CN104330505A - 一种小牛血清去蛋白注射液中残留溶剂的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小牛血清去蛋白注射液中残留溶剂的测定方法，包括如下步骤：将对照品溶液和供试品溶液采用顶空进样的方式注入色谱仪中，采用相应的色谱条件进行色谱测试，并记录色谱图；依据色谱图进行定性和定量检测。本方法所测样品无需特殊处理，可以避免色谱柱的污染以及样品基质的干扰。而且，该方法灵敏度高，操作简单，适合用于检测小牛血清去蛋白注射液中有机溶剂残留甲醇和乙醇，为控制小牛血清去蛋白注射液生产工艺中有机溶剂的残留提供了参考，保证了质量。

Description

一种小牛血清去蛋白注射液中残留溶剂的测定方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种小牛血清去蛋白注射液中残留有机溶剂的测定方法。

背景技术

药品中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及在制剂制备过程中未能完全除去的有机溶剂。在《中华人民共和国药典》2010年版、二部附录Ⅷ P对其有机溶剂限度有一定的要求，但目前国家只公布了化学药品残留溶剂指导原则，对生化药物测定方法和限度要求尚未出台指导原则。所以，建立生化药物溶剂残留检测方法用于控制生化药品质量，其意义十分重要。

小牛血清去蛋白注射液在制备工艺中采用了乙醇沉淀除蛋白的工艺，而且乙醇使用量巨大，为小牛血清量体积的4倍。小牛血清成分复杂，包括大分子蛋白、核酸、小分子多肽、核苷酸、无机盐等成分，也包括一些脂溶性的成分。小牛血清去蛋白注射液生产过程中，小牛血清和乙醇需经过充分混匀后再静置沉降，全过程超过12小时，通过离心过滤固液分离后，将滤液减压蒸馏回收乙醇。为防止乙醇回收不充分以及在生产过程中发生乳化或者形成结晶醇而致少量醇通过常规方法无法回收而有过量残留，有必要对乙醇进行残留量检测。虽然药品只涉及乙醇的使用，但考虑乙醇中的杂质甲醇在提取过程有可能被带入并残留，且甲醇也可以形成结晶醇，故在内控指标中增设了甲醇的检测项目。

目前检测有机溶剂最常用的检测手段就是气相色谱。由于小牛血清去蛋白注射液含有金属离子和无机盐等非挥发性杂质，产品直接进入气相色谱柱会对柱子造成污染，使色谱柱分离效果下降，使用寿命缩短。而且该产品成分复杂，可能含有一些类似于脂类的挥发性化合物，在气相色谱仪进样口可能会分解，如果这些挥发性化合物中的部分物质被检测器检测到，可能会对乙醇和甲醇溶剂的分析造成干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小牛血清去蛋白注射液中残留溶剂的测定方法。该方法采用顶空气相色谱法对小牛血清去蛋白注射液中可能残留的甲醇和乙醇有机溶剂进行检测。

