CN117100757B - 一种伴有肝脏萎缩的腹膜纤维化动物模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种腹膜纤维化动物模型的构建方法，所述构建方法为将小鼠腹腔注射20‑50mg/kg的强力霉素，每周注射2‑4次，连续注射2‑4周。本发明构建的腹膜纤维化小鼠模型病理结果符合腹膜纤维化临床病理表现，整个造模周期只需要2周，相比于传统的造模方法周期更短，且诱导频率更低，易于操作，重复性好，对于腹膜纤维化药物评价和了解发病机制有积极作用。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型领域，具体涉及一种伴有肝脏萎缩的腹膜纤维化动物模型构建方法。
背景技术
脊椎动物的腹膜主要由间皮细胞构成，由结缔组织的支持所形成的一层膜状组织。腹膜包覆大部分腹腔内的器官，能分泌黏液润湿脏器的表面，减轻脏器间的摩擦。腹膜透析是终末期肾脏病患者的常用治疗手段之一。但是临床发现长期腹膜透析会影响间皮细胞的功能和增殖并且促进腹膜纤维化（Peritoneal fibrosis），导致腹膜超滤衰竭，迫使病人最终退出透析治疗。
腹膜纤维化的发生机制与肾素-血管紧张素-醛固酮系统、TGF-β1因子、GSK-3β因子，VEGF及CTGF异常表达和基因调控等有着密切关系，抗纤维化药物的研发是解决这一临床难点的关键。除此以外，临床CT诊断中也发现腹膜纤维化还会累及多种脏器（如肝、肾、胆囊等）。因此亟需解决腹膜纤维化的产生，保证肾病病人的治疗和生命的存续。
腹膜的范围主要可以分为壁腹膜和脏腹膜两部分。壁腹膜贴附于腹壁、横膈脏面和盆壁的内面；脏腹膜覆盖于内脏表面，成为它们的浆膜层。肝脏表面的包膜属于腹膜的一部分，是肝脏一种重要的解剖结构，目前用于肝脏包膜的动物模型鲜有研究。
目前构建腹膜纤维化动物模型的方法通常是在大鼠腹腔中注入致病菌、氯己定或聚维酮碘等方式促进腹膜炎，最终导致腹膜纤维化。但是上述药物造模方法的造模周期通常是3-5周，整个造模周期较长。另外，使用低pH值的腹膜透析液连续灌注4-5周，也可以模拟临床上长期透析导致的腹膜纤维化。但是这种造模方式的模型病死率较高。因此临床上仍需要研发一种操作方便、造模周期短、重复性好、造模成功率高的腹膜纤维化动物模型构建方法。
强力霉素（Doxycycline）是一种四环素类似物的抗生素，在临床上多用于细菌性感染的治疗。在基因编辑动物中，强力霉素是一种常用的调节基因表达开关的药物。
目前暂未见伴有肝脏萎缩的腹膜纤维化动物模型构建方法的相关报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明包括以下几个方面：
本发明的第一方面提供一种腹膜纤维化动物模型的构建方法，所述构建方法为将动物腹腔注射强力霉素，每周注射2-4次，连续注射2-4周。
优选的，所述动物为大鼠或小鼠。更优选的，所述动物为小鼠。进一步优选的，所述动物为C57BL/6J小鼠。
优选的，注射强力霉素的单次给药剂量为20-50 mg/kg。更优选的，单次给药剂量为30mg/kg。
优选的，注射强力霉素的给药频率为每周注射3次。
优选的，注射强力霉素的给药周期为2周。
优选的，两次注射强力霉素的间隔时间为2-3天。更优选的，两次注射强力霉素的间隔时间为2天或3天。进一步优选的，在14天的给药周期内，分别于第0、3、6、9、11、13天注射强力霉素共计6次。
优选的，所述腹膜纤维化为壁腹膜纤维化和/或脏腹膜纤维化。更优选的，所述脏腹膜纤维化为肝包膜纤维化。进一步优选的，所述腹膜纤维化为同时发生的壁腹膜纤维化和肝包膜纤维化。
优选的，所述构建方法为将小鼠腹腔注射强力霉素，单次给药剂量为30mg/kg，每周注射3次，连续注射2周。
本发明的第二方面提供一种伴有肝脏萎缩的腹膜纤维化动物模型的构建方法，所述构建方法为将动物腹腔注射强力霉素，每周注射2-4次，连续注射2-4周。
优选的，所述动物为大鼠或小鼠。更优选的，所述动物为小鼠。进一步优选的，所述动物为C57BL/6J小鼠。
优选的，注射强力霉素的单次给药剂量为20-50 mg/kg。更优选的，单次给药剂量为30mg/kg。
优选的，注射强力霉素的给药频率为每周注射3次。
优选的，注射强力霉素的给药周期为2周。
优选的，两次注射强力霉素的间隔时间为2-3天。更优选的，两次注射强力霉素的间隔时间为2天或3天。进一步优选的，在14天的给药周期内，分别于第0、3、6、9、11、13天注射强力霉素共计6次。
