CN104273527A - 一种保健组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种保健组合物，所述保健组合物由下列重量份数的原料制成：发酵虫草菌粉(Cs-4)1～5份、丹参1～9份、枸杞子2～18份。本发明保健组合物主要由蝙蝠蛾拟青霉菌粉(发酵虫草菌粉Cs-4)及天然药用植物制成的，具有增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能作用。本发明还提供其制备方法和用途。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域，特别涉及一种主要由蝙蝠蛾拟青霉菌粉(发酵虫草菌粉Cs-4)及天然药用植物制成的、具有增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能作用的保健组合物及其制造方法和用途。
背景技术
免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)的能力，是处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。现代免疫学认为，免疫力是人体识别和排除“异己”的生理反应。人体内执行这一功能的是免疫系统。数百万年来，人类生活在一个既适合生存又充满危险的环境，人类能得以续存，是获得了非凡的免疫力。所以说免疫力是生物进化过程的产物。
免疫力低下使免疫系统不能正常发挥保护作用，在此情况下，极易招致细菌、病毒、真菌等感染，因此免疫力低下最直接的表现就是容易生病。因经常患病，加重了机体的消耗，所以一般有体质虚弱、营养不良、精神萎靡、疲乏无力、食欲降低、睡眠障碍等表现，生病、打针吃药便成了家常便饭。每次生病都要很长时间才能恢复，而且常常反复发作。
随着社会走向老龄化，高血压发病率较高，不少高血压患者肾功能常不同程度受损；高尿酸血症发病率也较高，也影响肾功能；尿路结石手术治疗也可能会影响肾功能；一些药物，如一些抗生素、解热镇痛药等也可能会引发肾功能不全，等等。研制一种能补肾、帮助恢复肾功能、维护肾功能的保健食品很有意义。
在社会经济日益发展的今天，人民群众普遍追求提高生活质量、身体健康、长寿。而大多数人都希望能通过运动、饮食、保健食品等手段提高自身的免疫力、抗氧化力和通过中医保健来达到维护正常肾功能，延年益寿的目的。经济发展伴随着生活水平和卫生健康知识水平的提高，人们这种愿望日渐强烈。因此研发一些能增强免疫力、抗氧化力和滋补肾虚、改善肾功能的保健食品显得越来越重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种主要由蝙蝠蛾拟青霉菌粉(发酵虫草菌粉Cs-4)及天然药用植物制成的、具有增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能作用的保健组合物。
本发明所述的保健食品主要由以下重量配比的原料组成：发酵虫草菌粉(Cs-4)1～5份；丹参1～9份；枸杞子2～18份。
优先的，所述保健组合物由下列重量份数的原料制成：发酵虫草菌粉(Cs-4)1份、丹参1.65份、枸杞子3.53份。
发酵虫草菌粉(Cs-4)是采用与虫草天然菌种发酵而得的人工虫草，具有与天然虫草相似的化学成分和药理作用。发酵虫草菌粉(Cs-4)，功能补益肺肾，秘精益气。用于肺肾两虚，精气不足，久咳虚喘，神疲乏力，不寐健忘，腰膝痠软，月经不调，阳瘘早泄；慢性支气管炎、慢性肾功能不全、高脂血症、肝硬化见上述证候者。经药理实验证实，本品具有抗炎，止咳、祛痰、镇静、促性腺作用；能降低血清胆固醇、甘油三酯和脂质过氧化物，增加心肌与脑供血，具有较轻度降血压、抑制血小板聚集、延长缺氧时动物生存时间等作用，对心脑组织有保护作用。其主要药理作用与青海天然虫草相似。
窦敬芳、翁孝刚，发酵虫草菌粉对糖尿病大鼠肾脏结构的影响[中国临床康复2006，10(15)：105～107]，动物实验显示，发酵虫草菌粉可阻止肾脏重量的增加和肾小球各体积增大，显著改善糖尿病大鼠肾脏结构，防止系膜区扩大和基底膜增厚，具有显著地抗肾小球纤维化的作用。同时降低组织糖基化蛋白水平，降低血脂，并可有效地防止肾小管病变。
郭丹丹等，虫草菌粉对糖尿病性心肌病模型大鼠心室重塑与心肌炎症因子的影响[山东中医药大学学报2013，37(1)：56～58]，研究结果表明，虫草菌粉可改善糖尿病性心肌病模型大鼠的心室重塑，其机制可能与调节心肌细胞炎症因子NF-KB、TNF-α、IL-10的表达有关。
孙丽霞，发酵虫草菌粉治疗糖尿病肾病的临床研究[内蒙古医学杂志2009，41(7)：811～812]，研究结果表明，采用发酵虫草菌粉治疗糖尿病肾病，具有较好的临床效果。同时，发酵虫草菌粉能降低血清胆固醇、甘油三酯和脂质过氧化物，增加心肌与脑的供血，具有轻度降血压、抑制血小板聚集、延长缺氧时动物生存时间等作用；对心、脑组织有保护作用。
张玉等，发酵虫草菌粉对早期糖尿病肾病患者尿蛋白及脂代谢的影响[药物与临床试验2012，50(36)：64～65]，研究结果表明，在应用缬沙坦的基础上，加用发酵虫草菌粉对早期糖尿病肾病患者有良好改善作用。
刘瑞林等，发酵虫草菌粉对原发性高血压患者血尿酸及血脂的影响[临床报道2006，27(8)：498～502]，研究结果表明，发酵虫草菌粉用于原发性高血压患者可同时降低患者血UA、TG水平，并提高HDL-C水平。
