CN104322490A

CN104322490A - 果蔬农残生物酶清洗剂

Info

Publication number: CN104322490A
Application number: CN201310657828.XA
Authority: CN
Inventors: 陈国参; 王继雯; 刘莹莹; 李冠杰; 宁萌; 杨文玲; 甄静; 岳丹丹; 幕琦; 丁芳
Original assignee: HENAN ACADEMY OF SCIENCES BIOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: HENAN ACADEMY OF SCIENCES BIOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: CN104322490B

Abstract

果蔬农残生物酶清洗剂为白色粉剂，主要成分为黑曲霉J6酶液、酶保护剂和吸附剂，经黑曲霉J6酶液的提取、基本酶液的配制和吸附固定三步完成，清洗剂可以有效快速地清除果蔬表面的有机磷农药残留，对氧化乐果、甲拌磷、辛硫磷和甲基对硫磷残留的去除率最高达到94.8%、92.1%、96.7%和98.5%。

Description

果蔬农残生物酶清洗剂

技术领域

本发明属于有机磷农药降解酶技术领域，特别涉及一种果蔬农残生物酶清洗剂。

背景技术

民以食为天，食以安为先，食品安全是关系人类身体健康和社会稳定的头等大事。在我国，水果蔬菜产品的农药残留尤其是有机磷农药残留问题令人堪忧，它直接影响到我国的民众生活和经济贸易等诸多方面，成为影响我国食品安全及农产品国际竞争力的一个重要因素，在国家质量技术监督局曾对全国23个主要城市的蔬菜产品进行的农药残留监督检查中，抽样合格率最高仅为72.4%，最低则为47.5%，2003年以来，我国出口日本、韩国等国家和地区的农副产品因有机磷农药超标而屡次被亮红牌，造成了严重的负面影响，民众在买食水果蔬菜时更是忧虑重重。目前我国每年农药施用总量达50万吨，杀虫剂占70%，杀虫剂中有机磷类占70%，其中高毒品种又占70%，有机磷农药在水果蔬菜的生长过程中较为普遍的使用造成其在水果蔬菜中的残留已是不争的事实，为解决成品水果蔬菜中有机磷农药的残留问题人们想出了不少物理的、化学的方法：民间在食用水果蔬菜前对农药残留的清除方法主要是清洗、削皮、烹饪和储存保管法等，清洗常用的方法有清水浸泡洗涤法、碱水浸泡清洗法、清洗去皮法等，是多年来人们依据民间常见的小窍门儿归纳的“一放、二削、三洗、四烫、五炒”水果蔬菜安全食用方法，这些方法不足的地方是去皮对一些叶菜、花菜类蔬菜和不易削皮的水果如草莓、樱桃等不适用，加热烹饪法可以消除些农药残留，但不适合生食的水果蔬菜，储存保管法因其保存条件和保鲜要求的差异有一定的局限性；使用活氧机（又名臭氧机）降解农药残留是近年来见到的一种机械化学方法，原理是利用臭氧在水中极强的氧化分解能力起到降解农药残留的作用，但其存在的臭氧污染问题不容忽视，利用化学原理的还有使用硅油、丙二醇等化学清洗剂处理水果蔬菜农药残留，也因其去除率较低而不宜推广。利用生物方法降解水果蔬菜农药残留污染物是近期研究者关注的一个新的方向，生物方法安全、有效，与物理化学方法相比具有无毒、无残留、无二次污染等优点，现有的报道有用天然蛋白酶制剂的，但是农残去除率不理想，而且与硅油、丙二醇等一样，未形成用于去除水果蔬菜降解农药残留的产品。能安全、有效的去除水果蔬菜的农药残留，并且使用方便，是人们对去除水果蔬菜农药残留用品的迫切期待，但到目前为止，还未见有此类生物产品研制的报道。

