CN104257670B - 多西环素的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了多西环素在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。细胞水平的药效学实验数据表明多西环素对小鼠成纤维细胞NIH‑3T3的IC₅₀为11.84μM，随着多西环素浓度的增大，对小鼠成纤维细胞NIH‑3T3生长的抑制作用逐渐增强，可以很好地抑制肝脏内成纤维细胞的增殖。动物水平的药效学实验表明，本发明提供的多西环素可以逆转及抑制机体的肝纤维化水平、抑制肝脏内成纤维细胞过度增生、改善肝脏供血和促进肝细胞的再生和抑制肝脏的炎症反应，对肝纤维化有很好的治疗效果。

Description

多西环素的应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体而言，涉及多西环素的应用。

背景技术

多西环素“Doxycycline”(别名脱氧土霉素，也称为强力霉素)，属于四环素类抗生素，是众所周知且应用广泛的抗生素。四环素类药物主要作用于细菌核蛋白体30S亚基，干扰氨基酸tRNA与30S亚基上的作用位点结合，阻断氨基酰tRNA与核糖体-mRNA复合体结合，抑制蛋白质合成，同时也可以改变细胞膜的通透性，使胞内重要物质核苷酸等外露，抑制DNA合成，从而达到抑菌的作用。多西环素是四环素类药物中药效较强且应用较广的一种类型(Adimora AA.,2002；Kovacova E,et al.,2002)。多西环素目前在临床上主要用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、胆道感染、淋巴结炎、尿路感染，老年慢性支气管炎、急慢性气管炎、肺炎、支气管炎、蜂窝组织炎，也用于治疗斑疹伤寒、羌虫病、支原体肺炎等症状。

肝纤维化在临床上表现为乏力、食欲减退、肝肿大、黄疸，严重的肝纤维化可导致肝硬化、肝衰竭，最终导致死亡。肝纤维化的特征是肝小叶内出现桥接坏死甚至多小叶坏死，肝小叶内成纤维细胞增生，取代了坏死肝细胞的位置，肝细胞受到有害物质刺激引起肝细胞死亡，处于肝血窦的毛细血管壁周围的成纤维细胞就会逐渐的迁移到坏死肝细胞坏死造成空缺的位置，当大量没有肝脏解毒功能的纤维细胞代替坏死的肝细胞原来的位置，填补因为肝细胞坏死造成的肝部空缺，就会造成肝肺纤维化。纤维细胞不能代替肝细胞进行解毒等功能，造成有害物质在肝部不能及时代谢，进而会对肝细胞造成损伤，形成一个恶性循环。

到目前为止，多西环素在肝纤维化中的应用尚无明确报道。由肝纤维化导致的肝病是高发性疾病，由于肝纤维化是由持续性的肝损伤导致的，因此一旦发生肝纤维化，难以治愈，则会对人类健康造成的很大的危害。

肝纤维化病理机制的研究表明，细胞因子在肝纤维化形成中起重要作用，细胞因子通过与其靶细胞相应受体的相互作用启动肝纤维化信号转导通路，调控肝纤维化相关的基因表达。与肝纤维化有关的细胞因子有转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGF-1)、白细胞介素(interleukin，IL)、结缔组织生长因子(connective tissue growthfactor，CTGF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等。由于肝纤维化的特征是肝小叶内出现桥接坏死甚至多小叶坏死，肝小叶内成纤维细胞增生，取代了坏死肝细胞的位置，因此抑制成纤维细胞生长是研制抗纤维化药物的重要环节。

