CN104250312A - 壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型的壳聚糖苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物的合成方法，该方法采用壳聚糖与带有不同基团的苯基异氰酸酯反应，得到壳聚糖上的羟基和氨基完全地转化为氨基甲酸酯和脲基的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。采用涂敷法将其制备成手性固定相并应用高效液相色谱，对各种对映体进行拆分，表明此类手性固定相具有很高的手性识别能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的壳聚糖类衍生物的合成方法，具体地说是一种结构较小、具有较好手性识别能力的可作为高效液相色谱手性固定相的壳聚糖类衍生物的合成方法。
背景技术
采用高效液相色谱技术对对映体进行手性分离已经成为目前分离对映体最有效的方法之一。而具有高效手性识别能力手性固定相的制备是该分离技术的关键内容。到目前为止，已有超过200种手性固定相已经实现商品化。其中多糖类（主要为纤维素和淀粉）衍生物是最具有分离效能且是应用范围最广的手性固定相之一。
壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化后的产物，由于本身无毒无害、绿色环保，并具有良好的生物相容性、可降解性、成膜性及一定的抗菌消炎等性能已被广泛应用于医药、食品、农业、日化和环保的多个行业。但是，壳聚糖分子间氢键的作用力较强，使它不溶于一般的有机溶剂和水，在一定程度上限制了它的广泛应用。对壳聚糖进行化学修饰，以期改进其溶解性能并拓宽其应用范围，在近年来越来越受到人们的青睐。
壳聚糖的结构与纤维素相似，唯一的区别在于其葡萄糖单元的2-位上带有氨基而不是羟基，因此壳聚糖衍生物是不同于纤维素或淀粉衍生物的另一种新型多糖类衍生物，且其结构上的特异性可能带来独特的手性识别能力。
壳聚糖衍生物的合成方法较多，但是采用壳聚糖与异氰酸酯反应合成壳聚糖衍生物的却较少，并且由于壳聚糖上的氨基和羟基较为活泼，所以当壳聚糖与苯基类异氰酸酯反应时很容易导致产物的异构化，即所生成的壳聚糖苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物上的氨基和脲基上的氢原子会进一步与异氰酸酯反应，生成带有双缩脲和脲基甲酸酯的体积较为庞大的壳聚糖衍生物。2009年，日本的Yasunori Kuse等人采用脱乙酰度为95.9%的壳聚糖在N,N-二甲基乙酰胺溶剂体系中与苯基异氰酸酯反应制备成了带有不同比例双缩脲和脲基甲酸酯的壳聚糖苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。2008年日本的Yamamoto Chiyo等人采用完全脱乙酰化的壳聚糖在以吡啶作为溶剂的条件下与6种苯基异氰酸酯反应，合成了壳聚糖类衍生物。但此类壳聚糖衍生物在四氢呋喃中的溶解性非常差，于是在制备手性固定相时使用了DMSO作为涂敷溶剂。
发明内容
本发明利用壳聚糖上的氨基和羟基与苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯反应，获得壳聚糖羟基和氨基完全转化为氨基甲酸酯-脲基的壳聚糖类衍生物，该衍生物结构较小。这样的衍生物不但大大提高了壳聚糖的溶解性，并且将壳聚糖衍生物制备成手性固定相在高效液相色谱上能够有效的分离药物对映体，具有很好的工业化前景。
具体地，本发明提供以下内容。
[1].壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物的制备方法，该方法包括：
采用壳聚糖与苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯反应，合成壳聚糖上的羟基和氨基完全地转化为氨基甲酸酯和脲基的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
[2].上述[1]所述的制备方法，其中，作为反应原料的壳聚糖是使用完全脱乙酰化的壳聚糖。
[3].上述[1]-[2]中任一项所述的制备方法，其中，作为反应原料的壳聚糖的分子量在50000～300000。
[4].上述[1]-[3]中任一项所述的制备方法，其中，所述苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯选自：苯基异氰酸酯、4-甲氧基苯基异氰酸酯、4-乙基苯基异氰酸酯、4-甲基苯基异氰酸酯、4-氟苯基异氰酸酯、4-氯苯基异氰酸酯、4-溴苯基异氰酸酯、4-硝基苯基异氰酸酯、2-氯苯基异氰酸酯、2-甲基苯基异氰酸酯、3-氯苯基异氰酸酯、3-甲基苯基异氰酸酯、3,5-二氯苯基异氰酸酯和3,5-二甲基苯基异氰酸酯中的一种或多种。