发明内容

本发明的目的是利用黑曲霉J6酶液良好的降解有机磷农药的功能，配制一种果蔬农残生物酶清洗剂。

本发明的果蔬农残生物酶清洗剂（简称清洗剂）为白色粉剂，主要成分为黑曲霉J6酶液、酶保护剂和吸附剂，经黑曲霉J6酶液的提取—基本酶液的配制—吸附固定三步配制而成，酶保护剂的成分为甘氨酸、山梨酸钾和甘油，吸附剂的组分为碳酸钙和白炭黑，清洗剂配制的第一步是黑曲霉J6酶液的提取：将斜面菌种黑曲霉J6经PDA培养基培养至孢子成熟，所用PDA培养基为去皮马铃薯200g+蔗糖20g+琼脂15～20g，定容至1000ml，pH自然，用灭菌的种子培养基冲取成熟孢子，配制成密度为2～4×10⁸个/ml的孢子悬液接种于种子培养基中，种子培养基的组分为NaCl1.0g+KH₂PO₄0.5g+K₂HPO₄1.5g+(NH₄)₂SO₄1.0g+MgSO₄7H₂O0.1g+葡萄糖2.0g，定容至1000ml，pH7.0，待孢子萌发后，接种于盛有液体发酵培养基的锥形瓶中，液体发酵培养基的组分为NaCl 0.1%+KH₂PO₄0.05%+K₂HPO₄0.15%+MgSO₄7H₂O0.01%+葡萄糖0.2%+酵母粉0.1%，pH7.0，30℃摇床培养3～5d，收集所产菌丝体研磨，研磨后于4℃条件下放置12～24 h，离心机离心20 min，取上清液得黑曲霉J6酶液；第二步是基本酶液的配制：将黑曲霉J6酶液与酶保护剂按比例加入搅拌器中，搅拌5分钟，使其混合均匀得基本酶液，所用酶保护剂为甘氨酸、山梨酸钾和甘油，成分含量按体积百分比计：黑曲霉J6酶液93.5～98.8%、甘氨酸0.1～0.5%、山梨酸钾0.1～1%、甘油1～5%；第三步是吸附固定：将吸附剂与基本酶液按1:1～2的质量与体积比（g/ml）混合搅拌拌匀，经吸附固定即成成品清洗剂，成品为白色粉剂，吸附剂的组分碳酸钙和白炭黑均为粉状，二者质量比为1:2～3。

本发明所用菌株J6，分类名称：黑曲霉Aspergillus niger,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC NO.4220，保藏日期为2010年10月12日；果蔬农残生物酶清洗剂经清洗效果实验，对果蔬有机磷农药残留的去除率最高达到98%以上。

本发明由以下技术方案实现：

1、黑曲霉J6酶液的提取

将斜面菌种黑曲霉J6接种于PDA培养基培养， PDA培养基为去皮马铃薯200g+蔗糖20g+琼脂15～20g，定容至1000ml，pH自然，待孢子成熟后，用灭菌的种子培养基冲取成熟孢子，配制成密度为2～4×10⁸个/ml的孢子悬液，接于种子培养基中，种子培养基的组分为NaCl1.0g+KH₂PO₄0.5g+K₂HPO₄1.5g+(NH₄)₂SO₄1.0g+MgSO₄7H₂O0.1g+葡萄糖2.0g，定容至1000 ml，pH7.0，待孢子萌发后，按2%接种于盛有液体发酵培养基的锥形瓶中，液体发酵培养基的组分为NaCl0.1%+KH₂PO₄0.05%+K₂HPO₄0.15%+MgSO₄7H₂O0.01%+葡萄糖0.2%+酵母粉0.1%，pH7.0，30℃、160 r/min摇床培养3～5d，用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用蒸馏水洗涤2次，冰浴冷却，然后加入Tris-HCL 缓冲液，缓冲液浓度0.05mol/L，pH7.0，置于研钵中加入适量的石英砂充分研磨，研磨后于4℃条件下放置12～24 h，离心机12000 r/min离心20min，取上清液得黑曲霉J6酶液。

