CN104262362A

CN104262362A - 一种长春碱的提取及纯化方法

Info

Publication number: CN104262362A
Application number: CN201410439509.6A
Authority: CN
Inventors: 王洪磊; 张永明; 孙中亮
Original assignee: HAINAN XI YUAN CHEMICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HAINAN XI YUAN CHEMICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2014-09-01
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2034-09-01
Also published as: CN104262362B

Abstract

本发明公开了一种长春碱的提取及纯化方法，包括：将长春花进行盐津、冷冻干燥预处理；预处理的原料酸性提取，然后萃取加硫酸得硫酸长春碱粗品；将硫酸长春碱粗品碱化萃取、水洗、上硅胶柱分离、结晶，得长春碱纯品。本发明步骤简洁、耗用时间少，先对长春花进行预处理再进行提取，即可以除掉长春花部分溶于水的色素杂质，又使长春花细胞壁破碎，更利于产品的溶出。通过对提取步骤和条件的选择，提高了粗品的得率和含量，通过对各提取试剂、萃取试剂、洗脱试剂和结晶试剂的选择，提高了长春碱的收率和纯度，通过一次结晶即可得到长春碱纯品，简化了纯化过程，更为快速的实现了长春碱的分离和纯化，且最终得到的产品纯度高，更为满足临床需求。

Description

一种长春碱的提取及纯化方法

技术领域

本发明涉及一种从长春花中提取并分离纯化长春碱的方法，属于药物提取技术领域。

背景技术

长春花是夹竹桃科长春花属一种重要的药用植物，原产南亚、非洲东部及美洲热带。长春花全草入药可止痛、消炎、安眠、通便及利尿，全株具有毒性，误食后会造成白血球减少、血小板减少、肌肉无力、四肢麻痹等症状。长春花中含有几十种吲哚类生物碱，长春碱是其中的一种，具有抗癌的作用，为临床上广泛应用的抗肿瘤药物，具有很高的药用价值，国内外对其提取分离的研究由来已久。但是由于长春花中含有几十种生物碱，长春碱含量很低，仅为万分之几，提取并初步成盐后的硫酸长春碱粗品含量仅60%左右，无法满足使用要求，需要对其进一步纯化。

目前报道的长春碱的提取方法有溶剂提取法、超临界萃取法、超声波提取法等，分离方法有TLC法、柱色谱法、高效逆流色谱法等。这些方法各有自己的优势和缺点，如果能对这些方法进行改进和结合，提高长春碱的提取率和纯度，将会更有利于其工业化应用。

发明内容

本发明提供了一种长春碱的提取及纯化方法，该方法对长春碱的提取和分离纯化方法都进行了改进，所得长春碱提取率高、纯度高。

本发明具体技术方案如下：

一种长春碱的提取及纯化方法，包括以下步骤：

（1）取长春花，用15-25wt%的氯化钠水溶液超声浸泡15min，然后取出直接放入流速为5-8m/s的-20℃的冷空气中冷冻干燥20min，冷冻干燥后将长春花粉碎。

（2）将步骤（1）的长春花加入30体积%乙醇中，用柠檬酸调节pH为1.5，回流提取，过滤取滤液，将滤液用氢氧化钠调整pH为8-9，然后以喷雾的形式从萃取罐顶部喷入，同时将萃取剂以喷雾的形式从萃取罐的底部喷入，喷入完毕萃取收集有机相；所述萃取剂为体积比为10:1-2.5的三氯乙烯和己烷的混合物；

（3）有机相减压除去溶剂，固体用乙醇完全溶解，加浓度5wt%的硫酸的乙醇溶液调节pH为3.8，离心、干燥得硫酸长春碱粗品；

（4）将硫酸长春碱粗品用水溶解，加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8-9，加入二氯甲烷萃取，二氯甲烷有机相用水洗涤直至洗涤后的水相透明无色，收集水洗后的有机相，减压蒸馏除去二氯甲烷，所得剩余物上硅胶柱，用体积比为90：10～98：2的二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液的混合物作为流动相进行洗脱，收集无色流份，将流份减压蒸馏至干，所得固体加入体积比为9：0.3-0.8：1-3的甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，然后在-10℃低温静置24h，所得晶体在-10℃低温抽滤，-10℃冻干，得长春碱纯品。