丹参，性味苦、微寒，归心、肝经。功能活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，癓瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。
《中药现代研究与临床应用》：“丹参能明显增加肾动脉血流量。”“丹参均能使各治疗组血液粘稠度明显降低。”“丹参不仅可以增加冠心病患者和动物的血液流速，而且可以增加全血和红细胞2-3DPG含量，明显改善缺氧动物的氧分压和血氧饱和度。”
《本经》：“主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚；破癓除瘕，止烦满，益气。”
《别录》：“养血，去心腹痼疾结气，腰脊强，脚痹；除风邪留热，久服利人。”
黄怀东等，丹参对冠心病患者血浆5-羟色胺水平及血液流变学的影响[中国基层医学1997，4(4)：219]，研究表明：丹参具有抗张血管，改善心肌微循环灌注间，提高心肌对缺血缺氧耐受性，高浓度丹参可抑制血小板致密颗粒释放5-HT；由此可证明，丹参可阻止5-HT释放，改善血液粘滞性和高凝血状态，是预防和治疗冠心病的有效药物。
邓世周，丹参液对31例冠心病患者血液流变学影响的观察(新中医1994，1：59-60)，提示丹参液确实能够降低血粘度，改变红细胞膜的电荷，增加经细胞的变形能力，降低血小板的凝聚性能，起到防治心脑血管疾病突然发作的目的。
枸杞子，性味甘，平，归肝、肾经。功能滋补肝肾，益精明目。主治，用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，阳萎遗精，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。
《本草经疏》：枸杞子，润而滋补，兼能退热，而专于补肾、润肺、生津、益气，为肝肾真阴不足、劳乏内热补益之要药。
《本草汇言》：俗云枸杞善能治目，非治目也，能壮精益神，神满精足，故治目 有效。
《本草通玄》：枸杞子，补肾益精，水旺则骨强，而消渴、目昏、腰疼膝痛无不愈矣。
《本草正》：枸杞，味重而纯，故能补阴，阴中有阳，故能补气。所以滋阴而不致阴衰，助阳而能使阳旺。
《中药大辞典》：枸杞滋肾，润肺，补肝，明目。治肝肾阴亏，腰膝酸软，头晕，目眩，目昏多泪，虚劳咳嗽，消渴，遗精。
王玲等，枸杞子多糖的分离、纯化、分析及免疫作用的研究[昆明医学院学报1995，16(2)29～32]，研究结果表明，所提取的枸杞子多糖具有明显增强ConA和LPS诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖作用，并对S-180荷瘤小鼠具明显的免疫抑瘤作用。
柲瑞欣，枸杞子多糖提取工艺及抗氧化活性的研究与探讨[化学工程与装备2010，9：42～43]，研究结果表明，枸杞子多糖对羟基自由基的清除效果较好，其清除率高于维生素C，而对超氧阴离子自由基的清除率低于维生素C，在实验浓度范围内，其清除能力不随多糖浓度的增加而显著增高。
睢大员等，枸杞子、北五味子和黄精三种多糖的增强免疫与抗脂质过氧化作用[白求恩医科大学学报，22(6)：606～607]，研究结果表明，三种多糖按400mg/kg给小鼠每天灌胃1次，连续7天，均可使小鼠免疫器官的重量增加，明显增强网状内皮系统对印度加墨汁的吞噬能力，亦能明显降低CCl4中毒小鼠肝组织丙二醛含量，具有抗脂质过氧化作用。其作用强度依次为枸杞子粗多糖、北五味子粗多糖和黄精粗多糖。
本发明还提供一种用于增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能的保健组合物的制备方法，其包括下列步骤：
A、按下列重量份数称取原料：发酵虫草菌粉(Cs-4)1～5份、丹参1～9份、枸杞子2～18份；
B、取发酵虫草菌粉(Cs-4)，备用；
C、取丹参用30～97％的乙醇提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇后药液备用；药渣用水提取1～2次，每次0.5～3小时，滤过，滤液与上述药液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，备用；
D、取枸杞子用水提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，浓缩到至相对密度为1.05～1.5，所述相对密度在60℃测定，加乙醇至含醇量达30～80％，搅拌，静置1～72小时，滤过，取沉淀，干燥，粉碎成细粉，备用；
E、将上述三种细粉混合均匀制成制剂。
本发明还提供上述的保健组合物作为用于增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能的保健食品的用途。优选的，所述的保健食品为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、锭剂、合剂、口服溶液剂、散剂、煎膏剂、糖浆剂，更优选为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
实施例一：称取发酵虫草菌粉(Cs-4)1000克，丹参1000克，枸杞子1000克。
1、取发酵虫草菌粉(Cs-4)，备用；