[5].上述[1]-[4]中任一项所述的制备方法，其中，加入的苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯的摩尔质量是壳聚糖的羟基和氨基的总摩尔质量的1.5-3倍。
[6].上述[1]-[5]中任一项所述的制备方法，其包括以下步骤：
(1)向壳聚糖原料中加入反应溶剂进行溶胀，
(2)加入所述苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯，在反应温度为40-150℃反应，反应时间为0.5-24小时，和
(3)将反应产物滴入隔离溶剂中，形成壳聚糖类衍生物沉淀析出。
[7].上述[6]所述的制备方法，其还包括以下步骤：
在上述步骤(1)之前，将壳聚糖原料在60-100℃真空干燥；和/或在步骤(2)之前，加入氢键消除剂。
[8].上述[5]-[7]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤（1）中，所述的壳聚糖原料中加入反应溶剂配成质量浓度为0.013～0.025g/mL，反应溶剂为二甲基亚砜（DMSO）。
[9].上述[5]-[8]中任一项所述的制备方法，其中，所述的氢键消除剂是氯化锂。
[10].上述[5]-[9]中任一项所述的制备方法，其中，所述的隔离溶剂选自甲醇和乙酸乙酯中的一种或多种。
[11].上述[1]-[10]中任一项所述的制备方法得到的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
[12].上述[11]的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物用于制备涂敷型高效液相手性固定相的用途。
[13].涂敷型高效液相手性固定相，其包含上述[12]的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
本发明上述得到的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物结构较小，壳聚糖上的2-、3-和6-位上的羟基和氨基完全地转化为氨基甲酸酯和脲基部分，这不同于现有技术中的形成带有双缩脲和脲基甲酸酯的庞大体积。而且，本发明的壳聚糖类衍生物在四氢呋喃(THF)等多种溶剂中都具有较好的溶解性。由本发明所获得的衍生物对于多种对映体均显示了良好的手性识别能力，且高于例如Yamamoto Chiyo等现有技术文献中的结果。可见，本发明得到了新型的壳聚糖衍生物，其在结构、溶解性和手性识别性能等上都优于现有技术。
附图说明
图1为安息香对映体在实施例6制得的壳聚糖-4-氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物制备的手性固定相上的色谱拆分图，溶剂：正己烷/异丙醇（90/10）；流速：0.1mL/min。
图2为黄烷酮在实施例14制得的壳聚糖-3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物制备的手性固定相上的色谱拆分图，溶剂：正己烷/异丙醇（90/10）；流速：0.1mL/min。
在图1和图2中，t0是死时间，t1是分离的对映体出第一个峰的保留时间，t2是分离的对映体出第二个峰的保留时间。保留时间的长短代表手性固定相与对映体之间作用力的大小。
具体实施方式
本发明合成的是一种新型的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物，所述的壳聚糖衍生物的结构可如式1所示。
其中，R表示任选取代的苯基。取代基可以在苯环的适当位置，例如2-、3-、4-、5-、和/或6-位等。取代基的个数可以为1个、2个、3个或4个，优选1-2个。所述的苯基上的各取代基可以相同或不同，可以选自氢原子、卤素原子、烷基、烷氧基、硝基、氨基、烷硫基等。作为烷基，优选为C1-12烷基，更优选C1-6烷基，更优选C1-4烷基（例如甲基、乙基）。作为烷氧基，优选C1-12烷氧基，更优选C1-6烷氧基，更优选C1-4烷氧基（例如甲氧基、乙氧基）。作为卤素原子，可以为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子，优选为氟原子、氯原子和溴原子。作为烷硫基，优选C1-12烷硫基，更优选C1-6烷硫基，更优选C1-4烷硫基（例如甲硫基、乙硫基）。
优选地，R表示任选被1个或2个卤原子取代的苯基、任选被1个或2个C1-4烷基(例如甲基、乙基)取代的苯基、任选被1个或2个C1-4烷氧基（例如甲氧基、乙氧基）取代的苯基、或任选被1个或2个硝基取代的苯基等。
更进一步地，R优选为以下基团：
所述的壳聚糖衍生物采用壳聚糖与苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯反应而制得。
作为壳聚糖原料，优选采用完全脱乙酰化的壳聚糖。壳聚糖原料的分子量优选30000～600000，更优选50000～300000。