2、基本酶液的配制

将黑曲霉J6酶液与酶保护剂按比例加入搅拌器中混合搅拌均匀得基本酶液，所用酶保护剂为甘氨酸、山梨酸钾和甘油，成分含量按体积百分比计：黑曲霉J6酶液93.5～98.8%、甘氨酸0.1～0.5%、山梨酸钾0.1～1%、甘油1～5%，酶保护剂可有效地保护清洗剂免受外界环境温度、pH值、水分和储运条件对酶活的影响。

3、吸附固定

吸附剂的组分碳酸钙和白炭黑均为粉状，将其混合搅拌均匀备用，二者质量比为1:2～3；

将吸附剂与基本酶液按1:1～2的质量与体积比（g/ml）混合搅拌拌匀，吸附固定20～25分钟，即成成品果蔬农残生物酶清洗剂。

清洗剂使用方法：取适量果蔬农残生物酶清洗剂加入容器中，再加入可没过果蔬的水搅拌均匀，将要清洗的果蔬放入，浸泡5～10分钟捞出，用清水冲洗干净即可食用或烹调。

清洗效果实验

取苹果、梨、白菜和黄瓜四种果蔬，分别喷洒不同的有机磷农药，各设3个重复，所用氧化乐果浓度为4000mg/L，甲拌磷浓度为200mg/L、辛硫磷浓度为500mg/L、甲基对硫磷浓度为200mg/L，喷洒后于室温下放置24h，晾干水分，分别取样，检测四种果蔬不同的有机磷农药含量，再将四种果蔬按上述清洗剂使用方法进行洗涤，检测洗涤后有机磷农药的残留量，计算其有机磷农药去除率（%），结果见表1。

表1. 清洗剂对果蔬有机磷农药残留的去除率（%）

结果显示，清洗剂对四种果蔬有机磷农药残留的去除率最低为88.5%，最高达到98.5%，去除效果非常好，无二次污染产生。

本发明的果蔬农残生物酶清洗剂属于微生物酶制剂，其主要功能和优点如下：

1、清洗剂的主要成分黑曲霉J6酶液是一种高效有机磷农药降解酶，可以有效快速地清除果蔬表面的有机磷农药残留，污染果蔬清洗实验结果显示对氧化乐果、甲拌磷、辛硫磷和甲基对硫磷残留的去除率最高达到94.8%、92.1%、96.7%和98.5%。

2、所用酶保护剂可以有效地保护清洗剂免受外界环境温度、PH、水分和储存过程对酶活产生的影响，该清洗剂在常温下能保存6个月以上，4℃下可保存24个月，酶活力基本保持不变，山梨酸钾也可用苯甲酸钠或双乙酸钠代替。

3、所用吸附剂白炭黑和碳酸钙均为食品添加剂，使用安全。

4、除了清洗效果实验中的苹果、梨、白菜和黄瓜四种果蔬外，本清洗剂亦可用于其他果蔬有机磷农药残留的清洗。

5、本发明的清洗剂制作方法简单，不需要复杂贵重的机械设备，生产过程节能环保，成品为粉状制剂，易于保藏和运输，使用方法简单，操作方便，对人体无毒害作用，无二次污染产生，是一种安全环保的微生物酶制剂。

具体实施方式

实施例1

1、黑曲霉J6酶液的提取

将斜面菌种黑曲霉J6接种于PDA培养基培养， PDA培养基为去皮马铃薯200g+蔗糖20g+琼脂20g，定容至1000ml，pH自然，待孢子成熟后，用灭菌的种子培养基冲取成熟孢子，配制成密度为3×10⁸个/ml的孢子悬液，接于种子培养基中，种子培养基的组分为NaCl1.0g+KH₂PO₄0.5 g+K₂HPO₄ 1.5 g+(NH₄)₂SO₄1.0g+MgSO₄7H₂O0.1g+葡萄糖2.0g，定容至1000ml，pH7.0，待孢子萌发后，按2%接种于盛有液体发酵培养基的锥形瓶中，液体发酵培养基的组分为NaCl0.1%+KH₂PO₄ 0.05%+K₂HPO₄0.15%+MgSO₄7H₂O 0.01%+葡萄糖0.2%+酵母粉0.1%，pH7.0，30℃、160 r/min摇床培养5d，用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用蒸馏水洗涤2次，冰浴冷却，然后加入Tris-HCL 缓冲液，缓冲液浓度0.05 mol/L，pH7.0，置于研钵中加入适量的石英砂充分研磨，研磨后于4℃条件下放置24h，离心机12000 r/min离心20min，取上清液得黑曲霉J6酶液。