2、取丹参用30～97％的乙醇提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇后药液备用；药渣用水提取1～2次，每次0.5～3小时，滤过，滤液与上述药液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，备用；
3、取枸杞子用水提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，浓缩到至相对密度为1.03～1.5(60℃测)，加乙醇至含醇量达40～80％，搅拌，静置0.5～48小时，滤过，取沉淀，干燥，粉碎成细粉，备用；
将上述步骤制得的三种粉未混匀制成制剂即可。
实施例二：称取发酵虫草菌粉(Cs-4)1000克，丹参1650克，枸杞子3530克。
1、取发酵虫草菌粉(Cs-4)，备用；
2、取丹参用30～97％的乙醇提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇后药液备用；药渣用水提取1～2次，每次0.5～3小时，滤过，滤液与上述药液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，备用；
3、取枸杞子用水提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，浓缩到至相对密度为1.03～1.5(60℃测)，加乙醇至含醇量达40～80％，搅拌，静置0.5～48小时，滤过，取沉淀，干燥，粉碎成细粉，备用；
将上述步骤制得的三种粉未混匀制成制剂即可。
实施例三：称取发酵虫草菌粉(Cs-4)1000克，丹参300克，枸杞子800克。
1、取发酵虫草菌粉(Cs-4)，备用；
2、取丹参用30～97％的乙醇提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇后药液备用；药渣用水提取1～2次，每次0.5～3小时，滤过，滤液与上述药液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，备用；
3、取枸杞子用水提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，浓缩到至相对密度为1.03～1.5(60℃测)，加乙醇至含醇量达40～80％，搅拌，静置0.5～48小时，滤过，取沉淀，干燥，粉碎成细粉，备用；
将上述步骤制得的三种粉未混匀制成制剂即可。
本发明产品对增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能有较好的效果，制造方法独特、可行，适合药厂、保健食品厂的应用。
下面为发明人委托广东药学院对本发明保健组合物(以下称为虫草丹杞胶囊)药效学的实验研究，其中虫草丹杞胶囊浸膏为上述制备例二制备得到，具体如下：
一 细胞免疫功能测定
(一)虫草丹杞胶囊对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞转化的影响
1试验材料
1.1主要试剂 RPMI1640培养液、小牛血清、谷氨酰胺、2-巯基乙醇(2-Me)、双抗、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸(HCl)、异丙醇、MTT、Hank’s液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)、0.4％台酚兰溶液。
1.2药物：虫草丹杞胶囊，3.5g生药/g，批号：20131225，东莞市亚洲制药有限公司提供。
1.3试验剂量
虫草丹杞胶囊临床每日用量为10.5g生药/d(1.75g生药/0.5g/粒，一次2粒，一天3次)，成人体重以60kg计，平均用药剂量为0.175g生药/kg/d，本试验小鼠低、中、高三个剂量组分别设为1.75、3.5、7g生药/kg/d，上述剂量为临床用药剂量的10、20、40倍(按体重计算)。
1.4动物KM小鼠，SPF级，18～22g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2013-0002。
1.5主要器材：纱布、200目筛网、24孔培养板、96孔培养板(平底)、手术器械、大号注射器内芯、CO2培养箱、酶标仪、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器、离心机、倒置显微镜。
2方法
2.1溶液配制
完全培养基：RPMI1640培养液，用前加入10％小牛血清，1％谷氨酰胺(200mmol/L)，1％双抗(1万U/mL)及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇。
ConA液：用双蒸水配制成100μg/mL的溶液，过滤除菌，-20℃保存。
无菌Hank’s液：用前以3.5％NaHCO3调pH7.2。
MTT液：将20mgMTT溶于4mL pH7.2的PBS中，现配现用。
酸性异丙醇溶液：96mL异丙醇中加入4mL1mol/L的HCl，临用前配制。
2.2分组及给药将小鼠按体重随机分4组，即虫草丹杞胶囊高、中、低剂量组，同时设空白对照组，每组12只。灌胃量为0.2ml/10g，每天1次，连续4周。空白对照组灌胃给予同容积的生理盐水。
2.3MTT法
