CN104255491A

CN104255491A - 一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法

Info

Publication number: CN104255491A
Application number: CN201410478843.2A
Authority: CN
Inventors: 郑凯; 丁久玲; 王海珍; 李大功; 蔡泓宇
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2014-09-19
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2034-09-19
Also published as: CN104255491B

Abstract

本发明公开了一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，包括消毒灭菌，初代培养，继代培养，壮苗培养，生根培养，炼苗，移栽步骤。通过采用本发明的金叶龟甲冬青组培繁殖方法，能够提高金叶龟甲冬青的繁殖系数，加快金叶龟甲冬青的繁殖速度，提高金叶龟甲冬青的成活率，为快速繁殖优良的金叶龟甲冬青种苗提供技术支持，满足市场对金叶龟甲冬青的日益增长的需求。

Description

一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法

技术领域

本涉及冬青繁殖领域，尤其涉及一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法。

背景技术

金叶龟甲冬青是冬青科冬青属彩叶植物，具有常绿、耐低温、植株低矮紧凑等特点。是我国是近几年从国外引进的彩叶新品种，其老叶片浓绿具光泽，新叶片金黄色，色泽极其亮丽。近年来龟甲冬青在国内外绿化产业中需求旺盛，因此应加快其繁殖速度，满足其日益增加的市场需求。金叶龟甲冬青的常规繁殖方法有扦插繁殖和嫁接繁殖，扦插繁殖的繁殖周期为1年左右，成活率90%左右，繁殖系数小于等于1；嫁接繁殖的繁殖周期为一年以上，成活率60%-80%左右，繁殖系数小于等于1，由于其繁殖速度较慢，繁殖系数和成活率低限制了它的推广应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，通过组培繁殖来提高金叶龟甲冬青的繁殖系数、繁殖速度。

为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的，一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，包括以下步骤：

1）消毒灭菌，选取金叶龟甲冬青的幼嫩茎段为外植体，用水清洗干净后，用消毒液消毒；

2）初代培养，将消毒灭菌后的金叶龟甲冬青外植体接种在初代培养基上，无菌培养室培养30d，；

3）继代培养，将初代培养得到的芽苗切成带腋芽的长0.5cm的茎段，接种在继代培养基上，无菌培养室培养25d-35d，长成0.8-1.2cm的丛生芽苗；

4）壮苗培养，将继代培养基上的丛生芽苗切下后接种在壮苗培养基上，无菌培养室培养20d-30d；

5）生根培养，当壮苗培养基上的芽苗长至3～4㎝时，转移到生根培养基上培养，无菌培养室培养40d-50d；

6）炼苗，将经过生根培养的组培苗连同生根培养基移至温度23±2℃的温室内放置3d-5d天；

7）移栽，将幼苗取出，用水将组培苗根部的培养基清洗干净，种入铺有栽培基质的苗床，大棚栽培20d-30d。

其中初代培养基：包括MS+玉米素（ZT ）0.5-1.0mg/L＋萘乙酸（NAA）0.1mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，且培养基的pH值为5.6～5.8；

继代培养基：包括MS+玉米素（ZT ） 0.5mg/L＋萘乙酸（NAA）0.2mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，且培养基的pH值为5.6～5.8；

壮苗培养基：包括MS+玉米素（ZT ） 0.5mg/L＋萘乙酸（NAA）0.2mg/L＋蔗糖30mg/L＋琼脂7mg/L，且培养基的pH值为5.6～5.8；

生根培养基：包括1/2MS＋吲哚丁酸（IBA）0.1mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L+活性炭3g/L＋蔗糖20g/L，且培养基的pH值为5.6～5.8；

栽培基质：包括土壤、蛭石、泥炭，土壤、蛭石、泥炭按体积比2:1:1充分混匀。

所述土壤采用经耕作并栽培过花木、蔬菜的土壤，土壤成分和结构适于金叶龟甲冬青的生长，有利于移栽幼苗的成活。

所述步骤1）中用消毒液消毒，过程为先用体积浓度75%酒精浸泡20s，用无菌水冲洗外植体至少3次，每次冲洗时间不少于5min；再转入质量浓度0.1% 的升汞溶液（HgCl₂）浸泡8-9min，用无菌水冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干。