2、基本酶液的配制

将黑曲霉J6酶液与酶保护剂按比例加入搅拌器中搅拌混合均匀得基本酶液，所用酶保护剂为甘氨酸、山梨酸钾和甘油，成分含量按体积百分比计：黑曲霉J6酶液98.8%、甘氨酸0.1%、山梨酸钾0.1%、甘油1%，加入搅拌器搅拌5分钟，使其混合均匀得基本酶液。

3、吸附固定

将吸附剂碳酸钙和白炭黑按1:2质量比混合搅拌均匀备用；

将吸附剂与基本酶液按1:1的质量与体积比（g/ml）混合搅拌拌匀，吸附固定20分钟，即成果蔬农残生物酶清洗剂成品。

实施例2

1、黑曲霉J6酶液的提取

将斜面菌种黑曲霉J6接种于PDA培养基培养， PDA培养基为去皮马铃薯200g+蔗糖20g+琼脂15g，定容至1000 ml，pH自然，待孢子成熟后，用灭菌的种子培养基冲取孢子，配制成密度约4×10⁸个/ml的孢子悬液，接于种子培养基中，种子培养基的组分为NaCl1.0g+KH₂PO₄0.5 g+K₂HPO₄ 1.5 g+(NH₄)₂SO₄ 1.0 g+MgSO₄7H₂O 0.1 g+葡萄糖2.0 g，定容至1000 ml，pH7.0，待孢子萌发后，按2%接种于盛有液体发酵培养基的锥形瓶中，液体发酵培养基的组分为NaCl 0.1%+KH₂PO₄ 0.05%+K₂HPO₄0.15%+MgSO₄7H₂O 0.01%+葡萄糖0.2%+酵母粉0.1%，pH7.0，30℃、160 r/min摇床培养4d，用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用蒸馏水洗涤2次，冰浴冷却，然后加入Tris-HCL 缓冲液，缓冲液浓度0.05 mol/L，pH7.0，置于研钵中加入适量的石英砂充分研磨，研磨后于4℃条件下放置12h，离心机12000 r/min离心20min，取上清液得黑曲霉J6酶液。

2、基本酶液的配制

将黑曲霉J6酶液与酶保护剂按比例加入搅拌器中搅拌混合均匀得基本酶液，所用酶保护剂为甘氨酸、山梨酸钾和甘油，成分含量按体积百分比计：黑曲霉J6酶液93.5%、甘氨酸0.5%、山梨酸钾1.0%、甘油5%，加入搅拌器搅拌5分钟，使其混合均匀得基本酶液。