上述步骤（1）中，长春花与氯化钠水溶液的质量比为1：9-10。

上述步骤（1）中，氯化钠溶液的浓度优选为20wt%。

上述步骤（2）中，长春花与30体积%乙醇的质量比为1:4-6，回流提取的时间为2-3h。

上述步骤（2）中，滤液与萃取剂的体积比为3.5:1～6:1，优选4.7:1。

上述步骤（2）中，滤液喷入萃取罐的速度为188-240ml/s，滤液和萃取剂同一时间喷完。

上述步骤（2）中，三氯乙烯和己烷的体积比优选为10:1.75。

上述步骤（3）中，固体与乙醇的质量比优选为1:0.8。

上述步骤（4）中，对二氯甲烷有机相进行水洗时，水洗用水与二氯甲烷有机相的质量比为1:1-2。

上述步骤（4）中，所述甲醇氨饱和溶液是向甲醇中通入氨气直至有氨气溢出所形成的氨气饱和的甲醇溶液。

上述步骤（4）中，硅胶的目数为200-300目，剩余物与硅胶的质量比为1:10-20，优选1:15，洗脱温度为16-25℃，流动相流速为3-5ml/min。

上述步骤（4）中，流份减压蒸馏所得的固体质量与甲醇、石油醚、乙酸乙酯总体积的比值为1g：3.5-8ml，优选1g：5ml。

上述步骤（4）中，二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液的体积比优选为97：3。

上述步骤（4）中，甲醇、石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为9:0.5:1.7。

本发明以长春花为起始原料，先通过提取并初步成盐后得到硫酸长春碱粗品，再通过纯化得到纯度高的长春碱产品。本发明方法中，在起始阶段，先通过盐浸-冷冻干燥对长春花进行预处理，不仅可以除掉长春花部分溶于水的色素杂质，而且可以使长春花细胞壁破碎，更利于下步产品的溶出。然后在酸性条件下乙醇提取、碱性条件下萃取，萃取剂和乙醇提取液以喷雾的形式接触,大大提高了萃取效率，并且通过对萃取剂的调配，提高了长春碱的含量及得率。采用本发明提取方法所得粗品中长春碱的含量可达80%以上。所得粗品采用碱化萃取、水洗+硅胶柱分离+结晶的方式进行纯化。碱化萃取水洗后，可以除掉粗品中水溶性的多糖及色素等组分，更有利于产品下步的纯化。柱分离阶段采用二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液的混合物作为流动相，流动性的选择使分离效果更明显，有效成分得到很好的纯化，收率也得到提高。最后将产品放入甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中进行结晶，结晶前先进行超声处理，以使晶粒形貌更为均匀，一次结晶后所得长春碱产品纯度和收率均较高，无需多次重复结晶，大大减少了产品的损失。

本发明步骤简洁、耗用时间少，先对长春花进行预处理再进行提取，不仅可以除掉长春花部分溶于水的色素杂质，而且可以使长春花细胞壁破碎，更利于下步产品的溶出。通过对提取步骤和条件的选择，提高了硫酸长春碱粗品的得率和含量，通过对各提取试剂、萃取试剂、洗脱试剂和结晶试剂的选择，提高了长春碱的收率和纯度，通过一次结晶即可得到长春碱纯品，简化了纯化过程，更为快速的实现了长春碱的分离和纯化，且最终得到的产品纯度高，更为满足临床需求。

附图说明

图1为所得产品的高效液相色谱图。

图2为本发明提取所得长春碱的核磁谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中，长春碱的含量测定方法为：高效液相色谱法，高效液相色谱的条件如下：

色谱柱：Phenomenex PRODIGY ODS3-C18柱(250.0mm×4.6mm,5μm)；

流动相：体积比68:6.4:25.6的磷酸缓冲盐—甲醇—乙腈为流动相；磷酸缓冲盐配制方法是：取6.8g磷酸二氢钾与10ml的三乙胺，混合后加水补至1000ml，然后用磷酸调至pH4.2，制得。

柱温：30℃；

波长：262nm；

流速：1.5ml/min。

下述实施例中，得率的计算方法为：得率=所得硫酸长春碱粗品或长春碱纯品的质量/长春花的总质量。

下述实施例中，乙醇的浓度均为体积浓度，其他试剂的浓度均为质量浓度。

实施例1

以长春花（鲜）为原料，按照下述方法提取分离硫酸长春碱：

1、提取硫酸长春碱粗品：

（1）取100kg长春花，加入900kg20%的氯化钠水溶液中，超声浸泡15min，然后将长春花取出直接放入流速为6m/s的-20℃的冷空气中冷冻干燥20min，冷冻干燥后将长春花粉碎。

