CN104297316B - 一种基于β-环糊精的手性传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术以及电化学研究领域，具体而言，本发明提供了一种基于β‑环糊精(β‑CD)的手性传感器及其制备方法。不同的手性异构体在生物体内的生物活性，药理作用，代谢过程等有着明显的差别，因此发展简单、准确、快速的手性识别方法成为近年来手性分析的热门方向。本发明提供了一种基于β‑环糊精的手性传感器，该手性传感器利用β‑环糊精为手性选择剂来识别手性氨基酸(D/L‑色氨酸)样品，并通过电化学检测手段来实现手性识别。
Description
技术领域
本发明属于生物技术以及电化学研究领域，特别涉及一种基于β-环糊精(β-CD)的手性传感器及其制备方法。
背景技术
手性化合物与生命过程息息相关，不同的手性异构体在生物体内的生物活性，药理作用，代谢过程等有着明显的差别，因此发展简单，准确，快速的手性识别方法成为近年来手性分析的热门方向。最近几年，手性传感器的研究已经取得了一定的发展，其中的手性选择剂大部分是借鉴色谱上的手性固定相。β-CD由于具有特殊的构象，在色谱上能够很好地分离手性异构体，而且国内已有专利报道利用β-CD作色谱手性固定相。例如β-环糊精通常在色谱上被用来分离手性氨基酸和手性药物，分离效果很好，并且实验及结构分析证明的，β-环糊精手性选择性主要来源于它与手性化合物(主-客体)之间的空间匹配，氢键作用、范德华力和疏水作用；另一方面，β-环糊精便宜易得、安全无毒，同样是药物分离等研究领域的热点。
因此，以β-环糊精良好的手性选择性与传感器能够简单、快速和精确测定被分析物的优点相结合为切入点，对手性传感器的发展将具有重要的理论和实际研究意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于β-环糊精(β-CD)的手性传感器，使手性识别操作简便，识别效率及检测灵敏度高。
该传感器的电极表面覆盖聚L-谷氨酸/Cu2-β-CD膜。实验结果表明，该传感器不仅能够有效地手性识别，而且能够灵敏地检测氨基酸异构体和药物异构体。
本发明的传感器中，电极可以是玻碳电极、铂片电极、丝网印刷电极或饱和甘汞电极等。
本发明还提供了一种上述传感器的制备方法：
(1)向含有0.5M NaOH和0.02Mβ-环糊精(β-CD)的混合溶液中加入0.04M的CuSO4·5H2O溶液，充分搅拌、过滤后，在滤液中加入乙醇，静置24h，过滤、真空干燥一周，得到Cu2-β-CD，
(2)采用三电极体系，以玻碳电极为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，在-0.6V～2.0V的电化学窗范围内，将含有0.05M L-谷氨酸的电解质溶液以0.1V/s进行循环伏安扫描25圈，得到聚L-谷氨酸修饰电极，
其中，作为工作电极的玻碳电极为杆状，其直径为2-4毫米；
(3)将步骤(2)中得到的修饰电极，浸入到配制好的含有5mM步骤(1)中制备的Cu2-β-CD的pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)中，在8℃下自组装12h，得到聚L-谷氨酸/Cu2-β-CD修饰电极，
其中，磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)的浓度为0.1M。
本发明的传感器具有温度敏感性，在30-35℃时，有较高的识别效率，
本发明的传感器具有pH敏感性，在pH＝7-8时，有较高的识别效率。
本发明还提供了一种上述传感器的应用：将上述传感器，置于含有氨基酸异构体的磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)中富集120s，磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)的pH范围为7-8，富集后，将电极置于磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)中进行电化学测定即可，
本发明的传感器应用过程中，采用三电极系统进行电化学测定，铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，本发明制备的聚L-谷氨酸/Cu2-β-CD修饰电极为工作电极，在0.1mM的磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液，pH 7-8)中，记录差分脉冲伏安曲线。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种基于β-环糊精的手性传感器，该传感器主要是通过L-谷氨酸和Cu2-β-CD溶液在低温下自组装来制备传感器，制备方法简单，原料便宜易得、安全无毒，且检测灵敏度比较高，并具有温度、pH敏感性。手性识别时，只需将该传感器浸入到支持电解质配置的氨基酸溶液中一段时间，接着通过电化学检测得到手性识别结果，操作简单，省时，而且具有较高的检测灵敏度。本发明的手性传感器能高效地识别色氨酸异构体，检测温度更加适宜，且主要包合D-色氨酸。实验表明，该手性传感器能检测到0.5mM的色氨酸异构体。
附图说明
图1为具体实施方式中，传感器的异构选择性系数随温度变化结果图。
图2为具体实施方式中，异构选择性系数随pH变化结果图。
图3为具体实施方式中，传感器的L-色氨酸峰电流随pH变化结果图。
具体实施方式
(1)β-环糊精双核铜(Cu2-β-CD)的制备：