优选的，所述腹膜纤维化为壁腹膜纤维化和/或脏腹膜纤维化。更优选的，所述脏腹膜纤维化为肝包膜纤维化。进一步优选的，所述腹膜纤维化为同时发生的壁腹膜纤维化和肝包膜纤维化。
优选的，所述构建方法为将小鼠腹腔注射强力霉素，单次给药剂量为30mg/kg，每周注射3次，连续注射2周。
本发明的第三方面提供强力霉素在构建动物模型中的应用，所述强力霉素通过腹腔注射方式诱导动物发生腹膜纤维化或者伴有肝脏萎缩的腹膜纤维化。
优选的，所述动物为大鼠或小鼠。更优选的，所述动物为小鼠。进一步优选的，所述动物为C57BL/6J小鼠。
优选的，注射强力霉素的单次给药剂量为20-50 mg/kg。更优选的，单次给药剂量为30mg/kg。
优选的，注射强力霉素的给药频率为每周注射3次。
优选的，注射强力霉素的给药周期为2周。
优选的，两次注射强力霉素的间隔时间为2-3天。更优选的，两次注射强力霉素的间隔时间为2天或3天。进一步优选的，在14天的给药周期内，分别于第0、3、6、9、11、13天注射强力霉素共计6次。
优选的，所述腹膜纤维化为壁腹膜纤维化和/或脏腹膜纤维化。更优选的，所述脏腹膜纤维化为肝包膜纤维化。进一步优选的，所述腹膜纤维化为同时发生的壁腹膜纤维化和肝包膜纤维化。
本发明产生的技术效果：
1、本发明首次构建了一种新型腹膜纤维化小鼠模型，病理结果符合腹膜纤维化临床病理表现，整个造模周期只需要2周，相比于传统的造模方法周期更短，且诱导频率更低，易于操作，重复性好，对于腹膜纤维化药物评价和了解发病机制有积极作用。
2. 腹膜系统由“壁腹膜”和“脏腹膜”组成。目前常用的腹膜纤维化模型只聚焦在壁腹膜的病理变化上。现有技术中关于肝脏包膜的相关研究非常少，但其是肝脏维持正常形态结构发挥正常生理功能的重要机械张力组成。本发明的模型不仅可以在壁腹膜中实现明显纤维化，还可以产生累及脏腹膜（尤其是肝脏）的病理现象，更加贴近临床病例的腹膜纤维化模型。
3、本发明首次建立了一种肝包膜纤维化导致的肝脏萎缩模型，有别于传统肝脏损伤模型“由内到外”的发病顺序，本发明的模型是由外到内，即肝包膜纤维化产生的机械压力挤压肝脏导致肝萎缩。该模型为研究人员提供了由囊膜性病变最终累积实质器官的研究模型。
附图说明
图1是模型组和对照组小鼠体重变化；
图2是模型组和对照组小鼠大体解剖图；
图3是模型组和对照组小鼠肝脏形态图；
图4是模型组和对照组小鼠壁腹膜病理切片染色图；
图5是模型组和对照组小鼠肝脏病理切片染色图；
图6是模型组小鼠肝脏血管和胆囊位置天狼猩红染色图；
图7是模型组小鼠H&E染色的肝脏切片图；
图8是模型组小鼠在低给药频率下的肝脏形态图；
图9是模型组小鼠在长给药周期下的大体解剖图。
具体实施方式
试验例1、伴有肝脏萎缩的腹膜纤维化小鼠模型构建
1、试验方法
以C57BL/6J小鼠为例，选取6-8周C57BL/6J小雄性鼠，每组5只小鼠。采用12/12制光照和黑夜循环，小鼠自由饮水自由摄食。饲养温度20-26℃，房间湿度为40-70%。模型组和对照组分别按照30mg/kg的剂量腹腔注射强力霉素和PBS溶液，每周三次，连续两周。试验开始为第0天，分别于第0、3、6、9、11、13天注射强力霉素或PBS溶液，在实验开始后第14天取材。
试验周期内定时测量各试验组小鼠的体重，观察小鼠体重变化。试验结束后解剖各试验组小鼠，分别取壁腹膜和肝脏用4%PFA进行固定、脱水、和包埋，观察腹膜纤维化程度和肝脏变化。
各试验组小鼠的壁腹膜进行病理切片和Masson染色，确定纤维化（染蓝）状态。将固定的肝组织进行病理切片和染色分析，将H&E染色的肝脏切片进行病理阅片分析。
2、试验结果
2.1、小鼠体重变化
如图1所示，与PBS对照组相比，模型组小鼠活动正常，体重没有明显减轻。
2.2、小鼠解剖结果
与腹腔注射PBS的对照组小鼠相比，注射强力霉素模型组小鼠壁腹膜硬化，肝叶边缘肉眼可见钝化（图2箭头处），肝叶融合萎缩，且腔中脏腹膜黏连严重，韧度加大。与新鲜解剖肝脏（图3上）相比，4%PFA固定后肝脏大体（图3下）更能凸显肝叶的融合萎缩。
2.3、小鼠病理切片染色结果
壁腹膜Masson染色结果显示，强力霉素腹腔注射诱导后的小鼠壁腹膜有明显的纤维化，沉积胶原被染成蓝色（图4箭头）。肝脏天狼猩红与H&E染色结果显示，对照组包膜无异常，而模型组包膜纤维化明显，纤维化的肝包膜会导致包膜下肝实质部分（图5箭头）也有胶原沉积。肝脏静脉血管外围格里森囊膜增厚（图6A），胆囊一般位于肝实质的胆囊窝内，覆盖着自肝表面延续而来的腹膜，因此强力霉素的腹腔注射诱导还可累及胆囊外层腹膜部分，使其增厚并产生纤维化（图6B）。
2.4、肝脏HE染色定性分析