步骤2）中培养条件为：温度20±2℃、光照强度1000~1500lx、光照时间10~12h/d、培养地点无菌培养室。

所述步骤3）、4）、5）中培养条件为：温度25±2℃、光照强度1500~2000lx、光照时间12~14h/d、培养地点无菌培养室。

步骤3）中每25d-35d将长出的丛生芽苗切下，继续继代培养一次，继代培养3次后，进行壮苗培养。通过反复切割，继代培养后增殖倍数可达5倍左右。

步骤7）中移栽后喷施稀释800-1000倍的甲基托布津或1000倍多菌灵药液，每隔一周喷施一次，连续3-4次。

步骤7）中移栽初期7d-10d内，全封闭管理并遮阴，保持苗床和空气的湿度在90%左右，温度为23±2℃。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：

1）提高金叶龟甲冬青的繁殖系数，繁殖系数可达4-6倍；

2）加快金叶龟甲冬青的繁殖速度，繁殖周期缩短至200-233d；

3）提高金叶龟甲冬青的成活率，成活率达到93-95%。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

选取金叶龟甲冬青的当年生带有腋芽的幼嫩茎段为外植体，将外植体放在流水下反复冲洗1h，加入适量的洗涤剂浸泡清洗3次，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒处理。消毒处理为：先用体积浓度75%酒精浸泡20s，用无菌水反复冲洗振荡外植体3次，每次冲洗7min；再转入质量浓度0.1% 的升汞（HgCl₂）消毒8min，用无菌水反复冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干。

将经过消毒灭菌的金叶龟甲冬青外植体接种在初代培养基上，初代培养基的配方为：MS+ZT 0.5mg/L＋NAA0.1mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.6。培养条件为：温度20±2℃、光照强度1000lx、光照时间10h/d的无菌培养室。外植体接种在初代培养基上培养10d，腋芽开始萌动，30d后长为高2cm左右的芽苗。通过初代培养，腋芽诱导率达94%。

将初代培养得到的芽苗切成带腋芽的长0.5cm的茎段，接种在继代培养基上，继代培养基的配方为：MS+ZT 0.5mg/L＋NAA0.2mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.6。培养条件为：温度25±2℃、光照强度1500lx、光照时间12h/d的无菌培养室。35d可长成1.2cm的丛生芽苗，将丛生芽切下，继续接种在继代培养基上，每35d继代一次。当继代培养3代后，继代培养后增殖倍数可达6倍左右，此时可进行壮苗培养。

将继代培养基上的小苗切下后接种在壮苗培养基上，壮苗培养基配方为：MS+ZT 0.5mg/L＋NAA0.2mg/L＋蔗糖30mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.6左右。培养条件为：温度25±2℃、光照强度1500lx、光照时间12h/d的无菌培养室。壮苗培养30d，将健壮的小苗移入生根培养基培养。

当健壮的金叶龟甲单位无根苗长至3～4㎝时，转移到生根培养基上培养。生根培养基配方为：1/2MS＋IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭3g/L＋蔗糖20g/L，PH值5.6左右。培养条件为：温度25±2℃、光照强度1500lx、光照时间12h/d的无菌培养室。12d即可生出白色的根，生根率达100%， 50d每苗可分化出4-6条根，即可进行炼苗移栽。

金叶龟甲冬青组培苗炼苗连同生根培养基可先在温度23±2℃的温室内放置3d天，然后进行移栽。

苗床建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2m，床四周砌高30cm，床底整平，铺上栽培基质。栽培基质包括土壤、蛭石、泥炭，按体积比土壤：蛭石：泥炭=2:1:1混合，栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用，土壤采用经耕作并栽培过花木、蔬菜的土壤。移栽时，将幼苗取出，用清水将金叶龟甲冬青组培苗根部的固体培养基清洗干净，同时应尽量减少伤根。种入苗床后，选择清洁水浇灌，并喷施稀释800倍的甲基托布津药液，以后每隔一周喷施一次，连续3次。移栽初期即7d内，全封闭管理，进行遮阴，要特别注意保持苗床和空气的湿度和温度，湿度保持在85%，温度23±2℃，在20d逐步通风，并除去覆盖物。成活率可达93%。