2.3.1脾细胞悬液的制备：末次给药后1h，称重，无菌取脾、胸腺，称重，将脾置于盛有3mL无菌Hank’s液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液冲洗两次，每次离心10min(1000r/min)。然后将脾细胞重悬于2mL的完全培养液中，用0.4％台酚兰拒染法，计数活细胞数，调整细胞浓度为3×106各/mL。
2.3.2淋巴细胞增殖反应：将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加入75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2,培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶标仪，以570nm波长测定光密度。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。
3结果
由表1可见，虫草丹杞胶囊各剂量组小鼠的胸腺/体重和脾脏/体重比值与空白对照组比较，无显著性差异(P＞0.05)，提示虫草丹杞胶囊对小鼠免疫器官/体重比值无明显影响。虫草丹杞胶囊各剂量组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力均高于空白对照组，其中虫草丹杞胶囊高剂量组脾淋巴细胞增殖能力较强(P<0.05)。提示虫草丹杞胶囊对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞转化的具有一定的促进作用。
表1 虫草丹杞胶囊小鼠胸腺/体重、脾脏/体重比值，脾淋巴细胞增殖能力的影响
注：对照组比较﹡p＜0.05，﹡﹡p﹤0.01
4小结
小鼠连续给予虫草丹杞胶囊灌胃4周，对小鼠免疫器官/体重比值无明显影响，对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力有一定的促进作用。但无显著性差异。结果提示虫草丹杞胶囊对小鼠的细胞免疫功能不明显。
(二)虫草丹杞胶囊对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响(耳肿胀法)
1试验材料
1.1主要试剂 二硝基氟苯(DNFB)，丙酮。
1.2药物：虫草丹杞胶囊，3.5g生药/g，批号：20131225，东莞市亚洲制药有限公司提供。
1.3试验剂量
虫草丹杞胶囊临床每日用量为10.5g生药/d(1.75g生药/0.5g/粒，一次2粒，一天3次)，成人体重以60kg计，平均用药剂量为0.175g生药/kg/d，本试验小鼠 低、中、高三个剂量组分别设为1.75、3.5、7g生药/kg/d，上述剂量为临床用药剂量的10、20、40倍(按体重计算)。
1.4动物KM小鼠，SPF级，18～22g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2013-0002。
1.5主要器材：打孔器，电子天平(万分之一)。
2方法
2.1DNCB溶液配制称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5ml丙酮麻油溶液(丙酮:麻油＝1:1)，倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封备用。
2.2分组及给药将小鼠按体重随机分4组，即虫草丹杞胶囊高、中、低剂量组，同时设空白对照组，每组12只。灌胃量为0.2ml/10g，每天1次，连续4周。空白对照组灌胃给予同容积的生理盐水。
2.3致敏给药第23天，先将小鼠腹部皮肤剪毛，再用硫化钡脱毛，范围3cm×3cm，然用DNFB溶液均匀涂抹致敏，每只50μl。
2.4DTH的产生与测定致敏5天后，用DNFB溶液均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，每只10μl。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。用左右耳重量之差表示DTH的程度。
3结果
由表2可见，虫草丹杞胶囊高剂量组小鼠的左右耳片重量差值高于空白对照组比较，但无显著性差异(P>0.05)，提示虫草丹杞胶囊可能对小鼠迟发型变态反应作用具有一定的促进作用。
表2 虫草丹杞胶囊对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响(耳肿胀法，)
注：与空白对照组比较﹡p＜0.05，﹡﹡p﹤0.01
4小结
虫草丹杞胶囊连续灌胃给予小鼠4周，对小鼠DTH有一定的促进作用，但无显著性差异。结果表明虫草丹杞胶囊对小鼠的细胞免疫功能不明显。
二 体液免疫功能测定
(一)虫草丹杞胶囊对小鼠血清溶血素的影响(血凝法)
1试验材料
1.1主要试剂 2％SRBC，生理盐水。
1.2药物：虫草丹杞胶囊，3.5g生药/g，批号：20131225，东莞市亚洲制药有限公司提供。
1.3试验剂量
虫草丹杞胶囊临床每日用量为10.5g生药/d(1.75g生药/0.5g/粒，一次2粒，一天3次)，成人体重以60kg计，平均用药剂量为0.175g生药/kg/d，本试验小鼠低、中、高三个剂量组分别设为1.75、3.5、7g生药/kg/d，上述剂量为临床用药剂量的10、20、40倍(按体重计算)。
