CN104255703B - 一种添加中药单体的人精液冷冻保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供过一种添加中药单体的人精液冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包括中药单体和人精液基础冷冻保护剂，其中，所述中药单体为金丝桃苷或淫羊藿苷。通过将中药单体金丝桃苷、淫羊藿苷添加到常用的基础精液冷冻保护剂中并筛选中药单体与基础精液冷冻保护剂的配比关系，制备出性能优异的人精液冷冻保护剂，配合快速冷冻和快速解冻的方法，可以获得优异的精液保存效果，同时，本发明为中药单体在精液冷冻保护剂中的应用开辟了新的篇章，不仅证实了中药单体作为添加入加入到精液冷冻保护剂中可以有效地改善精子的保存效果，同时也建立了一套完整的、容易被国际认可的适合人少弱精的冷冻系统，解决了少弱精冷冻这一疑难问题。

Description

一种添加中药单体的人精液冷冻保护剂

技术领域

本发明属于人精液冷冻保护剂技术领域，具体地涉及一种添加中药单体的人精液冷冻保护剂。

背景技术

精液冷冻保存技术已有200多年的历史。人的精液冷冻保存可以追溯到20世纪40年代末。目前，精液冷冻保存在我国主要应用于人类精子库以及生育能力的保存。国内外研究者通过几十年对精液冷冻程序、冷冻稀释液、解冻液等的筛选，已经建立了较为成熟的精液冷冻保存体系。全国各生殖中心对人精液冷冻保护剂的需求量比较大，而市场上人精液冷冻保存剂几乎全部被国外的生物公司所垄断，国内只有部分科研院所自行配置畜禽精液冷冻保护剂。国内还没有自行开发的人类精液冷冻保护剂应用于临床，并且现有的商品化的人类精液冷冻保存系统适合于人的正常精液，对少弱精的保存效果并不理想。

我们前期的研究证明通过对少弱精患者进行精液冷冻保存，可以获得尽可能多的处理后活动精子总数(PTMS)，并应用于宫腔内人工授精(IUI)，使更多的患者可以接受IUI技术的治疗，可以减少患者的治疗费用，让不孕不育患者以最小的代价获得妊娠。但随着临床经验的积累，我们发现市场上已有的多种精液冷冻保护剂对于少弱精患者的精液冷冻效果均较差。2009年底出版的WHO《第五版人类精液分析与处理实验室手册》首次单独列出一个章节论述精液冷冻的标准化流程，也提到了少弱精的冷冻保护剂的特殊性，说明少弱精的冷冻保存已经引起了国内外专家的重视，但目前对于适用于少弱精的新型冷冻保护剂缺乏系统的研究，特别是针对添加中草药成分的效用研究甚少。

在精液冷冻保存中冷冻保护剂(CPM)是人精子超低温贮存成功与否的关键。CPM根据其主要成份和缓冲特点可分为三大类型：单一甘油型、甘油复合型和无甘油型。在精液的冷冻过程中，最重要的低温保护剂是甘油。甘油可以渗入细胞内，浓缩或结合胞内水分，而且甘油也有稀释作用，能降低溶液中盐的浓度和冷冻液的渗透压，从而发挥其低温下对精子的保护作用，但甘油对精子有毒害作用。另外冷冻方法也是影响人类精子冻贮后效果的主要因素。目前人类精液的冷冻方法有多种，包括一步冻贮法、分步冻贮法及微机控制程序降温法等。归纳起来可以分为速冻和缓冻法两大类。自从出现最简单的精液稀释液和解冻液(保护液)以来，其设计理论和药物组成已经形成了较为统一的模式，即高纯度的溶剂和化学纯以上的药物合成。冷冻精液成功的应用以后，从冻前处理到冷冻-解冻，以及为了提高妊娠率等不同目的，又在原有成分的基础上，添加了更多种类的“特殊”成分，如咖啡因、ATP、GSH、BSA、酶类、维生素、激素、微量元素及抗冻蛋白等，对“特殊活性”及“特殊作用”的因果追求，已成为当今国内外精子保护剂的研究中心。