本发明所提供小牛血清去蛋白注射液中残留溶剂的测定方法包括如下步骤：

1)以小牛血清去蛋白注射液为供试品溶液；称取适量甲醇和乙醇，加水稀释成一定浓度的对照品溶液；

2)将步骤1)中供试品溶液和一系列梯度浓度的对照品溶液分别采用顶空进样的方式注入色谱仪中，并按如下色谱条件进行测试，记录色谱图并进行分析：

色谱柱：HP-INNOWAX毛细管柱；

柱温：50℃～55℃；

检测器：氢火焰离子化检测器；

检测器温度：225℃～275℃；

载气：氮气、氢气或氦气；

载气流速：0.8ml·min^-1～1.2ml·min^-1；

进样口温度：180℃～220℃；

进样方式：分流进样；分流进样的分流比：(5:1)～(10:1)；

顶空进样中顶空瓶平衡温度为80℃～85℃；平衡时间为30min～45min。

上述测定方法中，步骤1)中，所述对照品溶液中甲醇的质量浓度为0.006mg·ml^-1～0.90mg·ml^-1，具体为0.03mg/ml。

所述对照品溶液中乙醇的质量浓度为0.01mg·ml^-1～1.50mg·ml^-1，具体为0.05mg/ml。

所述小牛血清去蛋白注射液为购自锦州奥鸿药业有限责任公司生产的小牛血清去蛋白注射液成品，规格为10ml(0.4g)/支，批号为20140502。

上述测定方法中，步骤2)中，所述顶空进样的进样量为1ml；所述顶空进样中顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30min；所述顶空进样中进样环温度为105℃；所述顶空进样中传输管温度为115℃。

所述HP-INNOWAX毛细管柱的规格为30.0m×0.53mm，填料直径为1.0μm。

所述柱温可通过程序升温来控制：50℃下保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min。

所述检测器温度为250℃。

所述载气为氮气。

所述载气流速为1.0ml·min^-1。

所述进样口温度为200℃。

所述分流进样的分流比为5:1。

上述测定方法中，依据步骤2)所述对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高)，按下式计算小牛血清去蛋白注射液中残留溶剂的浓度：

$C_S=\frac{A_S\text{\·}{C}_R}{A_R}$

A_S-供试品溶液中待测溶剂的峰面积；A_R-对照品溶液中待测溶剂的峰面积；

C_S-供试品溶液中待测溶剂的浓度，mg/ml；C_R-对照品溶液中待测溶剂的浓度，mg/ml。

只有当小牛血清去蛋白注射液中甲醇的浓度在0.006mg·ml^-1～0.90mg·ml^-1时，才能用上述公式准确测量小牛血清去蛋白注射液中甲醇的浓度；只有当小牛血清去蛋白注射液中乙醇的浓度在0.01mg·ml^-1～1.50mg·ml^-1时，才能用上述公式准确测量小牛血清去蛋白注射液中乙醇的浓度。

与经典气相色谱法相比较，本发明所采用顶空进样色谱法具有如下优点：样品无需特殊处理，可以避免色谱柱的污染以及样品基质的干扰；而且，该方法灵敏度高，操作简单可行，无干扰。经过大量的实验验证，本发明提供的方法在专属性、回收率、灵敏度和检出限等各项技术指标都能满足检测要求。是一种比较理想的用于产品质量控制的检测方法，特别适合作为小牛血清去蛋白注射液溶剂残留的检测方法。

附图说明

图1为对照品溶液色谱图；

图2为供试品溶液色谱图；

图3为空白对照溶液色谱图；

图4为对照品溶液色谱图；

图5为供试品溶液色谱图；

图6为空白对照溶液色谱图；

图7为对照品溶液色谱图；

图8为供试品溶液1色谱图；

图9为供试品溶液2色谱图。

具体实施方式

下面结合附图通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例所用仪器和试剂如下：Agilent 7890A气相色谱仪(包括FID氢火焰检测器，7694E顶空进样器，美国安捷伦公司)；甲醇和乙醇均为色谱纯；水为注射用水；

对照品溶液：精密称取适量甲醇和乙醇，加水稀释成对照品混合溶液(即对照品贮备溶液)，使对照品贮备溶液中甲醇和乙醇的浓度分别为3mg/ml和5mg/ml；精密量取对照品贮备溶液1mL，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液；

供试品溶液：取小牛血清去蛋白注射液(购自锦州奥鸿药业有限责任公司生产的小牛血清去蛋白注射液成品，规格为10ml(0.4g)/支，批号为20140502)2ml，置20mL顶空进样瓶中，密封瓶口，即得；