1.4动物KM小鼠，SPF级，18～22g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2013-0002。
1.5主要器材：微量血凝实验板，离心机。
2方法
2.1溶液配制
0.5％SRBC：取15ml2％SRBC，加生理盐水至60ml。
2.2分组及给药将小鼠按体重随机分4组，即虫草丹杞胶囊高、中、低剂量组，同时设空白对照组，每组12只。灌胃量为0.2ml/10g，每天1次，连续4周。空白对照组灌胃给予同容积的生理盐水。
2.3血凝法
2.3.1免疫动物及血清分离给药23天后，每只小鼠腹腔注射0.2ml2％SRBC进行免疫。免疫后第5天，给药1h后，称重，摘除眼球取血，放置约1h，2000r/min离 心10min，收集血清。将小鼠处死，取胸腺、脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，记录。
2.3.2凝集反应用生理盐水将血清倍比稀释(1:2～1:256)，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl0.5％SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
血清凝集程度一般分为5级(0—Ⅳ)记录，按下式计算抗体积数，受试虫草丹杞胶囊组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。
抗体积数＝(S1+2S2+3S3……nSn)
式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。
0级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。
Ⅰ级 红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。
Ⅱ级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。
Ⅲ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。
Ⅳ级 凝集的红细胞均匀铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
3结果
由表3可见，虫草丹杞胶囊各剂量组小鼠的抗体积数均高于空白对照组，其中虫草丹杞胶囊高剂量组明显高于空白对照组(P＜0.05)，提示虫草丹杞胶囊对小鼠血清溶血素有一定的作用。
表3 虫草丹杞胶囊对小鼠胸腺/体重、脾脏/体重比值，抗体积数的影响
注：对照组比较﹡p＜0.05，﹡﹡p﹤0.01
4小结
小鼠连续给予虫草丹杞胶囊灌胃4周，对小鼠血清血溶素的抗体积数具有明显 的作用。结果表明虫草丹杞胶囊对小鼠血清溶血素抗体水平具有明显的促进作用。
三 单核—巨噬细胞功能测定
(一)虫草丹杞胶囊对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响
1试验材料
1.1主要试剂 印度墨水，Na2CO3，
1.2药物：虫草丹杞胶囊，3.5g生药/g，批号：20131225，东莞市亚洲制药有限公司提供。
1.3试验剂量
虫草丹杞胶囊临床每日用量为10.5g生药/d(1.75g生药/0.5g/粒，一次2粒，一天3次)，成人体重以60kg计，平均用药剂量为0.175g生药/kg/d，本试验小鼠低、中、高三个剂量组分别设为1.75、3.5、7g生药/kg/d，上述剂量为临床用药剂量的10、20、40倍(按体重计算)。
1.4动物KM小鼠，SPF级，18～22g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2013-0002。
1.5主要仪器：酶标仪。
2方法
2.1溶液配制
注射用墨水：取印度墨水原液8ml，置清洁干燥小瓶中，加入生理盐水24ml，即印度墨水稀释4倍备用。
0.1％Na2CO3溶液：取0.5g Na2CO3，加蒸馏水至500ml。
2.2分组及给药将小鼠按体重随机分4组，即虫草丹杞胶囊高、中、低剂量组，同时设空白对照组，每组12只。灌胃量为0.2ml/10g，每天1次，连续4周。空白对照组灌胃给予同容积的生理盐水。
2.3碳廓清实验末次给药后，称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨水，按每10g体重0.1ml计算。待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μl，立即将其加到2ml0.1％Na2CO3溶液中。用酶标仪在600nm波长处测光密度值(OD值)，以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸 吸干脏器表面血污，称重。按下式计算吞噬指数(a)。
K＝(lgOD1-lgOD2)/(t2－t1)，a＝K1/3×体重/(肝重+脾重)
3结果
由表4可见，虫草丹杞胶囊各剂量组小鼠的吞噬指数均高于空白对照组，其中虫草丹杞胶囊剂高量组明显高于空白对照组(P＜0.05)，提示虫草丹杞胶囊对小鼠单核-巨噬细胞的碳廓清能力作用明显。
表4 虫草丹杞胶囊对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响