作为苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯，优选为式(2)所示的具有与式(1)所示的R相对应的基团的苯基异氰酸酯。
在式(2)中，基团表示与式(1)中的R相同的基团。R1即对应于基团R中所述的苯环上的氢或取代基。
优选的苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯示例选自苯基异氰酸酯、4-甲氧基苯基异氰酸酯、4-乙基苯基异氰酸酯、4-甲基苯基异氰酸酯、4-氟苯基异氰酸酯、4-氯苯基异氰酸酯、4-溴苯基异氰酸酯、4-硝基苯基异氰酸酯、2-氯苯基异氰酸酯、2-甲基苯基异氰酸酯、3-氯苯基异氰酸酯、3-甲基苯基异氰酸酯、3,5-二氯苯基异氰酸酯和3,5-二甲基苯基异氰酸酯中的一种或多种。
作为反应加入的苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯的量，加入的苯基异氰酸酯或具有不同侧链的苯基异氰酸酯的摩尔质量优选是壳聚糖和羟基和氨基的总摩尔质量的1.5-3倍，更优选2.0-3倍，进一步优选2.5-3倍。
作为反应时间，优选0.5-24小时，更优选0.5-20小时，进一步优选1-12小时。
作为反应温度，适宜在高温下进行反应，优选40-150℃，更优选55-105℃，进一步优选60-100℃。
反应优选在溶剂中进行，作为反应溶剂，优选为二甲基亚砜，例如无水二甲基亚砜。
在反应前，任选地加入氢键消除剂，优选进行搅拌。氢键消除剂优选为氯化锂。搅拌时间优选为1-20小时，优选3-15小时，更优选4-12小时。
还任选在反应前在壳聚糖原料中加入反应溶剂来进行溶胀。溶胀时间优选10-60小时，优选24-55小时，进一步优选40-48小时。
进一步地，优选在反应前，特别是溶胀前，将壳聚糖原料在高温进行真空干燥，温度优选为60-100℃，更优选为70-90℃，进一步优选80℃左右。干燥时间优选为1-20小时，更优选为4-10小时，进一步优选为4-6小时。
上述各步骤任选在非活性气体条件下进行。所述非活性气体可以选自氮气、氦气和氩气。优选为氮气。
在反应完成后，任选将反应溶液加入到隔离溶剂中，形成壳聚糖类衍生物沉淀析出。反应溶液与隔离溶剂的体积比优选为1：2～40，更优选1：5～30，进一步优选1：10～20。隔离溶剂优选为选自乙醚、甲醇、乙酸乙酯中的一种或多种。
任选将得到的沉淀在35-100℃、优选40～80℃，更优选60～80℃下真空干燥24～60小时，优选40-48小时。
具体地，本发明的制备方法可以包括以下步骤：
(1)向壳聚糖原料中加入反应溶剂进行溶胀，
(2)加入所述苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯，在反应温度为40-150℃反应，反应时间为0.5-24小时，和
(3)将反应产物滴入隔离溶剂中，形成壳聚糖类衍生物沉淀析出。
例如，本发明的制备方法可以如下进行：在真空高温下，搅拌完全脱乙酰化的壳聚糖原料4-6小时，非活性气体保护下加入无水二甲基亚砜溶胀壳聚糖24-48小时，室温下加入无水氯化锂4-12小时，高温非活性气体下，加入带有不同侧链的苯基异氰酸酯反应1-24h。之后将壳聚糖衍生物反应溶液逐渐滴入隔离溶剂中进行隔离，析出壳聚糖衍生物，采用离心机进行离心获得壳聚糖衍生物，在40-80℃下真空干燥24-48小时。即获得新型的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
本发明可以运用核磁共振氢谱对所获得壳聚糖衍生物进行测试分析，确定其结构以及羟基和氨基是否完全转化为氨基甲酸酯-脲基衍生物。
进一步地，将本发明所获得壳聚糖衍生物制备成壳聚糖手性固定相，实现了对某些对映体的有效拆分。
本发明的效果
本发明的制备方法可以获得壳聚糖2，3，6-位上的羟基和氨基完全地转化为氨基甲酸酯和脲基的单一结构的新型壳聚糖衍生物。而在现有技术中则是结构庞大的带有双缩脲和脲基甲酸盐的衍生物，很大程度上会降低手性固定相的手性识别能力。
而且，本发明的壳聚糖类衍生物的溶解性与壳聚糖原料相比得到了很大的提高，本发明的壳聚糖衍生物可以溶解在THF、DMSO、DMF（二甲基甲酰胺）和吡啶等多种溶剂中。
进一步地，本发明的壳聚糖类衍生物在制备成涂敷型手性固定相时还能够在一些极性较强的溶剂（如氯仿）中使用，例如：壳聚糖类涂敷型手性固定相可在以氯仿作为流动相的色谱条件下使用。而传统多糖类衍生物所制备的涂敷型手性固定相在这些强极性溶剂中溶解或溶胀。对其具有破坏作用，可导致手性柱的损坏甚至失效，是禁止在极性溶剂中使用的。
此外，本发明的实验步骤简单易操作。
实施例
下面举例对本发明做更详细地描述，但本发明并不限于此。
实施例1：
壳聚糖4-甲氧基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(a)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h.