慢性肝炎患者(包括乙、丙、丁型)几乎都有肝纤维化现象，而纤维化是造成肝功能异常和影响肝病预后的重要因素，也是慢性肝炎发展至肝硬化和门脉高压的必经阶段。如果能阻止或逆转肝纤维化，则会使大多数慢性肝炎得到控制，从而能预防和减少肝硬化的发生。肝纤维化的治疗目前并没有特效药物。临床上主要采用抗炎药、抗纤维化药物、抗病毒药物、肝移植等措施进行治疗，常用的药物包括秋水仙碱、汉防己甲素、复方丹参制剂、干扰素、核苷类药物等。目前我国已有拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替比夫定(LdT)这4种核苷类药物被批准用于抗乙肝病毒的治疗。但是，核苷类药物以及其他用于治疗肝纤维化的药只有长期治疗才可能实现持久应答,并且容易出现耐药性。临床上有些用于治疗肝纤维化的药物的药效还存在不同程度上的争议。肝纤维化疾病维护严重、病死率高、临床治疗措施匮乏，因此在深入了解其发病机制的基础上开发新型的治疗肝纤维化的药物迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术中治疗肝纤维化药物的抑制肝纤维化活性较低的缺陷，本发明的目的在于提供一种多西环素在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。

为了达成上述目的，本发明提供了多西环素在制备治疗肝纤维化的药物中的应用，其中，所述多西环素的分子结构式为：

在上述应用中，所述治疗肝纤维化的药物中的应用包括：所述多西环素在制备抑制肝脏内成纤维细胞的过度增殖和迁移、逆转及抑制机体的肝纤维化水平、改善肝脏供血和促进肝细胞的再生以及抑制肝脏的炎症反应的药物中的应用。

在上述应用中，所述治疗肝纤维化的药物包含多西环素、多西环素在药学上可接受的盐、酯或它们的组合以及辅料。

在上述应用中，所述治疗肝纤维化的药物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、糖浆剂、酒剂、酊剂、露剂、膜剂或它们的组合。

在上述应用中，所述治疗肝纤维化的药物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。

本发明提供的治疗肝纤维化的药物的优势在于：该药物患者不仅容易接受，且毒副作用小、价格低廉、来源广泛、容易获取，还便于了解患者对药物的反应。此外，多西环素将改变已有治疗肝纤维化的药物的市场格局，成为一种可长期服用，且有效抑制肝纤维化、改善肝功能状况的临床药物。

本发明所使用的多西环素为多西环素盐酸盐，黄色粉末，由开封制药(集团)有限公司提供，批号：201301011，纯度：91.0％(符合中国药典2010年版二部)。多西环素盐酸盐的化学结构式为：

附图说明

图1是正常小鼠肝组织切片图；

图2是小鼠肝纤维化建模第三周小鼠肝组织切片效果图；

图3A是多西环素给药后第二周小鼠肝组织外部形态图；

图3B是多西环素给药后第二周小鼠肝组织外部形态立体显微镜下效果图；

图3C是多西环素给药后第二周小鼠肝组织切片效果图；

图4A是多西环素给药后第三周小鼠肝组织外部形态图；

图4B是多西环素给药后第三周小鼠肝组织外部形态立体显微镜下效果图；

图4C是多西环素给药后第三周小鼠组织切片效果图；

图5是多西环素对小鼠成纤维细胞NIH-3T3增殖的抑制作用图；以及

图6是多西环素对小鼠成纤维细胞NIH-3T3迁移的抑制作用图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用的试验材料及其来源包括：

(1)小鼠

昆明小鼠(雄性)：由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心和北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

动物到达后，由专人接收动物于双走廊屏障环境小鼠饲养室2内，填写《试验动物接收记录表》(BG-017-V00)，接收时对动物大体情况进行观察，并随机抽取动物进行称重，确保试验动物与引进标准基本吻合。实验动物使用许可证号：SYXK(津)2012-0003。

(2)供试品

盐酸多西环素：黄色粉末，由开封制药(集团)有限公司提供，批号：201301011，纯度：91.0％(符合中国药典2010年版二部)。

四氯化碳：无色液体，购自北京百灵威科技有限公司，生产厂家：百灵威科技有限公司,品牌：Amethyst，CAS:56-23-5，货号199398，MDL：

MFCD00000785，纯度：99.5％。

食用油品牌：金龙鱼。

四甲基偶氮唑盐(MTT)：上海生工生物工程有限公司，货号：TB0799-1g，批号：XP1008B3012J，级别：分析纯，规格1g。

二甲基亚砜(DMSO)细胞培养级：购自北京索莱宝科技有限公司，货号：D8370-500，批号：2P005970，级别：细胞培养级，规格500mL，用于细胞冻存，及药物配制。