多年的临床实践证明中医药治疗少弱精可以明显改善患者精子质量，有一定疗效。研究发现菟丝子的水煎剂对人精子的运动功能和膜功能有明显的促进作用，菟丝子可能有益于治疗男性不育，并可能有助于提高人工授精的成功率。在猪和牛颗粒冻精研究中表明中药提取液在冷冻-解冻过程中可以有效保护精子，提高精子的生存质量和受精潜能。上述水煎剂虽然起到了一定的效果，但由于中药提取液成分复杂，难以受到国际认可，因此寻求单一中药剂方用于精子冷冻保护剂是本领域需要解决的技术难题。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种添加中药单体的人精液冷冻保护剂，其可以有效地保存人精液，特别是对于人少弱精也具有优异的保存效果。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出一种添加中药单体的人精液冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包括中药单体和人精液基础冷冻保护剂，其中，所述中药单体为金丝桃苷或淫羊藿苷。更为优选地，所述冷冻保护剂仅仅包括中药单体金丝桃苷和人精液基础冷冻保护剂；或者所述冷冻保护剂仅仅包括重要单体淫羊藿苷和人精液基础冷冻保护剂。

优选地，所述的中药单体与人精液基础冷冻保护剂的质量体积比为0.2～2.0ng/ml。

具体地，所述的人精液基础冷冻保护剂为TGG基础液。其他用于人精液冷冻保护的人精液冷冻保护剂也同样适用。

本发明还提出了上述添加中药单体的人精液冷冻保护剂在人精液冷冻保护中的应用，在使用时，将人精液与所述添加中药单体的人精液冷冻保护剂以体积比1∶(1～2)混合后利用快速冷冻和快速解冻法对精液进行冷冻保存。

基于上述研究，本发明进一步提出了中药单体在制备用于人正常精液冷冻保存的精液冷冻保护剂尤其是制备用于人少弱精子的精液保护剂中的应用，其中，所述的中药单体为金丝桃苷或淫羊藿苷。

菟丝子是一种生理构造特别的寄生植物，其组成的细胞中没有叶绿体，利用爬藤状构造攀附在其他植物，并且从接触宿主的部位伸出尖刺，戳入宿主直达韧皮部，吸取养分以维生，更进一步还会储存成淀粉粒于组织中。中药菟丝子为双子叶植物药旋花科植物菟丝子、南方菟丝子、金灯藤等的种子，具有补肾益精、养肝明目、固胎止泄之功效。

菟丝子的含生物碱、蒽醌、香豆素、黄酮、甙类、甾醇、鞣酸、糖类等。黄酮类有：槲皮素(Quercetin)、紫云英甙、金丝桃甙(Hyperin)；甾醇类有：胆甾醇(Cholesterol)、菜油甾醇(Cam-pesterol)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、豆甾醇(Stig-masterol)、β-香树脂醇(β-Amyrenol)，亦含微量元素如锶、钼、钙、镁、铁、锰、锌、铜等以及多种氨基酸(种子中的游离氨基酸和水解后的总氨基酸为5.3％，其中必需氨基酸的含量占42.8％)。

菟丝子有效成分主要包括金丝桃苷，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷。属于黄酮醇苷类化合物。苷元为槲皮素，糖基为吡喃半乳糖，由槲皮素的3位O原子以β糖苷键与糖基相连。金丝桃苷分布广泛，具有抗炎、解痉、利尿、止咳、降压、降低胆固醇、蛋白同化、局部和中枢镇疼以及对心、脑血管的保护作用等多种生理活性，是一种重要的天然产物。

淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim)为小蘖科淫羊藿属植物，亦名仙灵脾，是我国传统补益类中药。药理实验显示淫羊藿具有补肾壮阳、扩张血管、抗氧化、抗菌抗病毒作用，可以提高机体免疫功能和预防骨质疏松，临床多用复方治疗糖尿病、男性不育症、防治骨质疏松症、治疗肾阳虚症等，但具体药理作用是哪一些单体和哪一个单体化合物在起主导作用，还有待于进一步研究。菟丝子含有的糖类、蛋白质、维生素等物质有的在现今通用的西式稀释液中已经作为常用成分而添加，有些则未在稀释液中出现过。