空白溶液：水(注射用水)。

实施例1、不同极性色谱柱对甲醇和乙醇峰形的影响

条件1：极性色谱柱HP-INNOWAX(30.0m×0.53mm×1.0μm)；初始柱温50℃，保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min；进样口温度200℃；检测器(FID)温度250℃；分流进样，分流比为1:1；载气为氮气；流速1.0ml·min^-1；顶空进样，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30min，传输管温度为115℃，进样环温度为105℃。

条件2：中等极性色谱柱DB-624(60.0m×0.32mm×1.80μm)；柱温50℃，保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min；进样口温度200℃；检测器(FID)温度250℃；分流进样，分流比为1:1；载气为氮气；流速1.0ml·min^-1；顶空进样，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30min，传输管温度为115℃，进样环温度为105℃。

按照上述色谱条件1和2分别检测对照品溶液、供试品溶液和空白溶液。按色谱条件1检测后得到图1、图2和图3三个色谱图；按色谱条件2检测后得到图4、图5和图6三个色谱图；

从上述色谱图分析得知，采用DB-624与HP-INNOWAX极性不同的毛细管柱对对照品溶液、供试品溶液和空白溶液进行分析，空白溶液对甲醇和乙醇的检测均无干扰，甲醇及乙醇色谱峰均可以达到基线分离，方法专属性良好。比较测定结果，采用DB-624分析时，对照品溶液中甲醇峰和乙醇峰的拖尾因子分别为1.62和1.54，甲醇和乙醇峰拖尾较严重。而改用HP-INNOWAX分析，对照品溶液中甲醇和乙醇峰的拖尾因子分别为1.30和1.25，采用HP-INNOWAX毛细管柱分析峰型更好。

实施例2、不同分流比对甲醇和乙醇峰型的影响

固定除分流比以外的所有色谱条件：HP-INNOWAX毛细管柱(30.0m×0.53mm×1.0μm)；柱温50℃，保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min；进样口温度200℃；检测器(FID)温度250℃；顶空进样，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30min，传输管温度为115℃，进样环温度为105℃；分流进样，分流比为1:1、3:1、5:1或10:1；载气为氮气，流速1.0ml·min^-1。

固定其他条件，采用分流比为1:1、3:1、5:1或10:1对对照品溶液进行分析，拖尾因子如表1所示：

表1 分流比与拖尾因子

分流比	1:1	3:1	5:1	10:1
					甲醇拖尾因子	1.29	1.25	1.16	1.14
乙醇拖尾因子	1.27	1.20	1.09	1.08

由表1可以看出，随着分流比的提高，峰型有明显的改善，在5:1分流比条件下，色谱峰峰型已经很好，与10：1相比，拖尾因子几乎无差别。因为分流比增加会降低分析灵敏度。所以确定5:1为最佳分流比。

实施例3、顶空平衡温度对甲醇和乙醇峰面积的影响

固定除顶空平衡温度以外的所有色谱条件：HP-INNOWAX毛细管柱(30.0m×0.53mm×1.0μm)；柱温50℃，保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min；进样口温度200℃；检测器(FID)温度250℃；分流进样，分流比为5:1；载气为氮气；流速1.0ml·min^-1。顶空进样，平衡时间为30min，传输管温度为115℃，进样环温度为105℃。对顶空瓶内水平衡温度为65℃、70℃、75℃、80℃、85℃时的色谱峰面积进行了考察，结果见表2。

表2 平衡温度与峰面积

平衡温度(℃)	65	70	75	80	85
						甲醇峰面积	150	377	454	627	643
乙醇峰面积	448	950	1236	1598	1630

从表2可以看到随着平衡温度升高，色谱响应值增大，在80℃时，峰面积响应已经达到最大且稳定，与75℃时相比灵敏度有明显提高，但由于温度过高容易导致水蒸气膨胀致使压力升高，引起顶空瓶的耐压和仪器气密性等问题，影响测定，故本实验选择80℃作为平衡温度。