（2）将步骤（1）处理后的长春花加入500kg30%的乙醇中，用柠檬酸调节pH为1.5，回流提取2h，过滤取滤液，滤液用氢氧化钠调整pH为8-9，调整好pH后，将滤液加高压，以喷雾的形式从萃取罐顶部喷入，速度为200 ml/s，同时将萃取剂也加高压，以喷雾的形式从萃取罐的底部喷入，滤液与萃取剂的体积比为4.7：1，滤液和萃取剂同时喷入萃取罐，同时喷完，喷入完毕萃取收集有机相；所述萃取剂为体积比为10:1.75的三氯乙烯和己烷的混合物。

（3）将有机相减压蒸馏，所得剩余物约200g，将剩余物加入乙醇200ml溶解，然后加入浓度为5%的硫酸的乙醇溶液调节pH为3.8，有浆状物沉淀出现，离心、干燥得硫酸长春碱粗品11.2g，经计算，硫酸长春碱的得率为0.112‰，经HPLC检测，粗品中硫酸长春碱含量为84.3%。

2、分离纯化硫酸长春碱：

将上述11.2g硫酸长春碱粗品用50ml水溶解，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8-9，加入150ml二氯甲烷萃取，得有机相，所得有机相加入100ml高纯水洗涤，直至洗涤后的水相透明无色，取水洗后的有机相，将其减压蒸馏除去溶剂，所得产物10g，将该产物上200-300目的硅胶柱，产物与硅胶的质量比为1:15，用体积比为97:3的二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液（甲醇氨饱和溶液是向甲醇中通入氨气直至有氨气溢出所形成的氨气饱和的甲醇溶液）的混合溶剂作为流动相进行洗脱，洗脱温度为18-20℃，流动相流速为3-5ml/min。收集无色流份，减压蒸馏得7.8g固体。将所得固体加入39ml体积比为9：0.5：1.7的甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，然后在-10℃下低温静置24h后，在-10℃下低温抽滤，-10℃冻干得长春碱6.3g。

图1为所得产品的高效液相色谱图，其图谱分析结果如下表，从表中可以看出，本发明所得长春碱纯品中，长春碱纯度为99.8%。

图2为所得产品的核磁图谱，从图中可以看出，所得产品为长春碱。

实施例2

按照实施例1的方法提取硫酸长春碱粗品，不同的是：步骤（1）中，氯化钠水溶液的浓度为15%，冷空气流速为5m/s，最终所得硫酸长春碱粗品10.5g，得率为0.105‰，粗品中硫酸长春碱含量为81.5%。

实施例3

按照实施例1的方法提取硫酸长春碱粗品，不同的是：步骤（1）中，氯化钠水溶液的浓度为25%，冷空气流速为8m/s，最终所得硫酸长春碱粗品9.2g，得率为0.092‰，粗品中硫酸长春碱含量为84.6%。

实施例4

按照实施例1的方法提取硫酸长春碱粗品，不同的是：步骤（2）中，滤液的喷入速度为240ml/s，最终所得硫酸长春碱粗品10.5g，得率为0.105‰，粗品中硫酸长春碱含量为82.3%。

实施例5

按照实施例1的方法提取硫酸长春碱粗品，不同的是：步骤（2）中，萃取剂为体积比为10:1的三氯乙烯和己烷的混合物，滤液与萃取剂的体积比为3.5：1，最终所得硫酸长春碱粗品11.5g，得率为0.115‰，粗品中硫酸长春碱含量为75.2%。

实施例6

按照实施例1的方法提取硫酸长春碱粗品，不同的是：步骤（2）中，萃取剂为体积比为10:2.5的三氯乙烯和己烷的混合物，滤液与萃取剂的体积比为6：1，最终所得硫酸长春碱粗品10.1g，得率为0.101‰，粗品中硫酸长春碱含量为78.5%。

实施例7

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：硫酸长春碱粗品质量与二氯甲烷体积的比值为1g：3ml，最终所得硫酸长春碱纯品6.0g。经HPLC检测，硫酸长春碱纯度为99.5%。

实施例8

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：硫酸长春碱粗品质量与二氯甲烷体积的比值为1g：6ml，最终所得硫酸长春碱纯品6.3g。经HPLC检测，硫酸长春碱纯度为99.6%。

实施例9

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：剩余物与硅胶的质量比为1: 20，最终所得长春碱纯品5.3g。经HPLC检测，长春碱纯度为99.8%。