淫羊藿主要成分淫羊藿甙(Icariin，ICA)能明显促进幼年小鼠附睾及精囊腺的发育。菟丝子醇提物(SCE)能明显促进小鼠睾丸及附睾的发育^[4]。在体幼年小鼠及离体培养的大鼠睾丸间质细胞研究了ICA及SCE对雄性生殖内分泌的影响，发现ICA能使小鼠附睾及精囊腺增重；SCE则能使睾丸及附睾同时增重。说明淫羊藿和菟丝子分别具有雄性激素及促性腺激素样作用，这可能与淫羊藿及菟丝子的“壮阳”作用有关。体外实验亦表明，ICA及SCE均能明显促进大鼠间质细胞睾酮的基础分泌。同时通过对精子毛细管穿透实验和低渗肿胀实验评估精子活动功能及其膜功能结果表明，菟丝子对精子的运动功能和膜功能亦有促进作用，且不影响尾膜的渗透功能。最新的研究亦表明，淫羊藿、菟丝子等中药对猪精液较好的冷冻保存效果主要得益于其本身所含的各种化学物质，这些物质相互协同，可能改变了精子细胞膜中磷脂和胆固醇的含量或者比例，也可能通过溶解磷脂而使精子膜具有一定的流动性，尽可能的保护膜脂的有效性，改善精子细胞的通透性，防止冷冻时精子遭受的低温损伤。同时中药提取液中的维生素也可通过抑制不饱和脂肪酸的氧化水平而增强精子的活力。在冷冻过程中对精子能够起到抗冻和耐低温的保护作用，同时保证精子的代谢需要，并且具有杀菌、消炎、抗病毒等作用。另外，菟丝子可以增加SOD活性，抑制体内过氧化脂质的生成，对精子细胞具有一定的抗衰老、抗氧化作用；中药在多种成分的共同作用下提高了精子的抗冻性，改善了冻后精子的质量。

此外，菟丝子、淫羊藿等中药中富含的Zn、Cu、Mn、Se等多种组成精子代谢有关的多种酶的成分，对精子的形成和形态具有重要作用。Zn是精子结构组成部分，直接参与精子的生成、成熟、激活以及获能过程，维护细胞膜的结构稳定和生理通透性，使精子具有良好的活动力。精子中Zn的作用主要通过抑制降解酶的活性来保护精子中脱氧核糖核酸酶免遭破坏，从而增强精子的运动能力，提高精子的冻后品质。有研究亦表明淫羊藿、菟丝子作为稀释液时增加了Zn的含量，维护了精子细胞膜的结构和通透性。同时与鱼腥草共同作用，促进了精子的运动性能。Waberski等报道，稀释液在保存精子活性的同时，也产生一定的负面影响，导致精子活力丧失和精子膜损伤。如果精液稀释过度，尤其是使用单纯的化学电解质时对精子的损伤更大。这可能是稀释液的某些成分导致精子细胞的一些重要成分失去功效，同时稀释剂中单一的保护剂也可能对精子的质膜结构和活性产生不良影响，从而影响精子质膜功能，降低冻后精子质量。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过将中药单体金丝桃苷、淫羊藿苷添加到常用的基础精液冷冻保护剂中并筛选中药单体与基础精液冷冻保护剂的配比关系，制备出性能优异的人精液冷冻保护剂，配合快速冷冻和快速解冻的方法，可以获得优异的精液保存效果，同时，本发明为中药单体在精液冷冻保护剂中的应用开辟了新的篇章，不仅证实了中药单体作为添加入加入到精液冷冻保护剂中可以有效地改善精子的保存效果，同时也建立了一套完整的、容易被国际认可的适合人少弱精的冷冻系统，解决了少弱精冷冻这一疑难问题。