3)在80℃下，氮气保护，加入4-甲氧基苯基异氰酸酯1.60mL（摩尔质量为羟基和氨基的3.0倍量），反应24h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为63.16%的壳聚糖4-甲氧基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例2：
壳聚糖4-乙基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(b)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)室温下，加入0.40g氯化锂，搅拌12h。
4)在80℃下，氮气保护，加入4-乙基苯基异氰酸酯1.06mL（摩尔质量为羟基和氨基的2.0倍量），反应1h。
5)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
6)在60℃下，真空干燥48h，壳聚糖产率为73.20%的壳聚糖-4-乙基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例3：
壳聚糖4-甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(c)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)在80℃下，氮气保护，加入4-甲基苯基异氰酸酯1.40mL（摩尔质量为羟基和氨基的3.0倍量），反应10h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为55.10%的壳聚糖-4-甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例4：
壳聚糖苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(d)的合成步骤：
1)在80℃下，0.30g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入12mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)在80℃下，氮气保护，加入苯基异氰酸酯1.51mL（摩尔质量为羟基和氨基的2.5倍量），反应12h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到240mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为55.00%的壳聚糖苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例5：
壳聚糖4-氟苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(e)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入12mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)在65℃下，氮气保护，加入4-氟苯基异氰酸酯1.07mL（摩尔质量为羟基和氨基的2.5倍量），反应12h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到240mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为64.80%壳聚糖-4-氟苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例6：
壳聚糖4-氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(f)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)在80℃下，氮气保护，加入4-氯苯基异氰酸酯1.14g（摩尔质量为羟基和氨基的2.5倍量），反应12h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL乙醚溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为73.60%的壳聚糖-4-氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例7：
壳聚糖4-溴苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(g)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h.