注：对照组比较﹡p＜0.05，﹡﹡p﹤0.01
4小结
虫草丹杞胶囊连续灌胃给予小鼠4周，对小鼠单核-巨噬细胞的碳廓清能力具有明显的作用。表明虫草丹杞胶囊能增强小鼠单核-巨噬细胞吞噬清除能力。
四、虫草丹杞胶囊对NK细胞活性的影响(LDH法)
1试验材料
1.1主要试剂 YAC-1细胞、Hank's液(pH7.2～7.4)、RPMI1640完全培养液、1％NP40。
1.2药物：虫草丹杞胶囊，3.5g生药/g，批号：20131225，东莞市亚洲制药有限公司提供。
1.3试验剂量
虫草丹杞胶囊临床每日用量为10.5g生药/d(1.75g生药/0.5g/粒，一次2粒，一天3次)，成人体重以60kg计，平均用药剂量为0.175g生药/kg/d，本试验小鼠低、中、高三个剂量组分别设为1.75、3.5、7g生药/kg/d，上述剂量为临床用药剂量的10、20、40倍(按体重计算)。
1.4动物KM小鼠，SPF级，18～22g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2013-0002。
1.5主要器材：纱布、200目筛网、24孔培养板、96孔培养板(平底)、手术器械、大号注射器内芯、CO2培养箱、酶标仪、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器、离心机、倒置显微镜。
2方法
健康昆明种小鼠48只，体重18-22g，雌雄各半。根据体重，随机分成4组，即空白对照组、虫草丹杞胶囊高、中、低剂量组，每组药物给予灌胃相应浓度的供试品，空白对照组给予等容积的生理盐水，每天1次，给药容积为20ml/kg，连续4周。
末次给药后，处死小鼠，进行无菌取脾。将取得脾脏置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，Hank's液洗2次，离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液，1000rpm，10min离心，然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，调整细胞浓度为2×107个/mL。试验前24h将YAC-l细胞(靶细胞)传代培养，应用前用Hank’s液洗3次，用RPMT1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。取靶细胞和脾细胞悬液(效应细胞)各100μ1(效靶比50：1)，加入U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μ1，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μl；上述各项均设3个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，离心，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HC130μl，在酶标仪490nm波长处测光密度(OD)值，计算NK细胞活性。
NK细胞活性＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
3结果：
由表5可见，虫草丹杞胶囊各剂量组小鼠NK细胞杀伤活性明显高于正常对照组，其中虫草丹杞胶囊高剂量组高于空白对照组(P＜0.05)，提示虫草丹杞胶囊能增强NK细胞杀伤活性。
表5 虫草丹杞胶囊对小鼠NK细胞杀伤活性的影响
注：对照组比较﹡p＜0.05，﹡﹡p﹤0.01
4小结
虫草丹杞胶囊连续灌胃给予小鼠4周，能增强小鼠小鼠NK细胞杀伤活性。
五、虫草丹杞胶囊对老年鼠血液中抗氧化酶活力的影响
1试验材料
1.1主要试剂 超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(南京建成生物工程研究所,批号20130930)；丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号201301103)。1.2药物：虫草丹杞胶囊，3.5g生药g生药/g，批号：20131225，东莞市亚洲制药有限公司提供。
1.3试验剂量
虫草丹杞胶囊临床每日用量为10.5g生药/d(1.75g生药/0.5g/粒，一次2粒，一天3次)，成人体重以60kg计，平均用药剂量为0.175g生药/kg/d，本试验小鼠低、中、高三个剂量组分别设为1.75、3.5、7g生药/kg/d，上述剂量为临床用药剂量的10、20、40倍(按体重计算)。
1.4动物KM小鼠，SPF级，35～40g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2013-0002。
1.5主要器材：DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司)；低温高速离心机(上海安亭科学仪器厂，型号TGL-16G)；UV-1800紫外-可见光光度计(北京瑞利 分析有限公司)。
2方法：
取KM老龄小鼠，按体重随机分成4组，即衰老模型组、虫草丹杞胶囊高、中、低三个剂量组，每组12只，另取健康成年KM小鼠12只做正常对照组。每天给予相应的药物，正常和模型组给予等量生理盐水，连续给药4周，于末次给药后1h小鼠眼眶静脉丛取血，分离血清，分别测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。
