CN101003579A - 一种细脚拟青霉多糖分离纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种细脚拟青霉多糖的分离纯化方法。由下述步骤组成：水提醇沉淀法提取细脚拟青霉多糖成分，阴离子交换层析和凝胶过滤层析反复色谱纯化，真空冷冻干燥细脚拟青霉多糖的提取物，即得细脚拟青霉多糖。利用本发明制备的细脚拟青霉多糖能够最大限度分离纯化细脚拟青霉多糖，既不影响多糖天然的结构又能保持其原有生物活性，且本发明的方法设备及环境要求低，方法简便，成本低，灵活实用，利于推广、开发和应用。

Description

一种细脚拟青霉多糖分离纯化的方法
技术领域
本发明涉及一种从细脚拟青霉菌丝体中分离纯化细脚拟青霉多糖的方法。
背景技术
细脚拟青霉[Paecilomyces tenuipes(Peck)Samson]是一种昆虫病原真菌，通常寄生在蚕的蛹体中，在世界许多国家都已分离到。根据其形态学特征和分子系统发育学分析，细脚拟青霉与冬虫夏草的无性型中国拟青霉(Paecilomyces sinensis sp.nov)同属于拟青霉属真菌。细脚拟青霉的主要化学成分与天然冬虫夏草相似，并具有与天然冬虫夏草相似的药理作用。多糖作为冬虫夏草的有效成分之一，具有具有免疫调节、护肝、抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、降血糖等活性。但天然冬虫夏草生长条件苛刻，产量十分有限，人工培养困难。鉴于细脚拟青霉与冬虫夏草具有种属的同源性和相似的免疫药理活性，而且近来发现细脚拟青霉的多糖成分(包括胞外多糖)具有免疫调节和促进细胞因子的释放作用。因此细脚拟青霉被认为是一种具有应用前景的替代冬虫夏草的药用资源菌。
目前，文献报道：细脚拟青霉多糖的分离纯化方法采用Sephadex G-100反复纯化，获得均一分子量多糖，但根据结构分析其没有生物活性(陆榕，孙立崧，王仲孚，等.细脚拟青霉多糖I的化学结构，中草药，2001，32(10)：865-867.)。对胞外多糖的纯化则采用阴、阳离子交换层析相结合的方法分离出的多糖具有明确的生物活性(Fumihide Takano，Nobuo Yahagi，Remiko Yahagi，et al.The liquid culture filtrates of Paecilomyces tenuipes(Peck)Samson(＝Isariajaponica Yasuda)and Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson(＝Isaria sinclairii(Berk.)Llond)regulate Th1 and Th2 cytokine response in murine Peyer′s patch cells in vitro and ex vivo[J].IntImmunopharmacol，2005，5(5)：903-916.)，但多糖成分的含量和纯度不高。因此，现有的方法都不利于细脚拟青霉多糖进一步的研究和开发利用。
发明内容
本方法的目的是提供一种细脚拟青霉多糖的分离纯化的方法。
本发明提供细脚拟青霉多糖的分离纯化方法，不影响多糖天然的结构，保留了其生物活性，并能作为(如针剂等)药用原料。
本方法的具体步骤是将细脚拟青霉菌丝体通过脱脂，室温水提取有生物活性的粗多糖、去蛋白、除盐、柱层析纯化和冷冻干燥。本发明具体工艺步骤如下：
1、脱脂：取细脚拟青霉菌丝体粉末到1000ml烧杯中，加入甲醇，搅拌至完全浸没，室温下脱脂24h。黄褐色上清回收，沉渣再加入甲醇，重复脱脂一次。
2、水提：步骤1所得的脱脂后细脚拟青霉菌丝体粉末按1∶6(W/V)的料液比加入蒸馏水，室温下浸提20～25小时；以3000～5000rpm离心15～30min，上清45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原生药体积的1.5倍，再逐渐加入预冷的4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜。收集沉淀，即得细脚拟青霉粗多糖。
3、去蛋白：步骤2所得的细脚拟青霉多糖水提物溶液溶解于双蒸水，将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，随之加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合物经剧烈振摇搅拌后，以5000rpm，30min离心，除去蛋白。如此重复除蛋白7-10次。
4、透析：步骤3所得的粗品浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用截流分子量为3500的透析袋对蒸馏水透析，在流水中透析48h，再在去离子水中透析24小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集细脚拟青霉多糖的提取液。
5、纯化：将经步骤4透析后的液体浓缩，经DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析。
a)阴离子交换色谱柱(DEAE纤维素-52)：蒸馏水平衡DEAE纤维素-52(3.5×40cm)，上样量30ml，以0～0.5mol/L的NaHCO3线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。分离出3个组分，收集后适当浓缩、再透析和冷冻干燥。
b)凝胶过滤层析初次纯化(Sephadex G-100)：将第1、2组分分别上凝胶柱(3.5×100cm)纯化，以0.1 mol/L NaCl洗脱，流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。第1组分经Sephadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰，第2峰为所需；第2组分经Sephadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰，第1峰为所需。收集所需峰，浓缩后4℃保存。
c)凝胶柱再次纯化(Sephadex G-75和Sephadex G-100)：第1组分第2峰选择SephadexG-75凝胶柱(1.6×100cm)再次纯化，第2组分第1峰选择Sephadex G-100凝胶柱(1.6×100cm)再次纯化，均以0.1mol/LNaCl洗脱，流速为0.3ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。此两个峰纯化后，都经高效液相检测为单一峰。
6、冷冻干燥：将纯化后的两个峰收集后，对蒸馏水透析2d，45℃条件下旋转蒸发器减压蒸发至适当体积，5000rpm，30min离心，上清经0.22μm滤膜过滤后冷冻干燥，得两个白色粉末的细脚拟青霉多糖纯品，经高效液相检测纯度为100％，苯酚-硫酸法检测中性糖含量达95％以上。
本发明建立多糖的分离纯化工艺，获取均一分子量的多糖，主要成分为甘露糖和半乳糖，具有免疫调节和抗肿瘤活性。对进一步研究其化学结构和阐明其免疫药理活性机制有重要意义。
附图说明：
图1：多糖经DEAE-纤维素52柱层析分离出3个组分
图2：第1组分的初次凝胶过滤层析图谱
图3：第2组分的初次凝胶过滤层析图谱
图4：第1组分的第2峰经再次凝胶纯化后的HPLC图谱
图5：第2组分的第1峰经再次凝胶纯化后的HPLC图谱
具体实施方式
实施例1：
1、脱脂：取300g细脚拟青霉菌丝体粉末到1000ml烧杯中，加入甲醇，搅拌至完全浸没，室温下脱脂24h。弃上清后沉渣再加入甲醇，重复脱脂一次。
2、步骤1所得的脱脂后细脚拟青霉菌丝体粉末按1∶6(W/V)的料液比加入蒸馏水，室温下浸提20～25小时；以3000～5000rpm离心15～30min，上清45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原生药体积的1.5倍，再逐渐加入预冷的4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜。收集沉淀，即得细脚拟青霉粗多糖。
3、去蛋白：步骤2所得的细脚拟青霉多糖水提物溶液溶解于双蒸水，将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，随之加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合物经剧烈振摇搅拌后，以5000rpm，30min离心，除去蛋白。如此重复除蛋白7-10次。
4、透析：步骤3所得的粗品浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用截流分子量为3500的透析袋对蒸馏水透析，在流水中透析48h，再在去离子水中透析24小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集细脚拟青霉多糖的提取液。
5、纯化：将经步骤4透析后的液体浓缩，经DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析。
a)阴离子交换色谱柱(DEAE纤维素-52)：蒸馏水平衡DEAE纤维素-52(3.5×40cm)，上样量30ml，以0～0.5mol/L的NaHCO3线性梯度洗脱，  流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。分离出3个组分(见图1)，收集后适当浓缩、再透析和冷冻干燥。
b)凝胶过滤层析初次纯化(Sephadex G-100)：将第1、2组分分别上凝胶柱(3.5×100cm)纯化，以0.1mol/L NaCl洗脱，流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。第1组分经Sephadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰(见图2)，第2峰为所需；第2组分经Sephadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰(见图3)，第1峰为所需。收集所需峰，浓缩后4℃保存。
c)凝胶柱再次纯化(Sephadex G-75和Sephadex G-100)：第1组分第2峰选择SephadexG-75凝胶柱(1.6×100cm)再次纯化，第2组分第1峰选择Sephadex G-100凝胶柱(1.6×100cm)再次纯化，均以0.1mol/LNaCl洗脱，流速为0.3ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖峰，绘制洗脱曲线。此两个峰纯化后，都经高效液相检测为单一峰(见图4，图5)。
6.冷冻干燥：将纯化后的两个峰收集后，对蒸馏水透析2d，45℃条件下旋转蒸发器减压蒸发至适当体积，5000rpm，30min离心，上清经0.22μm滤膜过滤后冷冻干燥，得两个白色粉末的细脚拟青霉多糖纯品，经高效液相检测纯度为100％，苯酚-硫酸法检测中性糖含量达95％以上。