3)在80℃下，氮气保护，加入4-溴苯基异氰酸酯1.48g（摩尔质量为羟基和氨基的2.0倍量），反应12h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL乙醚溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为56.38%的壳聚糖-4-溴苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例8：
壳聚糖4-硝基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(h)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)在60℃下，氮气保护，加入4-硝基苯基异氰酸酯1.22g（摩尔质量为羟基和氨基的2.5倍量），反应3h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL乙酸乙酯溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为82.50%的壳聚糖-4-硝基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例9：
壳聚糖2-氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(i)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h.
3)在80℃下，氮气保护，加入2-氯苯基异氰酸酯1.14g（摩尔质量为羟基和氨基的2.0倍量），反应12h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为59.74%的壳聚糖-2-氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例10：
壳聚糖3-氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(j)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)室温下，加入0.30g氯化锂，搅拌12h。
4)在100℃下，氮气保护，加入3-氯苯基异氰酸酯1.12mL（摩尔质量为羟基和氨基的2.5倍量），反应12h。
5)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
6)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为70.00%的壳聚糖-3-氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例11：
壳聚糖2-甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(k)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)室温下，加入0.50g氯化锂，搅拌16h。
4)在80℃下，氮气保护，加入2-甲基苯基异氰酸酯1.50mL（摩尔质量为羟基和氨基的3.0倍量），反应16h。
5)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物。
6)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为68.57%的壳聚糖-2-甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例12：
壳聚糖3-甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(l)的合成步骤：
1)在80℃下，0.20g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入8mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)在70℃下，氮气保护，加入3-甲基苯基异氰酸酯1.44mL（摩尔质量为羟基和氨基的3.0倍量），反应10h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为57.14%的壳聚糖-3-甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例13：
壳聚糖3,5-二氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(m)的合成步骤：
1)在80℃下，0.25g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入10mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h.
3)在80℃下，氮气保护，加入3,5-二氯苯基异氰酸酯2.19g（摩尔质量为羟基和氨基的2.5倍量），反应12h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物。
5)在60℃下，真空干燥48h即获得产率为73.45%的壳聚糖3,5-二氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例14：
壳聚糖3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物(n)的合成步骤：
1)在80℃下，0.30g完全脱乙酰化壳聚糖（分子量50000～300000），搅拌并且真空干燥4h。
2)氮气保护下，加入12mL无水二甲基亚砜（DMSO)，溶胀48h。
3)在70℃下，氮气保护，加入3,5-二甲基苯基异氰酸酯1.57mL（摩尔质量为羟基和氨基的2.0倍量），反应12h。
4)将上述溶液采用滴管滴加到160mL甲醇溶剂中，析出壳聚糖衍生物沉淀物。
5)在60℃下，真空干燥48h，即获得产率为56.30%的壳聚糖3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
实施例1-14中所合成的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物的结构如式(3)所示。
本发明运用核磁共振氢谱在氘带DMSO中于80℃下对所获得壳聚糖衍生物进行了测试分析，所获的各衍生物的核磁氢谱分析如下：
a(4-OCH3): 3.1～5.2ppm(glucose protons and–OCH3(16H)),6.1～7.4ppm(phenyl-H(12H)), 5.8ppm(urea-H(1H), 7.9ppm(urea-H(1H))， 8.6～8.9ppm(carbamate-H(2H)).
b(4-CH2CH3): 3.1～5.2ppm(glucose protons(7H)), 6.5～7.5ppm(phenyl-H(12H)), 5.9ppm(urea-H(1H), 8.0ppm(urea-H(1H))， 8.6～8.9ppm(carbamate-H(2H)).