3结果
表6结果表明：与正常对照组相比，衰老模型对照组SOD活性明显降低，MDA值明显升高(p﹤0.01)。虫草丹杞胶囊高剂量组可显著降低MDA值(p﹤0.05)，中、高剂量组可升高SOD活性(p﹤0.05)。
表6 虫草丹杞胶囊对老年鼠血液中抗氧化酶活力的影响
注：与正常对照组比较▲p＜0.05，▲▲p﹤0.01；与衰老模型对照组比较﹡p＜0.05，﹡﹡p﹤0.01
4小结
虫草丹杞胶囊可提高体内超氧化物歧化酶的活性，减少丙二醛产生。具有一定的抗氧化作用。
六、虫草丹杞胶囊对糖皮质激素致肾阴虚模型小鼠免疫功能及睾酮水平的影响
1试验材料
1.1主要试剂 氢化可的松，10mg/支。上海信宜药厂有限公司。
1.2药物：虫草丹杞胶囊，3.5g生药/g，批号：20131225，东莞市亚洲制药有限公司提供。
1.3试验剂量
虫草丹杞胶囊临床每日用量为10.5g生药/d(1.75g生药/0.5g/粒，一次2粒，一天3次)，成人体重以60kg计，平均用药剂量为0.175g生药/kg/d，本试验小鼠低、中、高三个剂量组分别设为1.75、3.5、7g生药/kg/d，上述剂量为临床用药剂量的10、20、40倍(按体重计算)。
1.4动物KM小鼠，SPF级，19～23g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2013-0002。
2方法
选取昆明种小鼠，雄性，体重19-23g，将小鼠按体重随机分为正常对照组、模型对照组、虫草丹杞胶囊高、中、低剂量给药组，每组12只。除正常对照组各鼠皮下注射生理盐水外，其余各组小鼠分别皮下氢化可的松50mg/kg，每天1次，连续7天。同时给药组给予相应剂量的药物，模型对照组给予同容积的生理盐水。记录动物每日体重的变化。于实验第7天下午摘眼球处死小鼠，分离血清检测血清睾酮水平，取胸腺、脾脏称重。计算胸腺/体重和脾脏/体重比值。
3结果
表7结果表明：与正常对照组相比，肾阴虚模型对照组胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、血清睾酮值水平明显减小，具有显著性差异(p﹤0.01)。与肾阴虚模型组比较，虫草丹杞胶囊各剂量组可改善肾阴虚免疫器官及血清睾酮值水平，具有显著性差异(p﹤0.01或0.05)。
表7 虫草丹杞胶囊对糖皮质激素致肾阴虚模型小鼠免疫功能及睾酮水平
注：与正常对照组比较：▲P<0.05,▲▲P<0.01；
与模型组比较：*p<0.05,**p<0.01
4.小结
虫草丹杞胶囊可以升高肾阴虚小鼠免疫器官/体重比值及血清睾酮水平，对肾虚有一定的改善作用。
七、对急性肾功能衰竭模型的保护作用
1试验材料
1.1主要试剂 血尿素氮(尿素酶法)，血肌酐(苦味酸法)，尿NAG酶(比色法)测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.2药物：虫草丹杞胶囊，3.5g生药g生药/g，批号：20131225，东莞市亚洲制药有限公司提供。
1.3试验剂量
虫草丹杞胶囊临床每日用量为10.5g生药/d(1.75g生药/0.5g/粒，一次2粒，一天3次)，成人体重以60kg计，平均用药剂量为0.175g生药/kg/d，本试验大鼠低、中、高三个剂量组分别设为0.875、1.75、3.5g生药/kg/d，上述剂量为临床用药剂量的5、10、20倍(按体重计算)。
1.4动物SD大鼠，SPF级，200～260g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2013-0002。
1.5主要器材：代谢笼；低温高速离心机(上海安亭科学仪器厂，型号TGL-16G)；UV-1800紫外-可见光光度计(北京瑞利分析有限公司)。
2方法
取雄性SD大鼠50只，体重220—260，按体重随机分为空白对照组，模型组，虫草丹杞胶囊高、中、低剂量组。实验除空白组外其余各组均腹腔注射庆大霉素100mg/kg，连续10天，空白对照组注射等量生理盐水；各组于注射庆大霉素的第2天开始灌胃给药，空白组和模型组灌等量生理盐水，连续灌胃14天。末次给药后4h，将大鼠置于代谢笼内24h接尿，测尿NAG，按试剂盒说睨操作；眶静脉采分血清，分别测血肌酐(苦味酸法)、尿素氮(二乙酰一肟法)。结果见表8。
3结果：
与正常对照组比较，庆大霉素诱导的急性肾衰竭模型组尿NAG酶，血肌酐、尿素氮含量明显升高，说明急性肾衰模型复制成功。由表8可见，与模型组相比，虫草丹杞胶囊高剂量组能降低尿NAG酶，血肌酐、尿素氮含量(p＜0.05)。提示虫草丹杞胶囊对肾衰竭有一定的改善作用。
表8 虫草丹杞胶囊对庆大霉素所致大鼠急性肾功能衰竭的影响(x±s)
注：与正常对照组比较▲p＜0.05，▲▲p﹤0.01；与模型对照组比较﹡p＜0.05，﹡﹡p﹤0.01
4小结
虫草丹杞胶囊对肾衰竭有一定的改善作用。
八、总结
1、虫草丹杞胶囊小鼠免疫器官/体重比值无明显影响，对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力及DTH有一定的促进作用，但无显著性差异。结果提示虫草丹杞胶囊对细胞免疫功能不明显。
2、虫草丹杞胶囊对小鼠血清溶血素抗体水平具有明显的促进作用。结果提示虫草丹 杞胶囊具有一定增强机体的体液免疫作用。