Claims (7)

1.一种细脚拟青霉多糖的分离纯化方法，由下列步骤实现：
(1)脱脂：将细脚拟青霉菌丝体粉碎，用有机溶剂以常规方式脱脂；
(2)水提：步骤(1)所得的脱脂后细脚拟青霉菌丝体粉末按1∶6(W/V)的料液比加入蒸馏水，室温下浸提20～25小时；以3000～5000rpm离心15～30min，取上清液，得细脚拟青霉多糖水提物溶液；
(3)去蛋白：步骤(2)所得的细脚拟青霉多糖水提物溶液用有机溶剂以常规方式去除其蛋白；
(4)透析：步骤(3)所得的粗品浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48h，再在去离子水中透析24小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集细脚拟青霉多糖的提取液；
(5)纯化：将经步骤(4)透析后的液体浓缩，经DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析，收集液用苯酚硫-酸法检测，合并多糖峰的收集液，真空冷冻干燥，得纯细脚拟青霉多糖。
2.如权利要求1说述的细脚拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(1)所述有机溶剂是甲醇。
3.如权利要求1说述的细脚拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(2)所述浸提时间是24小时。
4.如权利要求1说述的细脚拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(2)所述离心速度是5000rpm，离心时间是15min。
5.如权利要求1说述的细脚拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(3)所述有机溶剂是氯仿和正丁醇。
6.如权利要求1说述的细脚拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(5)所述DEAE纤维素-52层析柱(3.5×40cm)，上样量30ml，洗脱液是0～0.5mol/L的NaHCO3。
7.如权利要求1说述的细脚拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(5)所述葡聚糖凝胶(SephadexG-100和SephadexG-75)层析柱为3.5×100cm和1.6×100cm两种规格。
上样量分别为30ml和4ml，洗脱液均是0.1 mol/L的NaCl。
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