实施例10

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：剩余物与硅胶的质量比为1: 10，最终所得长春碱纯品6.2g。经HPLC检测，长春碱纯度为98.2%。

实施例11

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：流动相为体积比为90:10的二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液，最终所得长春碱纯品5.6g。经HPLC检测长春碱纯度为97.1%。

实施例12

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：流动相为体积比为85:15的二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液，最终所得长春碱纯品4.3g。经HPLC检测，长春碱纯度为95.3%。

实施例13

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：甲醇、石油醚和乙酸乙酯的体积比为9：0.3：3，流份减压蒸馏所得的固体质量与甲醇、石油醚、乙酸乙酯总体积的比值为1g：3.5ml，最终所得长春碱纯品5.8g。经HPLC检测，长春碱纯度为97.5%。

实施例14

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：甲醇、石油醚和乙酸乙酯的体积比为9：0.8：1，流份减压蒸馏所得的固体质量与甲醇、石油醚、乙酸乙酯总体积的比值为1g：8ml，最终所得长春碱5.2g。经HPLC检测，长春碱纯度为98.4%。

对比例1

（2）将步骤（1）处理后的长春花加入水中，用柠檬酸调节pH为1.5，浸泡3h，然后用氨水调解pH为8-9，按照长春花：三氯甲烷1g：4ml的比例加入三氯甲烷萃取，收集有机相，有机相减压蒸馏，所得剩余物用其质量0.8倍的乙醇溶解，加入浓度为5%的硫酸乙醇溶液，调节pH为3.8，有浆状物沉淀出现，离心、干燥得硫酸长春碱粗品11.6g，经计算，硫酸长春碱的得率为0.116‰，经HPLC检测，粗品中硫酸长春碱含量为62.7%。

对比例2

按照实施例1的方法分离纯化长春碱，不同的是：洗脱硅胶柱的流动相为体积比97:3的二氯甲烷和甲醇，最终所得长春碱纯品4.6g，纯度为98.2%。

对比例3

按照实施例1的方法分离纯化长春碱，不同的是：二氯甲烷萃取所得的产物不过硅胶柱，直接加入39mL甲醇中-10℃重结晶2次，过滤、冻干得长春碱纯品3.9g，纯度为97.6%。

对比例4

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：硫酸长春碱粗品不作碱化萃取及水洗处理，直接上硅胶柱。最终所得长春碱纯品4.1g。经HPLC检测，长春碱纯度为98.5%。

对比例5

按照实施例1的方法分离纯化硫酸长春碱，不同的是：硫酸长春碱粗品用饱和碳酸氢钠溶液碱化、加入150ml二氯甲烷萃取后所得的有机相直接减压蒸馏后上硅胶柱，不进行水洗。最终所得长春碱纯品5.6g。经HPLC检测，长春碱纯度为99.6%。

Claims

1.一种长春碱的提取及纯化方法，其特征是包括以下步骤：

（1）取长春花，用15-25wt%的氯化钠水溶液超声浸泡15min，然后取出直接放入流速为5-8m/s的-20℃的冷空气中冷冻干燥20min，冷冻干燥后将长春花粉碎；

2.根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（1）中，长春花与氯化钠水溶液的质量比为1：9-10。

3.根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（2）中，长春花与30体积%乙醇的质量比为1:4-6，回流提取的时间为2-3h。

4. 根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（2）中，滤液与萃取剂的体积比为3.5:1～6:1，优选4.7:1；滤液喷入萃取罐的速度为188-240ml/s，滤液和萃取剂同一时间喷完。

5.根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（4）中，流份减压蒸馏所得的固体质量与甲醇、石油醚、乙酸乙酯总体积的比值为1g：3.5-8ml，优选1g：5ml。

6.根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（4）中，硅胶的目数为200-300目，剩余物与硅胶的质量比为1:10-20，优选1:15，洗脱温度为16-25℃，流动相流速为3-5ml/min。

7.根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（4）中，对二氯甲烷有机相进行水洗时，水洗用水与二氯甲烷有机相的质量比为1:1-2。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（1）中，氯化钠溶液的浓度为20wt%；步骤（2）中，三氯乙烯和己烷的体积比为10:1.75；步骤（3）中，固体与乙醇的质量比为1:0.8；步骤（4）中，二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液的体积比为97：3；步骤（4）中，甲醇、石油醚和乙酸乙酯的体积比为9:0.5:1.7。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的提取及纯化方法，其特征是：所述甲醇氨饱和溶液是向甲醇中通入氨气直至有氨气溢出所形成的氨气饱和的甲醇溶液。