二甲基亚砜(DMSO)：购自上海生工生物工程有限公司，货号：DN3039A，批号：SJ0731S4013J，级别：分析纯，规格500mL，用于MTT法溶解紫色结晶。

RPMI 1640培养基：购自赛默飞世尔科技有限公司，Hyclone品牌，货号：SH30809.01B，批号：NYG0920，规格：500mL。

胰蛋白酶：购自上海生工生物工程有限公司，货号：T0458-10，批号：0301C314，级别：USP，规格：10g。

供试品保存：4℃

(3)细胞系：NIH-3T3(小鼠胚胎成纤维细胞系)：购自南京凯基生物科技发展有限公司；

(4)仪器耗材

生物安全柜：西班牙泰事达(Telstar)，型号：Bio II A。

CO₂培养箱：施都凯仪器设备(上海)有限公司，型号：STIK IL-161HI。

倒置相差显微镜：厂家：奥林巴斯，型号：CKX41。

倒置荧光显微镜：尼康，型号：Nikon ECLIPSE Ti。

96孔板：购自赛默飞世尔科技有限公司，Thermo Nunc品牌，货号167008。

24细胞培养板：生产厂家美国康宁公司Corning-Costar品牌，货号：3524，批号：34312004。

(5)所用药物及试剂的配制方法包括：

a)盐酸多西环素溶液的配制：称取盐酸多西环素0.12g，溶于10mL的PBS溶液中，配制成12mg/mL溶液，待其充分溶解后，用0.22μm滤器过滤除菌后使用，每次使用时现用现配。溶液的配制及使用均应在无菌生物安全柜中操作。

b)10％福尔马林固定液的配置：将100ml的福尔马林与900ml的纯净水混匀。

c)CCL₄-食用油混合液的配置：将40ml的CCl₄加入到60ml的食用油中，搅拌均匀后，用0.22μm的滤膜抽滤，溶液的配置及抽滤均应在无菌生物安全柜中操作。

d)0.9％生理盐水溶液的配置：将0.9g的NaCl溶解到100mL无菌水中，用0.22μm的滤膜抽滤，溶液的配置及抽滤均应在无菌生物安全柜中操作。

e)MTT储液的配制：将1g MTT溶于200mL PBS溶液中(浓度：5mg/mL)，将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤除菌后，分装，避光保存于-20℃冰箱中。溶液的配制及使用均应在无菌生物安全柜中操作。

实施例1小鼠肝纤维化模型的建立多西环素药效学检测

1.小鼠肝纤维化模型的建立及给药治疗

1.1小鼠肝纤维化模型的建立

将36只小鼠随机分为三组：正常组、模型组(不给药，即，对照组)、多西环素组，每组12只。正常组每只每次背部皮下注射0.15ml的生理盐水；模型组(建模不给药组)以及多西环素组(建模给药多西环素组)每只每次背部皮下注射0.15ml的含40％的CCl₄的CCl₄-食用油混悬液；每周注射两次。

1.2肝纤维化小鼠的给药治疗

在建模后第三周，给予小鼠药物治疗，正常组以及模型组每次用0.1mL的0.9％的生理盐水灌胃，多西环素组每次用0.1mL的盐酸多西环素溶液灌胃。每2天一次。

1.3小鼠肝纤维化的病理检测

在建模的第三周、给药后第二周、给药后第三周，分别从正常组、模型组、多西环素组每组取四只小鼠，断颈处死，取其肝，经10％福尔马林固定两天后，用流水冲洗掉肝组织表面的固定液，用病理组织脱水机对小鼠肝组织进行脱水处理，经石蜡进行包埋，对包埋组织进行切片，经H.E染色，盖片，在显微镜下观察肝组织的变化。