具体实施方式

实验样品及材料：

本发明选择生殖医学科门诊精液常规检查标本，正常精液3份，少弱精10份。

正常精液选择密度和活率均较好的精液，少弱精选择密度在10～20×10⁶，活率较好的精液。

正常精液处理前精子质量(精子与冷冻保护剂按体积比1∶1或1∶2混合)：

密度：45±5.0×10⁶；活率：70.67％±5.13；a+b(前向活动精子百分比)：51.00％±5.20；c(非前向活动精子百分比)：19.67％±3.79

少弱精处理前精子质量(精子与冷冻保护剂按体积比1∶1混合)：

密度：16.00±2.45×10⁶；活率：61.90％±6.12；a+b(前向活动精子百分比)：43.20％±5.98；c(非前向活动精子百分比)：18.70％±5.93

少弱精处理前精子质量(精子与冷冻保护剂按体积比1∶1混合)：

密度：17.00±2.65×10⁶；活率：62.67％±2.52；a+b(前向活动精子百分比)：47.67％±8.08；c(非前向活动精子百分比)：15.00％±8.19

金丝桃苷(批号：110737-200415)和淫羊藿苷(批号：111521-201205)均来自中国食品药品检定研究院。

本发明选择基础液(TGG)为对照组，TI～T3组分别为在1mlTGG中加入0.25ng、0.5ng、1.0ng金丝桃苷，Y1～Y3组分别在1mlTGG中加入0.5ng、1.0、ng和2.0ng淫羊藿苷。C1为所照组，即TGG基础液。

实验方法：

(1)基础液(TGG)的配置。

A)配置无菌台式溶液：1000ml净化水中添加CaCl₂0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄0.05g，MgCl₂6H₂O0.2g，NaCl8.0g。NaHCO₃1.0g，右旋葡萄糖1.0g，用1mol/l的NaOH和HCl溶液调整PH至7.4。

B)配置TGG基础液：在40ml上述无菌台式溶液中加入5ml浓度为100mg/ml的人白蛋白，0.9g葡萄糖和5ml甘油。然后使用0.45微米的滤器过滤。将配置好的基础液低温保存备用。

(2)精液冷冻保护剂的配制：

对照组：TGG；

金丝桃苷组：

T1为每毫升TGG中加入0.25ng金丝桃苷的保护液；

T2为每毫升TGG中加入0.5ng金丝桃苷的保护液；

T3为每毫升TGG中加入1.0ng金丝桃苷的保护液；

淫羊藿苷组：

Y1为每毫升TGG中加入0.5ng淫羊藿苷的保护液；

Y2为每毫升TGG中加入1.0ng淫羊藿苷的保护液；

Y3为每毫升TGG中加入2.0ng淫羊藿苷的保护液；

(4)精液冷冻保护剂在正常精液和少弱精冷冻保存过程中的应用效果。

A)装管

待精液样品液化完全后，分别将正常精液样本和少弱精按照体积比1∶1和1∶2加入到上述步骤(3)中制备的保护液样品加入到冷冻管中，其中，充分混匀后分别将冷冻管绑定于冷冻支架上。