实施例4、顶空平衡时间对甲醇和乙醇峰面积的影响

测试色谱条件如下：HP-INNOWAX毛细管柱(30.0m×0.53mm×1.0μm)；柱温50℃，保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min；进样口温度200℃；检测器(FID)温度250℃；分流进样，分流比为5:1；载气为氮气；流速1.0ml·min^-1。顶空进样，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为5min、10min、20min、30min或45min，传输管温度为115℃，进样环温度为105℃。

通过设置一系列平衡时间5min、10min、20min、30min和45min，来考察对照品溶液中甲醇和乙醇在不同平衡时间下的色谱峰面积，结果见表3。

表3 平衡时间与峰面积的测试数据

平衡时间(min)	5	10	20	30	45
						甲醇峰面积	259	484	571	646	659
乙醇峰面积	743	1138	1436	1622	1657

上表数据显示平衡时间30分钟和平衡时间45分钟检测的峰面积没有显著差异，因此选择30分钟为最佳平衡时间。

实施例5、方法学验证

1色谱条件：色谱柱：HP-INNOWAX毛细管柱(30.0m×0.53mm×1.0μm)；柱温50℃，保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min；进样口温度200℃；检测器(FID)温度250℃。分流进样，分流比为1:1；载气为氮气；流速1.0ml·min^-1；顶空进样，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30min，传输管温度为115℃，进样环温度为105℃。

2溶液的制备：

2.1对照品溶液：精密称取适量甲醇和乙醇，加水稀释成对照品混合溶液(即对照品贮备溶液)，使对照品贮备溶液中甲醇和乙醇的浓度分别为3mg/ml和5mg/ml；量取对照品贮备溶液1mL，加水稀释至100ml，作为对照品溶液；

2.2供试品溶液1：取小牛血清去蛋白注射液(锦州奥鸿药业有限责任公司生产的小牛血清去蛋白注射液成品，规格为10ml(0.4g)/支，批号为20140502)2ml，置20mL顶空进样瓶中，密封瓶口，即得。

2.3空白溶液：水(注射用水)。

3系统适用性试验和专属性：取“2”项所制备的对照品溶液、供试品溶液和空白溶液，按“1”项所述色谱条件进行分析，记录色谱图；结果表明：甲醇和乙醇均达基线分离，分离度大于1.5，按乙醇峰计算，理论塔板数(N)不低于8000；空白溶液在目标物出峰处无干扰，不影响目标物分析。

4检测限：分别精密量取适量甲醇和乙醇，用水溶解并制成适当浓度的对照品溶液，并用水逐级稀释，取信噪比约为3：1时浓度的溶液，按“1”项所述色谱条件测定。结果表明：甲醇检测限为0.39μg·ml^-1，乙醇检测限为0.31μg·ml^-1。

5线性关系考察：精密量取适量的“2.1”中的对照品贮备溶液，用水溶解并稀释制成梯度浓度的混合溶液,按“1”项所述色谱条件测定峰面积，以浓度为横坐标,峰面积的平均值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，结果见表4。

表4 有机溶剂线性关系考察结果

有机溶剂	回归方程	相关系数	线性范围(mg·ml-1)
				甲醇	y＝1046.3x–1.442	0.9998	0.006～0.90
乙醇	y＝1572.4x–2.7231	0.9997	0.01～1.50

6回收率与精密度试验：按“2.2”项下方法制备供试品溶液(样品溶液)6份。并取“2.2”项下同批号小牛血清去蛋白注射液6份，每份1ml，置20mL顶空进样瓶中，分别精密加入(甲醇和乙醇质量浓度分别为0.0325mg/ml和0.0554mg/ml)的混合标准溶液1mL，密封瓶口，即得样品加标回收溶液。按“1”项所述色谱条件检测供试品溶液和样品加标回收溶液，计算加标回收率，并考察方法的精密度，结果见表5。由表5可知，平均回收率分别为98.81％与100.93％，相对标准偏差(RSD，n＝6)为2.22％与2.48％，具有较理想的重复性和准确度。