实施例2

选取金叶龟甲冬青的当年生带有腋芽的幼嫩茎段为外植体，将外植体放在流水下反复冲洗1h，加入适量的洗涤剂浸泡清洗3次，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒处理。消毒处理为：先用体积浓度75%酒精浸泡20s，用无菌水反复冲洗振荡外植体5次，每次冲洗6min；再转入质量浓度0.1% 的升汞（HgCl₂）消毒9min，用无菌水反复冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干。

将经过消毒灭菌的金叶龟甲冬青外植体接种在初代培养基上，初代培养基的配方为：MS+ZT1.0mg/L＋NAA0.1mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.8。培养条件为：温度20±2℃、光照强度1500lx、光照时间12h/d的无菌培养室。外植体接种在初代培养基上培养7d，腋芽开始萌动，30d后长为高2cm左右的芽苗。通过初代培养，腋芽诱导率达96%。

将初代培养得到的芽苗切成带腋芽的长0.5cm的茎段，接种在继代培养基上，继代培养基的配方为：MS+ZT 0.5mg/L＋NAA0.2mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.8。培养条件为：温度25±2℃、光照强度2000lx、光照时间14h/d的无菌培养室。25d左右可长成0.8cm的丛生芽苗，将丛生芽切下，继续接种在继代培养基上，每25d继代一次。当继代培养3代后，继代培养后增殖倍数可达4倍左右，此时可进行壮苗培养。

将继代培养基上的小苗切下后接种在壮苗培养基上，壮苗培养基配方为：MS+ZT 0.5mg/L＋NAA0.2mg/L＋蔗糖30mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.8左右。培养条件为：温度25±2℃、光照强度2000lx、光照时间14h/d的无菌培养室。壮苗培养20d，将健壮的小苗移入生根培养基培养。

当健壮的金叶龟甲单位无根苗长至3～4㎝时，转移到生根培养基上培养。生根培养基配方为：1/2MS＋IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭3g/L＋蔗糖20g/L，PH值5.8左右。培养条件为：温度25±2℃、光照强度2000lx、光照时间14h/d的无菌培养室。8d即可生出白色的根，生根率达100%，40d每苗可分化出4-6条根，即可进行炼苗移栽。

金叶龟甲冬青组培苗炼苗连同生根培养基可先在温度23±2℃的温室内放置5d天，然后进行移栽。

苗床建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2m，床四周砌高30cm，床底整平，铺上栽培基质。栽培基质包括土壤、蛭石、泥炭，按体积比土壤：蛭石：泥炭=2:1:1混合，栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用，土壤采用经耕作并栽培过花木、蔬菜的土壤。移栽时，将幼苗取出，用清水将金叶龟甲冬青组培苗根部的固体培养基清洗干净，同时应尽量减少伤根。种入苗床后，选择清洁水浇灌，并喷施稀释1000倍的甲基托布津药液，以后每隔一周喷施一次，连续4次。移栽初期即10d内，全封闭管理，进行遮阴，要特别注意保持苗床和空气的湿度和温度，湿度保持在95%，温度23±2℃，在30d逐步通风，并除去覆盖物。成活率可达95%。

实施例3

选取金叶龟甲冬青的当年生带有腋芽的幼嫩茎段为外植体，将外植体放在流水下反复冲洗1h，加入适量的洗涤剂浸泡清洗3次，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒处理。消毒处理为：先用体积浓度75%酒精浸泡20s，用无菌水反复冲洗振荡外植体5次，每次冲洗5min；再转入质量浓度0.1% 的升汞（HgCl₂）消毒8min，用无菌水反复冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干。

将经过消毒灭菌的金叶龟甲冬青外植体接种在初代培养基上，初代培养基的配方为：MS+ZT 0.8mg/L＋NAA0.1mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.7。培养条件为：温度20±2℃、光照强度1200lx、光照时间11h/d的无菌培养室。外植体接种在初代培养基上培养8d，腋芽开始萌动，30d后长为高2cm左右的芽苗。通过初代培养，腋芽诱导率达95%。

将初代培养得到的芽苗切成带腋芽的长0.5cm的茎段，接种在继代培养基上，继代培养基的配方为：MS+ZT 0.5mg/L＋NAA0.2mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.7。培养条件为：温度25±2℃、光照强度1800lx、光照时间13h/d的无菌培养室。30d左右可长成1cm的丛生芽苗，将丛生芽切下，继续接种在继代培养基上，每30d继代一次。当继代培养3代后，继代培养后增殖倍数可达5倍左右，此时可进行壮苗培养。