H&E染色的肝脏切片进行病理阅片（见图7），分析结果如下：（1）肝脏包膜病变：肝脏组织被膜增厚明显，纤维组织增多，增生区域可见炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主；（2）汇管区正常：中央静脉内皮细胞完整，周围肝细胞呈放射状排列，未见纤维组织增生及假小叶形成；门管区小叶间动脉、静脉及胆管结构完整清晰，无明显扩大、纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润。（3）肝组织受挤压：近被膜处肝索排列紊乱，肝窦淤血扩张，存在部分肝细胞弥漫性空泡变性。
综上所述，本发明小鼠模型实现了壁腹膜纤维化、肝包膜纤维化（可累及胆囊包膜）效果，同时肝叶受挤压，发生融合萎缩。
试验例2、腹膜纤维化小鼠模型给药剂量筛选
将试验例1中模型组给药方案中的给药剂量由30mg/kg 调整为80 mg/kg，给药频率为每周三次，其余给药方案与试验例1相同，在第28天时发现对小鼠出现腹部肿胀的现象，解剖发现腹膜韧度加大，肝脏异常萎缩至原来1/3大小，小鼠肠道出血明显，体重下降。上述试验结果说明，高剂量给药方案无法获得满足试验要求的腹膜纤维化小鼠模型。
进一步降低给药剂量至50mg/kg，每周三次，其余给药方案与试验例1相同。观察发现第14天时小鼠出于明显的腹膜硬化和肝脏包膜硬化的状态，但是肠道无出血，整体状态良好；第28天的小鼠肠道黏连和肝脏萎缩愈发明显。
将30mg/kg（试验例1）和50mg/kg（试验例2）给药剂量模型组小鼠对比后发现，两者在第28天时都出现了肝脏边缘钝化和腹膜硬化的现象，但是肠道没有出血现象，小鼠体重变化也没有显著区别。
试验例3、腹膜纤维化小鼠模型给药频率筛选
将试验例1中模型组给药方案中每周三次的给药频率调整为每周一次，其余给药方案与试验例1相同，第28天时发现小鼠肝脏只有颗粒样病变，伴有胆汁轻微淤积，但是腹膜没有明显硬化（见图8）。上述试验结果说明，降低给药频率无法获得具有腹膜纤维化特征的小鼠模型。
试验例4、腹膜纤维化小鼠模型给药周期筛选
将试验例1中模型组给药方案中14天的给药周期调整为40天，其余给药方案与试验例1相同。第40天时发现小鼠腹部肿胀明显，体重开始下降，身体虚弱，解剖发现有腹水和出血点（见图9）。上述试验结果说明，延长给药周期无法获得满足试验要求的腹膜纤维化小鼠模型。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
Claims (8)
1.一种腹膜纤维化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将小鼠腹腔注射强力霉素，每周注射2-4次，连续注射2-4周，注射强力霉素的单次给药剂量为20-50 mg/kg。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，注射强力霉素的单次给药剂量为30mg/kg。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，注射强力霉素的给药频率为每周注射3次。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，注射强力霉素的给药周期为2周。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述腹膜纤维化为壁腹膜纤维化和/或脏腹膜纤维化。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述脏腹膜纤维化为肝包膜纤维化。
7. 一种伴有肝脏萎缩的腹膜纤维化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将小鼠腹腔注射强力霉素，每周注射2-4次，连续注射2-4周，注射强力霉素的单次给药剂量为20-50 mg/kg。
8. 强力霉素在构建小鼠模型中的应用，其特征在于，所述强力霉素通过腹腔注射方式诱导小鼠发生腹膜纤维化或者伴有肝脏萎缩的腹膜纤维化，每周注射2-4次，连续注射2-4周，注射强力霉素的单次给药剂量为20-50 mg/kg。
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| 项协隆 ; 林沁 ; .腹膜纤维化大鼠模型研究进展.医学综述.2010,(第10期),第1445-1447页. * |
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