配置10mL含有0.5M NaOH和0.02Mβ-环糊精(β-CD)的混合溶液，在向其中加入15mL的0.04MCuSO4·(H2O)5溶液，迅速形成Cu(OH)2沉淀，在室温下(25℃)下搅拌1小时，过滤，向滤液中加入200mL的乙醇，溶液中逐渐出现蓝色沉淀，静置24h，然后将沉淀过滤出来，用乙醇和少量水洗涤，在25℃下真空干燥一周，得到蓝色固体粉末，即为Cu2-β-CD；
(2)聚谷氨酸/Cu2-β-CD修饰电极的制备：
采用三电极体系，以玻碳电极为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，在-0.6V～2.0V(vs.SCE)的电化学窗范围内，在包含0.05M L-谷氨酸的支持电解质溶液(0.1M PBS，pH＝7.0)中，以0.1V/s的扫速进行循环伏安扫描(CV)并扫描25圈，得聚L-谷氨酸修饰电极，
再将上述得到的聚L-谷氨酸修饰电极，浸入配制好的含有5mM步骤(1)中制备的Cu2-β-CD的pH＝7.0的0.1M PBS溶液中，在8℃下自组装12h，得到聚L-谷氨酸/Cu2-β-CD修饰电极；
(3)手性识别：
在30℃下，将步骤(2)中制备的聚L-谷氨酸/Cu2-β-CD修饰电极浸入0.5mM的色氨酸对映体溶液(含有0.5mM的色氨酸对映体的pH＝7.0的0.1M PBS溶液)中，施加-0.1V电位富集120s，再将该传感器置于色氨酸磷酸缓冲溶液中进行检测；
(4)实验采用三电极体系，步骤(2)中制备的聚L-谷氨酸/Cu2-β-CD修饰电极为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，
以0.1V/s的扫速在0.4V～1.0V的电化学窗范围内，对0.5mM的色氨酸对映体溶液(0.1M PBS溶液为底液，pH＝8.0)进行检测，以步进电位5mV，脉冲幅度50mV，脉冲宽度0.05s的参数进行差分脉冲(DPV)，每次测完后修饰电极在空白溶液(0.1M的PBS溶液pH＝7.0)中进行反复电位扫描至稳定，恢复电极活性，以备再用。
该手性传感器按照上述实施方式进行手性识别色氨酸，得到的手性识别结果如图1、图2、图3所示：
定义异构选择性系数α为该传感器对D-色氨酸和L-色氨酸进行识别所得到的氧化峰电流之比。则该传感器对色氨酸的异构选择性系数为3.28(采用五次测试的结果取平均值。)；
从图1中看出：该传感器在30-35℃对色氨酸有着较高的识别效果，
在低温的时候由于Cu2-β-CD腔内的水分子之间结构稳定，未能和色氨酸异构体形成有效的氢键，导致识别效果较低；当随着温度的上升，Cu2-β-CD腔内的水分子与D-Trp之间形成氢键，导致识别效果增加，但随着温度进一步提升，氢键变得无序，这样氢键受到破坏，识别效果下降。
图2中，显示在pH＝7-8，对色氨酸有着较高的识别效果
色氨酸的等电点pH＝5.89。在酸性环境里(pH<5)，色氨酸的氨基带正电NH3 +，腔内的高能水也被质子化H+(H2O)n，D-Trp的NH3 +与H+(H2O)n存在相斥作用，因为斥力大于它们之间的氢键作用，所以D-Trp的包合作用低于L-Trp，故ID-Trp/IL-Trp小于1；当pH在5-8时，氢键作用逐渐占据优势，ID-Trp/IL-Trp值逐渐增大；但pH>8时，色氨酸的羧基带负电，且随着pH增大，负电荷浓度也增大，会与Cu2-u也增大的Cu2+离子形成静电引力，附着在Cu2-u形成静的外围。由于对于D-，L-Trp是没有选择性的，虽然腔内包合作用存在差异，但当外围附着量随pH增大而快速增加时，识别能力也快速下降，且对着pH值的加大，L-色氨酸的电流逐渐降低。
Claims (5)
1.一种基于β-环糊精的手性传感器的应用，其特征在于：所述的传感器的电极表面覆盖聚L-谷氨酸/Cu2-β-CD膜；
所述应用为，将所述传感器置于含有氨基酸异构体的磷酸盐缓冲溶液中富集120s，磷酸盐缓冲溶液的pH范围为7-8，富集后将电极置于磷酸盐缓冲溶液中进行电化学测定即可。
2.如权利要求1所述的基于β-环糊精的手性传感器的应用，其特征在于：所述的传感器的电极为玻碳电极、铂片电极、丝网印刷电极或饱和甘汞电极。
3.如权利要求1或2所述的基于β-环糊精的手性传感器的应用，其特征在于：所述基于β-环糊精的手性传感器的制备方法为，
(1)向含有0.5M NaOH和0.02Mβ-环糊精的混合溶液中加入0.04M的CuSO4·5H2O溶液，充分搅拌、过滤后，在滤液中加入乙醇，静置24h，过滤、真空干燥一周，得到Cu2-β-CD；
(2)采用三电极体系，以玻碳电极为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，在-0.6V～2.0V的电化学窗范围内，将含有0.05M L-谷氨酸的电解质溶液以0.1V/s进行循环伏安扫描25圈，得到聚L-谷氨酸修饰电极；
(3)将步骤(2)中得到的修饰电极，浸入到配制好的含有5mM步骤(1)中制备的Cu2-β-CD的pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液中，在8℃下自组装12h，得到聚L-谷氨酸/Cu2-β-CD修饰电极。
4.如权利要求3所述的基于β-环糊精的手性传感器的应用，其特征在于：步骤(2)中所述的电解质溶液为pH＝7.0的0.1M PBS溶液。
5.如权利要求3所述的基于β-环糊精的手性传感器的应用，其特征在于：步骤(3)中所述的磷酸盐缓冲溶液为pH＝7.0的0.1M PBS溶液。
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