2.实验结果

2.1建模评价

参考图1和图2，其中，图1是正常小鼠肝组织切片图；图2是小鼠肝纤维化建模第三周小鼠肝组织切片效果图。如图1及图2所示，显微镜下观察建模第三周后的肝组织切片，通过观察发现：与健康正常小鼠相比，注射CCl₄-食用油混悬液后，小鼠的肝明显受到损伤，纤维组织增生严重，出现明显的肝纤维化的症状。

2.2多西环素组药效学评价

参考图3A，3B，3C，其中，图3A是多西环素给药后第二周小鼠肝组织外部形态图；图3B是多西环素给药后第二周小鼠肝组织外部形态立体显微镜下效果图；图3C是多西环素给药后第二周小鼠肝组织切片效果图。如图3A，3B，3C所示：建模后与正常组相比，肝纤维化模型组的肝体积明显变大，肝色苍白，表面有明显的颗粒状假小叶的突起；肝小叶结构已经明显破坏，明显出现肝假小叶。建模后给药多西环素两周后，与肝纤维化模型不给药组相比，给药多西环素组的肝纤维化程度明显改善，肝细胞损伤程度明显比不给药组小，肝细胞坏死组织减少，炎性症状明显减轻，肝细胞纤维化现象明显改善。肝小叶结构从表面已经看不出有损伤，肝表面无突起，形态与正常组相当，同时肝脏供血更加丰富，肝脏更加红润。从图3A及图3B中还可以看出，与肝纤维化模型不给药组相比，给药多西环素组，小鼠的肝脏更加红润，肝脏表面更加平滑，表明给药组小鼠肝脏的供血更加丰富。从图3C中可以看出，与肝纤维化模型不给药组相比，给药多西环素组的肝脏切片，肝脏坏死区域减少，肝脏纤维化水平明显减弱，肝脏纤维组织减少，正常肝组织再生，因此，多西环素还能够改善肝脏供血和促进肝细胞的再生。同时从图3C中可以看出建模不给药肝脏组织坏死区域中有明显的炎细胞浸润，给药多西环素组肝脏组织并未看到炎细胞浸润，表明多西环素可以抑制肝脏的炎症反应。

接下来，参考4A，4B，4C，图4A是多西环素给药后第三周小鼠肝组织外部形态图；图4B是多西环素给药后第三周小鼠肝组织外部形态立体显微镜下效果图；图4C是多西环素给药后第三周小鼠组织切片效果图。如图4A，4B，4C所示：建模后给药多西环素第三周，与肝纤维化模型不给药组相比，给药多西环素组无纤维化现象，仅有少数几个肝细胞仍处于损伤状态，肝表面平滑，与正常组相当。因此，多西环素能够逆转及抑制机体的肝纤维化水平。

实施例2多西环素对小鼠成纤维细胞NIH-3T3体外作用的研究

1)MTT法检测多西环素对小鼠成纤维细胞NIH-3T3生长的抑制作用

实验方法为MTT比色法：检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲瓒结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

方法步骤：

(1)细胞复苏及培养

将冻存的小鼠成纤维细胞NIH-3T3细胞从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中使细胞融化。生物安全柜中将细胞悬液吸到装有适量培养基的离心管中，800rpm/min离心5分钟；弃上清液，用1mL培养基悬浮细胞，吸到装有适量培养基的细胞培养皿中，将细胞置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下培养。待细胞达到80％-90％接触汇合时进行传代，0.2％胰酶消化成单细胞悬液，800rpm/min离心5分钟；弃上清，加1-2mL培养基悬浮细胞，将细胞传到2-3个装有适量培养基的培养皿中，继续培养。

(2)MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用

将处于对数生长期的贴壁细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应细胞培养基中。将细胞接种于96孔培养板上，每孔100μL细胞悬液，3000个细胞/孔。将上述96孔培养板置于37℃，二氧化碳(5％)培养箱中过夜培养24小时，使细胞贴壁。

待24小时后细胞完全贴壁后，弃去培养液，试验组加入含有不同浓度多西环素的细胞培养液，并设置不加药物只加相应药物溶剂的对照孔(多西环素溶剂为PBS)，同时设置只加培养基不含细胞的调零孔。每组设6个平行孔，然后将板子置于37℃，二氧化碳(5％)培养箱中培养48小时。

