1L(现用现配)。L-鼠李糖溶液:L-鼠李糖100mg,用蒸馏水定容至100mL。
2.3实验方法
2.3.1供试品溶液的制备
精确称取1.0034g样品(实施例1采收子实体)置于干燥的500mL锥形瓶内,记录锥形瓶与样品的总质量m1,向锥形瓶中加入沸腾蒸馏水100mL,放置于电炉之上使其持续沸腾15min后,迅速放于冷水中冷却至室温,取出,擦干瓶外壁的水珠,加入蒸馏水至最终质量为m1+100g,摇匀,过滤,取滤液,即为待测样品,-20℃保存。
2.3.2标准曲线绘制
精密称取D-甘露醇标准品0.1g于烧杯中,加少量蒸馏水溶解完全,转移至100mL容量瓶中定容,配制成1mg/mL的甘露醇溶液,进行稀释后,得到质量浓度分别为10、50、90、130、170mg/L的甘露醇标准溶液。取上述浓度标准品甘露醇溶液各1mL,分置不同试管中,然后分别加1mL高碘酸钠溶液,混匀,室温放置10min,加2mL0.1%L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐,振荡混匀,加4mL新鲜配制的Nash试剂,53℃水浴加热15min使其显色,快速冷却至室温,在412nm波长处测定其吸光度。以蒸馏水代替 甘露醇标准溶液,用同样的方法操作作为对照,测定其吸光度。以标准液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程。
2.3.3供试样品虫草酸含量测定
将供试样品提取液加蒸馏水8倍稀释,取1ml稀释后的样品置于具塞试管中,按2.3.2项下测定吸光值,每管样品测3次Abs,求出平均值,由回归方程得待测液虫草酸浓度x,根据下列公式得到供试品虫草酸含量(mg/g)。计算公式:
2.4结果
2.4.1虫草酸标准曲线
以标准品甘露醇浓度(mg/mL)为横坐标,Abs为纵坐标,得回归方程:y=0.0826x+0.0019,R2=0.9998,说明标准品甘露醇量在0~21.25mg/L范围内,与Abs呈良好的线性关系。
2.4.2细脚拟青霉样品虫草酸含量测定结果
3、总糖含量测定
3.1仪器与试药
紫外可见分光光度计;电子天平;可调式封闭电炉;离心机H-1650。
无水葡萄糖(AR);苯酚(AR);浓硫酸(AR),均为国药集团化学试剂有限公司生产。
3.2试剂配制
5%苯酚溶液:精确称取5g苯酚,用水定容至100ml。
葡萄糖标准液配制:配制浓度为0.25mg/mL的葡萄糖标准液,精确称取0.2500g烘干后的葡萄糖,加水定容至1000mL。
3.3实验方法
3.3.1供试品溶液的制备
精确称取1.0034g样品置于干燥的500mL锥形瓶内,记录锥形瓶与样品的总质量m1,向锥形瓶中加入沸腾蒸馏水100mL,放置于电炉之上使其持续沸腾15min后,迅速放于冷水中冷却至室温,取出,擦干瓶外壁的水珠,加入蒸馏水至最终质量为m1+100g,摇匀,过滤,取滤液,即为待测样品,-20℃保存。
3.3.2标准曲线绘制
精密称取无水葡糖0.2500g,用蒸馏水配制成0.25mg/mL的葡萄糖标准品溶液,吸取葡萄糖标准液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1mL,分别置于具塞试管中,各加蒸馏水,使体积为2.0mL,再加5%苯酚溶液1mL,摇匀,迅速滴加98%硫酸5mL,摇匀后放置5分钟,置沸水浴中加热15分钟,取出冷水冷却至室温;另加蒸馏水2mL,同上操作做空白对照,于490nm处测定吸光值(Abs)。以标准液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程。