B)快速冷冻：

将上述冷冻支架放入4℃冰箱平衡1h，将冷冻支架置于装满液氮的自制容器上，距离液氮面1cm处熏蒸10min，然后转入冷冻罐中保存。

C)快速解冻：

将冷冻管从液氮中取出后，在37℃水浴中静置10min。

D)检测指标：

将上述精液样品冷冻前、解冻后取样于精子专用计数板(MAKLER板)，于NikonE200f双目相差显微镜下检查精子活力、密度等指标。

E)统计学处理：

采用SPSS22.0对各组数据进行t检验和方差分析。P＜0.05为差异有显著性。

实验结果：

(1)金丝桃苷和淫羊藿苷在正常精液冷冻保存过程中的应用效果。

分别比较添加金丝桃苷和淫羊藿苷的冷冻保护剂对正常精液的冷冻效果，结果如表1所示。

表1

统计学分析表明，在1∶1混合比例组中，T2和Y1组冷冻保存效果最好，C1与T2，Y1相比，解冻后活率、前向活动精子、非前向活动精子差异均极显著。在1∶2混合比例组中，T2和Y1组冷冻保存效果最好，C1与T2、T3和Y1相比，解冻后活率差异均极显著；C1与T2和Y1相比，解冻后前向活动精子差异均极显著。C1、T1、T2、Y1和Y2组中，1∶1与1∶2的混合比例相比，解冻后活率差异极显著。

(2)金丝桃苷、淫羊藿苷在少弱精冷冻保存过程中的应用效果。

分别比较添加金丝桃苷和淫羊藿苷的冷冻保护剂对少弱精的冷冻效果，结果如表1所示。

表2

统计学分析表明，在1∶1混合比例组中，T2和Y1组冷冻保存效果最好，C1与T1、T2、T3和Y1相比，解冻后活率差异极显著；C1与T2、T3和Y1相比，解前向活动精子差异极显著；C1与T2相比，解冻后非前向活动精子差异均极显著。在1∶2混合比例组中，T2，Y1组冷冻保存效果最好，C1与各组相比，解冻后活率、前向活动精子、非前向活动精子差异均不显著。T2、T3、Y1和Y3组中，1∶1与1∶2的混合比例相比，解冻后活率差异极显著。

在正常精液冷冻保存过程中，添加0.5ng金丝桃苷的冷冻保护剂解冻后活率最高，添加1.0ng淫羊藿苷的冷冻保护剂解冻后活率次之。精液和冷冻保护剂按1∶1比例混合较1∶2的混合比例冷冻效果要好。

在少弱精冷冻保存过程中，添加0.5ng金丝桃苷的冷冻保护剂和添加1.0ng淫羊藿苷的冷冻保护剂解冻后活率最好，精液和冷冻保护剂按1∶1比例混合较1∶2的混合比例冷冻效果好。

综上所述，金丝桃苷和淫羊藿苷可以有效提高正常精液和少弱精的冷冻保存效果，因此在制备用于人精液的冷冻保存的冷冻保护剂上有重要的应用前景，在TGG冷冻保护剂中加入0.5ng/ml金丝桃苷，精液和冷冻保护剂按1∶1比例混合后，应用快速冷冻和快速解冻法，可以有效的提高少弱精冷冻保存效果。

Claims (4)

1.一种添加中药单体的人精液冷冻保护剂，其特征在于，所述冷冻保护剂包括中药单体和人精液基础冷冻保护剂，其中，所述中药单体为淫羊藿苷，所述的中药单体与人精液基础冷冻保护剂的质量体积比为0.2～2.0ng/ml；所述的人精液基础冷冻保护剂为TGG基础液。

2.根据权利要求1所述的添加中药单体的人精液冷冻保护剂，其特征在于，所述的TGG基础液通过如下方法配制：

A)配置无菌台式溶液：1000ml净化水中添加CaCl₂0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄0.05g，MgCl₂6H₂O0.2g，NaCl8.0g，NaHCO₃1.0g，右旋葡萄糖1.0g，用1mol/l的NaOH和HCl溶液调整 pH至7.4；

B)配置TGG基础液：在40ml上述无菌台式溶液中加入5ml浓度为100mg/ml的人白蛋白，0.9g葡萄糖和5ml甘油，然后使用0.45微米的滤器过滤，将配置好的基础液低温保存备用。

3.权利要求1所述的添加中药单体的人精液冷冻保护剂在人精液冷冻保护中的应用，其特征在于，在使用时，将人精液与所述添加中药单体的人精液冷冻保护剂以体积比1∶(1～2)混合后利用快速冷冻和快速解冻法对精液进行冷冻保存。

4.中药单体在制备用于人少弱精子的精液冷冻保护剂中的应用，其中，所述中药单体为淫羊藿苷。