3、吸附固定

将吸附剂碳酸钙和白炭黑按1:3质量比混合搅拌均匀备用；

将吸附剂与基本酶液按1:2的质量与体积比（g/ml）混合搅拌拌匀，吸附固定25分钟，即成果蔬农残生物酶清洗剂成品。

实施例3

1、黑曲霉J6酶液的提取

将斜面菌种黑曲霉J6接种于PDA培养基培养， PDA培养基为去皮马铃薯200g+蔗糖20g+琼脂18g，定容至1000ml，pH自然，待孢子成熟后，用灭菌的种子培养基冲取孢子，配制成密度约2×10⁸个/ml的孢子悬液，接于种子培养基中，种子培养基的组分为NaCl1.0g+KH₂PO₄0.5 g+K₂HPO₄ 1.5 g+(NH₄)₂SO₄1.0g+MgSO₄7H₂O0.1g+葡萄糖2.0g，定容至1000ml，pH7.0，待孢子萌发后，按2%接种于盛有液体发酵培养基的锥形瓶中，液体发酵培养基的组分为NaCl0.1%+KH₂PO₄ 0.05%+K₂HPO₄0.15%+MgSO₄7H₂O 0.01%+葡萄糖0.2%+酵母粉0.1%，pH7.0，30℃、160 r/min摇床培养3d，用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用蒸馏水洗涤2次，冰浴冷却，然后加入Tris-HCL缓冲液，缓冲液浓度0.05mol/L，pH7.0，置于研钵中加入适量的石英砂充分研磨，研磨后于4℃条件下放置20h，离心机12000 r/min离心20min，取上清液得黑曲霉J6酶液。

2、基本酶液的配制

将黑曲霉J6酶液与酶保护剂按比例加入搅拌器中搅拌混合均匀得基本酶液，所用酶保护剂为甘氨酸、山梨酸钾和甘油，成分含量按体积百分比计：黑曲霉J6酶液95.0%、甘氨酸0.3%、山梨酸钾0.5%、甘油4.2%，加入搅拌器搅拌5分钟，使其混合均匀得基本酶液。

3、吸附固定

将吸附剂碳酸钙和白炭黑按1:3质量比混合搅拌均匀备用；

将吸附剂与基本酶液按1:1的质量与体积比（g/ml）混合搅拌拌匀，吸附固定22分钟，即成果蔬农残生物酶清洗剂成品。

Claims

1.果蔬农残生物酶清洗剂，其特征在于清洗剂为白色粉剂，主要成分为黑曲霉J6酶液、酶保护剂和吸附剂，经黑曲霉J6酶液的提取—基本酶液的配制—吸附固定三步配制而成，酶保护剂的组分为甘氨酸、山梨酸钾和甘油，吸附剂的组分为碳酸钙和白炭黑。

2.如权利要求1所述果蔬农残生物酶清洗剂，其特征在于所述三步的第一步是黑曲霉J6酶液的提取：将斜面菌种黑曲霉J6接种于PDA培养基培养，所用PDA培养基为去皮马铃薯200g+蔗糖20g+琼脂15～20g，定容至1000ml，pH自然，待孢子成熟后，用灭菌的种子培养基冲取成熟孢子，配制成密度为2～4×10⁸个/ml的孢子悬液，接种于种子培养基中，种子培养基的组分为NaCl1.0g+KH₂PO₄0.5g+K₂HPO₄1.5g+(NH₄)₂SO₄1.0g+MgSO₄·7H₂O0.1.0g+葡萄糖2.0g，定容至1000ml，pH7.0，待孢子萌发后，接种于盛有液体发酵培养基的锥形瓶中，液体发酵培养基的组分为NaCl0.1%+KH₂PO₄0.05%+K₂HPO₄0.15%+MgSO₄·7H₂O0.01%+葡萄糖0.2%+酵母粉0.1%，pH7.0，30℃摇床培养3～5d，收集所产菌丝体研磨，研磨后于4℃条件下放置12～24 h，离心机离心20min，取上清液得黑曲霉J6酶液。

3.如权利要求1所述果蔬农残生物酶清洗剂，其特征在于所述三步的第二步是基本酶液的配制：将黑曲霉J6酶液与酶保护剂按比例加入搅拌器中混合搅拌均匀得基本酶液，所用酶保护剂为甘氨酸、山梨酸钾和甘油，成分含量按体积百分比计：黑曲霉J6酶液93.5～98.8%、甘氨酸0.1～0.5%、山梨酸钾0.1～1%、甘油1～5%。

4.如权利要求1所述果蔬农残生物酶清洗剂，其特征在于所述三步的第三步是吸附固定：将吸附剂与基本酶液按1:1～2的质量与体积比（g/ml）混合搅拌拌匀，经吸附固定即成成品清洗剂。

5.如权利要求1所述果蔬农残生物酶清洗剂，其特征在于所述吸附剂的组分碳酸钙和白炭黑均为粉状，二者质量比为1:2～3。