3、虫草丹杞胶囊对小鼠单核-巨噬细胞的碳廓清能力具有明显的作用。表明虫草丹杞胶囊能增强小鼠单核-巨噬细胞吞噬清除能力。
4、虫草丹杞胶囊能增强小鼠NK细胞杀伤活性。
5、虫草丹杞胶囊可提高体内超氧化物歧化酶的活性，减少丙二醛产生。具有一定的抗氧化作用。
6、虫草丹杞胶囊可以升高肾阴虚小鼠免疫器官/体重比值及血清睾酮水平，对肾虚有一定的改善作用。
7、虫草丹杞胶囊对肾衰竭有一定的改善作用。
本发明经广东药学院药效学研究结果：虫草丹杞胶囊具有一定增强机体的体液免疫作用，能增强小鼠单核-巨噬细胞吞噬清除能力，能增强小鼠NK细胞杀伤活性，表明虫草丹杞胶囊具有增强免疫功能的作用；虫草丹杞胶囊可提高体内超氧化物歧化酶的活性，减少丙二醛产生，表明虫草丹杞胶囊具有一定的抗氧化作用；虫草丹杞胶囊可以升高肾阴虚小鼠免疫器官/体重比值及血清睾酮水平，对肾虚有一定的改善作用；虫草丹杞胶囊高剂量组能降低尿NAG酶，血肌酐、尿素氮含量(p＜0.05)。提示虫草丹杞胶囊对肾衰竭有一定的改善作用。发酵虫草菌粉CS-4(蝙蝠蛾拟青霉)已列入卫生部于2001年3月23日颁布的《卫生部关于印发真菌类和益生菌保健食品审评规定的通知》附件2“可用于保健食品的真菌菌种名单”中，丹参已纳入2002年10月27日《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》附件2“可用于保健食品的物品名单”中，枸杞子已纳入2002年10月27日《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》附件1“既是食品又是药品的物品名单”，三种原料对人体均相当安全。
本发明可用于老年人及免疫力低下人群，为提高免疫力的日常保健，也有助于提高人体的抗氧化能力；同时，对肾虚、肾功能不全的人群也有一定的改善作用。本品可作为提高人体免疫力及抗氧化力的用品，也可作为肾虚、肾功能不全、肾功能衰竭等的辅助治疗用品或日常保健用品。
本发明的组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，如稀释剂与吸收剂：淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂：水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氨化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等；还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中，也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如将本发明的组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂，如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其他材料。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明 保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种保健组合物，其特征在于，所述保健组合物由下列重量份数的原料制成：发酵虫草菌粉(Cs-4)1～5份、丹参1～9份、枸杞子2～18份。
2.根据权利要求1所述的保健组合物，其特征在于，优先的，所述保健组合物由下列重量份数的原料制成：发酵虫草菌粉(Cs-4)1份、丹参1.65份、枸杞子3.53份。
3.一种用于增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能的保健组合物的制备方法，其特征在于，其包括下列步骤：
A、按下列重量份数称取原料：发酵虫草菌粉(Cs-4)1～5份、丹参1～9份、枸杞子2～18份；
B、取发酵虫草菌粉(Cs-4)，备用；
C、取丹参用30～97％的乙醇提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇后药液备用；药渣用水提取1～2次，每次0.5～3小时，滤过，滤液与上述药液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，备用；
D、取枸杞子用水提取1～3次，每次0.5～3小时，滤过，浓缩到至相对密度为1.05～1.5，所述相对密度在60℃测定，加乙醇至含醇量达30～80％，搅拌，静置1～72小时，滤过，取沉淀，干燥，粉碎成细粉，备用；
E、将上述三种细粉混合均匀制成制剂。
4.根据权利要求1所述的保健组合物作为用于增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能的保健食品的用途。
5.根据权利要求4所述的保健组合物作为用于增强免疫力、抗氧化和滋补肾虚、改善肾功能的保健食品的用途，其特征在于，所述保健食品为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、锭剂、合剂、口服溶液剂、散剂、煎膏剂、糖浆剂。
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