表5 回收率与精密度试验结果(n＝6)

实施例6供试品溶液检测：

1、色谱条件：HP-INNOWAX毛细管柱(30.0m×0.53mm×1.0μm)；柱温50℃，保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min；进样口温度200℃；检测器(FID)温度250℃。分流进样，分流比为5:1；载气为氮气；流速1.0ml·min^-1。顶空进样，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30min，传输管温度为115℃，进样环温度为105℃。

2、供试品溶液1：锦州奥鸿药业有限责任公司生产的小牛血清去蛋白注射液成品，规格为10ml(0.4g)/支，批号为20140502。

供试品溶液2：批号为20140502的小牛血清去蛋白注射液对应的生产过程中的未到浓缩终点的浓缩液样品10ml。小牛血清去蛋白注射液生产过程中，血清中加入4倍体积的95％药用乙醇除蛋白，过滤后得到的滤液在55℃、0.02MP条件下减压蒸馏回收乙醇，总体积浓缩到血清体积的60％为浓缩终点，回收乙醇工艺步骤结束。供试品溶液2是在混合液体积浓缩到血清体积70％时抽取的样品。

3、检测方法：按“1”中所述色谱条件检测对照品溶液和供试品溶液1、供试品溶液2，记录对照品溶液图谱(图7)和供试品溶液图谱(供试品溶液1为图8，供试品溶液2为图9)，从图谱可知，供试品溶液1中未检测到乙醇，供试品2中乙醇含量为0.037mg·ml^-1；供试品溶液1和2中均未检出甲醇。

Claims (7)

1.一种小牛血清去蛋白注射液中残留溶剂的测定方法，包括如下步骤：

1)以小牛血清去蛋白注射液为供试品溶液；称取适量甲醇和乙醇，加水稀释成一定浓度的对照品溶液；

2)将步骤1)中供试品溶液和一系列梯度浓度的对照品溶液分别采用顶空进样的方式注入色谱仪中，并按如下色谱条件进行测试，记录色谱图并进行分析：

色谱柱：HP-INNOWAX毛细管柱；

柱温：50℃～55℃；

检测器：氢火焰离子化检测器；

检测器温度：200℃～300℃；

载气：氮气、氢气或氦气；

载气流速：0.5ml·min^-1～1.5ml·min^-1；

进样口温度：150℃～250℃；

进样方式：分流进样；分流进样的分流比：(5:1)～(10:1)；

顶空进样中顶空瓶平衡温度为80℃～85℃；平衡时间为30min～45min。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤1)中，所述对照品溶液中甲醇的质量浓度为0.006mg·ml^-1～0.90mg·ml^-1。

所述对照品溶液中乙醇的质量浓度为0.01mg·ml^-1～1.50mg·ml^-1。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述顶空进样的进样量为1ml；

所述顶空进样中顶空瓶平衡温度为80℃；

平衡时间为30min；

所述顶空进样中进样环温度为105℃；

所述顶空进样中传输管温度为115℃。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述HP-INNOWAX毛细管柱的规格为30.0m×0.53mm，填料直径为1.0μm。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述柱温可通过程序升温来控制：50℃下保持2min，再以1℃·min^-1的速率升温至55℃，保持3min。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述检测器温度为250℃；

所述载气为氮气；

所述载气流速为1.0ml·min^-1；

所述进样口温度为200℃；

所述分流进样的分流比为5:1。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的测定方法，其特征在于：依据步骤2)中所述对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积，按下式计算小牛血清去蛋白注射液中残留溶剂的浓度：

$\mathrm{Cs}=\frac{A_S\·C_R}{A_R}$

A_S-供试品溶液中待测溶剂的峰面积；A_R-对照品溶液中待测溶剂的峰面积；

C_S-供试品溶液中待测溶剂的浓度，mg/ml；C_R-对照品溶液中待测溶剂的浓度，mg/ml。