将继代培养基上的小苗切下后接种在壮苗培养基上，壮苗培养基配方为：MS+ZT 0.5mg/L＋NAA0.2mg/L＋蔗糖30mg/L＋琼脂7mg/L，PH值5.7左右。培养条件为：温度25±2℃、光照强度18lx、光照时间13h/d的无菌培养室。壮苗培养25d，将健壮的小苗移入生根培养基培养。

当健壮的金叶龟甲单位无根苗长至3～4㎝时，转移到生根培养基上培养。生根培养基配方为：1/2MS＋IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭3g/L＋蔗糖20g/L，PH值5.7左右。培养条件为：温度25±2℃、光照强度1800lx、光照时间13h/d的无菌培养室。10d即可生出白色的根，生根率达100%，45d每苗可分化出4-6条根，即可进行炼苗移栽。

金叶龟甲冬青组培苗炼苗连同生根培养基可先在温度23±2℃的温室内放置4d天，然后进行移栽。

苗床建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2m，床四周砌高30cm，床底整平，铺上栽培基质。栽培基质包括土壤、蛭石、泥炭，按体积比土壤：蛭石：泥炭=2:1:1混合，栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用，土壤采用经耕作并栽培过花木、蔬菜的土壤。移栽时，将幼苗取出，用清水将金叶龟甲冬青组培苗根部的固体培养基清洗干净，同时应尽量减少伤根。种入苗床后，选择清洁水浇灌，并喷施稀释1000倍多菌灵药液，以后每隔一周喷施一次， 4次。移栽初期即7d内，全封闭管理，进行遮阴，要特别注意保持苗床和空气的湿度和温度，湿度保持在90%，温度23±2℃，在25d逐步通风，并除去覆盖物。成活率可达96%。

Claims

1.一种金叶龟甲冬青组培繁殖的培养基配方，其特征在于：

初代培养基：包括MS+玉米素 0.5-1.0mg/L＋萘乙酸0.1mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，且培养基的pH值为5.6～5.8；

继代培养基：包括MS+玉米素 0.5mg/L＋萘乙酸0.2mg/L＋蔗糖25mg/L＋琼脂7mg/L，且培养基的pH值为5.6～5.8；

壮苗培养基：包括MS+玉米素 0.5mg/L＋萘乙酸0.2mg/L＋蔗糖30mg/L＋琼脂7mg/L，且培养基的pH值为5.6～5.8；

生根培养基：包括1/2MS＋吲哚丁酸0.1mg/L+萘乙酸0.5mg/L+活性炭3g/L＋蔗糖20g/L，且培养基的pH值为5.6～5.8；

2.根据权利要求1所述的一种金叶龟甲冬青组培繁殖的培养基配方，其特征在于，所述土壤为经耕作并栽培过花木、蔬菜的土壤。

3.一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

2）初代培养，将消毒灭菌后的金叶龟甲冬青外植体接种在初代培养基上，无菌培养室培养30d；

5）生根培养，当壮苗培养基上的芽苗长至3-4㎝时，转移到生根培养基上培养，无菌培养室培养40d-50d；

4.根据权利要求3所述的一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤1）中用消毒液消毒，过程为先用体积浓度75%酒精浸泡20s，用无菌水冲洗外植体至少3次，每次冲洗时间不少于5min；再转入质量浓度0.1% 的升汞溶液（HgCl₂）浸泡8-9min，用无菌水冲洗干净后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干。

5.根据权利要求3所述的一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤2）中培养条件为：温度20±2℃、光照强度1000~1500lx、光照时间10~12h/d、培养地点无菌培养室。

6.根据权利要求3所述的一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤3）、4）、5）中培养条件为：温度25±2℃、光照强度1500~2000lx、光照时间12~14h/d、培养地点无菌培养室。

7.根据权利要求3所述的一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤3）中每25d-35d将长出的丛生芽苗切下，继续继代培养一次，继代培养3次后，进行壮苗培养。

8.根据权利要求3所述的一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤7）中移栽后喷施稀释800-1000倍的甲基托布津或1000倍多菌灵药液，每隔一周喷施一次，连续3-4次。

9.根据权利要求3所述的一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法，其特征在于，所述步骤7）中移栽初期7d-10d内，全封闭管理并遮阴，保持苗床和空气的湿度在85~95%，温度为23±2℃。