48小时后，每孔加入20μL MTT(浓度为5mg/mL)，继续孵育4h。然后将培养液轻轻吸出，每孔加入150μL DMSO作溶剂溶解，溶解后用酶标仪测定570nm处的吸光度(实验方法参考：魏伟，吴希美等，《药理实验方法学》，第四版，北京：人民卫生出版社，2010：1568-1569)。

(3)数据分析

计算细胞的存活率和抑制率，并计算药物对细胞的半数抑制浓度IC₅₀。存活率％＝(实验组OD值-调零孔OD值)/(阴性对照组OD值-调零孔OD值)×100％；抑制率％＝(1-存活率)×100％。用Graphpad Prism 5软件进行IC₅₀值的计算。

用Excel软件绘制药物对细胞的剂量-响应曲线，各指标均用均值±标准差来表示。

实验结果：

参考图5，图5是多西环素对小鼠成纤维细胞NIH-3T3增殖的抑制作用图。如图5所示，IC₅₀为11.84μM，并且多西环素对小鼠成纤维细胞NIH-3T3细胞的生长在低剂量时即呈现明显的抑制作用，随着多西环素浓度的增大，对小鼠成纤维细胞NIH-3T3细胞的抑制作用逐渐增强，呈现明显的剂量依赖性。由此可知，多西环素具有抑制小鼠成纤维细胞增殖的作用。

2)多西环素对NIH-3T3细胞迁移的影响

(1)实验方法：

细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应培养基中。将细胞接种于96孔培养板上，4000cells/孔。置于37℃二氧化碳(5％)培养箱中过夜培养，使细胞贴壁。第二天，弃去培养液，加入含一系列浓度受试物(多西环素)的培养液。第二天，吸弃培养液，PBS洗细胞两次，加入Hochest 33342(溶解在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，终浓度为5μg/mL)染色液50μL/孔，37℃二氧化碳(5％)培养箱中孵育20min。吸弃染色液，PBS洗两次，加入含有一定浓度待测药物的培养液。然后放在高内涵分析平台ArrayScanVTI(Thermo公司生产)上进行实时动态监测，测试药物对细胞迁移的影响。

药物对细胞的影响，可以通过高内涵分析平台自带的软件进行分析。药物对细胞迁移速率的影响主要通过得到的平均距离-时间图中的曲线的斜率来显示。斜率越大，细胞的迁移速率越快，斜率越小，表明细胞的迁移速率越慢。

(2)实验结果多西环素对NIH-3T3细胞迁移的抑制

多西环素对NIH-3T3细胞迁移的抑制作用如图6所示，图6是多西环素对小鼠成纤维细胞NIH-3T3迁移的抑制作用图。图中D7是对照组，D8，D9是加药组，D8组药物浓度为20μM，D9组药物浓度为4μM。从图中可以看出，加药组细胞的运动曲线的斜率明显小于对照组的斜率。证明多西环素对NIH-3T3细胞的迁移有明显的抑制作用。

以上实施例表明多西环素对肝纤维化有很好的治疗效果，可以抑制肝脏内成纤维细胞的过度增殖和迁移、逆转及抑制机体的肝纤维化水平、抑制肝脏内成纤维细胞过度增生、改善肝脏供血和促进肝细胞的再生。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.多西环素在制备治疗肝纤维化的药物中的应用，其中，所述多西环素的分子结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：所述多西环素在制备抑制肝脏内成纤维细胞的过度增殖和迁移、逆转及抑制机体的肝纤维化水平、改善肝脏供血和促进肝细胞的再生以及抑制肝脏的炎症反应的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗肝纤维化的药物包含多西环素、多西环素在药学上可接受的盐、酯或它们的组合以及辅料。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述治疗肝纤维化的药物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、酊剂、露剂、膜剂或它们的组合。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口服液体制剂选自糖浆剂或酒剂。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述治疗肝纤维化的药物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。