3.3.3供试样品总糖含量测定
精确移取样品提取液0.1mL加至具塞试管中,加蒸馏水补至2mL,按3.3.2项下测定吸光值,每管样品测3次Abs,求出平均值,由回归方程得待测液总糖浓度x,根据下列公式得到供试品总糖含量(mg/g)。计算公式:
3.4结果
3.4.1葡萄糖标准曲线
以标准品葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标,Abs为纵坐标,得回归方程:y=0.6622x+0.0088,R2=0.9997,说明标准品葡萄糖量在0~2.75mg/mL范围内,与Abs呈良好的线性关系。
3.4.2细脚拟青霉样品总糖含量测定结果
实施例5 中药制剂的制备方法之一
将采收的新鲜细脚拟青霉人工培育物,70℃干燥10h,通过粉碎机粉碎,过120目筛网,辐照灭菌,取粉末500g,装入胶囊,制成1000粒,即得。
实施例6 中药制剂的制备方法之二
将将采收的细脚拟青霉人工培育物加8倍蒸馏水共煎煮2次,每次0.5小时,煎液采用真空抽滤,除去杂质,得滤液,减压薄膜浓缩至适量,喷雾干燥即得干燥粉。
实施例7 细脚拟青霉人工培养物急性经口毒性试验
受试样品配制:称取细脚拟青霉人工培养物样品10000mg(实施例1获得),加蒸馏水至40mL,充分混匀后作为受试样品。
实验动物:小鼠20只,雌雄各半,体重19-22克。
实验方法:动物禁食(不禁水)16小时后,按体重要求选用雌、雄小鼠各10只,分放于两鼠笼内,同性别小鼠之间体重之差不超过3g。将受试样品采用最大耐受剂量法对实验动物染毒,小鼠逐只称重,灌胃容量按每次0.4mL/20g体重计,在24小时内二次对小鼠灌胃,灌胃间隔时间为6小时。染毒后,观察动物的替班状态、体重变化、中毒体征和死亡情况等,观察期为一周。实验末再次对动物称重。对死亡动物及到期处死动物进行尸体解剖,肉眼观察大体病理改变情况。实验全过程及观察内容均做详细记录,按最大耐受剂量法实验结果求得小鼠急性经口MTD。
预期结果:试验期间各组动物活动正常,毛色光泽度好,未见任何中毒体征及死亡;到期处死动物,大体解剖肉眼观察各脏器情况,未见异常。雌性和雌性小鼠:MTD>10000mg/Kg
结论:样品对雌雄小鼠急性经口毒性试验的最大耐受剂量MTD均大于10000mg/Kg。属无毒级。
实施例8:细脚拟青霉人工培养物对抗四氯化碳诱导的急性肝损伤试验
称取细脚拟青霉人工培养物样品10g(实施例3获得的子实体粉末),加蒸馏水至40mL,充分混匀后作为受试样品。
实验动物:成年大鼠,单一性别,每组10只。设一个剂量组(100mg/kg)和一个空白对照组和一个模型对照组。用四氯化碳(分析纯)造成肝损伤模型,造模方式可以灌胃或腹腔注射。大鼠四氯化碳灌胃浓度为2%,灌胃量5mL/kg。细脚拟青霉样品给予时间30天。
取大鼠肝脏左叶用10%福尔马林固定,从肝左叶中部做横切面取材,常规病理制片(石蜡包埋,H.E.染色)。从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化,用40倍物镜连续观察整个组织切片。分别记录每个视野中的各种病变所占视野的面积,并累计所观察视野的病变总分。数据处理:采用方差分析。受试样品任何一个剂量组与模型对照组之间,气球样变、脂肪变性、胞浆凝聚、水样变性或肝细胞坏死等肝细胞病变中,肝细胞坏死程度减轻,差异有显著性,而其它病变类型与模型对照组比较明显减轻或无明显差异,可判断动物实验病理结果阳性。
结果显示:四氯化碳引起肝细胞气球样变性,液化性坏死;细脚拟青霉加四氯化碳变性仅伤及肝小叶的Ⅲ区且坏死轻微。表明细脚拟青霉能显著减轻四氯化碳诱导的肝损伤。