c(4-CH3): 3.6～4.9ppm(glucose protons(7H)),6.5～7.5ppm(phenyl-H(12H)), 5.9ppm(urea-H(1H), 8.0ppm(urea-H(1H)), 8.7～8.9ppm(carbamate-H(2H)).
d(4-H): 3.2～5.5ppm(glucose protons(7H)), 6.5～7.6ppm(phenyl-H(15H)), 5.9ppm(urea-H(1H), 8.0ppm(urea-H(1H))8.5～9.1ppm(carbamate-H(2H)).
e(4-F): 3.3～5.4ppm(glucose protons(7H)),6.4～7.6ppm(phenyl-H(12H)), 5.8ppm(urea-H(1H), 8.2ppm(urea-H(1H)),.8.7～9.4ppm(carbamate-H(2H)).
f(4-Cl): 3.2～5.4ppm(glucose protons(7H)), 6.8～7.8ppm(phenyl-H(12H)), 5.8ppm(urea-H(1H), 8.3ppm urea-H(1H)),8.8～9.4ppm(carbamate-H(2H)).
g(4-Br): 3.2～5.2ppm(glucose protons(7H)), 6.8～7.7ppm(phenyl-H(12H)), 5.9ppm(urea-H(1H), 8.3ppm(urea-H(1H)),8.8～9.4ppm(carbamate-H(2H)).
h(4-NO2): 3.3～5.5ppm(glucose protons(7H)), 6.8～8.5ppm(phenyl-H(12H)), 6.1ppm(urea-H(1H), 8.8ppm(urea-H(1H)),9.5～10.1ppm(carbamate-H(2H)).
i(2-Cl): 3.3～5.4ppm(glucose protons(7H)), 6.5～7.7ppm(phenyl-H(12H)), 7.7～8.5ppm(carbamate-H and urea-H(4H)).
j(3-Cl): 3.3～5.4ppm(glucose protons(7H)), 6.5～7.5ppm(phenyl-H(12H)), 5.9ppm(urea-H(1H), 8.3ppm(urea-H(1H))，8.9～9.4ppm(carbamate-H(2H)).
k(2-CH3).: 1.7～2.3ppm(CH3(9H)), 3.3～5.4ppm(glucose protons(7H)),6.7～7.5ppm(phenyl-H(12H)), 5.9ppm(urea-H(1H),7.6ppm(urea-H(1H)), 7.9～8.6ppm(carbamate-H(2H)).
l(3-CH3).: 1.7～2.3ppm(CH3(9H)), 3.3～5.2ppm(glucose protons(7H)),6.5～7.5ppm(phenyl-H(12H)), 5.9ppm(urea-H(1H), 8.0ppm(urea-H(1H))， 8.5～9.2ppm(carbamate-H(2H)).
m(3,5-2Cl).: 3.3～5.2ppm(glucose protons(7H)), 6.4～7.6ppm(phenyl-H(9H)), 5.9ppm(urea-H(1H), 8.4ppm(urea-H（1H）),9.2～9.7ppm(carbamate-H(2H)).
n(3,5-2CH3).: 1.6～2.4ppm(CH3(18H)), 3.3～5.2ppm(glucoseprotons(7H)), 6.3～7.3ppm(phenyl-H(9H)), 5.9ppm(urea-H(1H),7.9ppm(urea-H(1H))， 8.5～9.2ppm(carbamate-H(2H)).
实验例1
对上述实施例1-14中所获得的各壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物的手性识别能力进行评价。
将壳聚糖衍生物溶解在5-10mL良溶剂（带有4-OCH3，4-NO2和3-Cl侧链的壳聚糖衍生物是采用DMSO作为涂敷溶剂，而其他所有衍生物均采用THF作为涂敷溶剂）中，采用涂敷法将其涂覆在氨丙基硅胶表面，利用旋蒸仪蒸干溶剂，直至壳聚糖衍生物溶液全部涂敷完为止，即制备成壳聚糖手性固定相。
将所述壳聚糖手性固定相填装成色谱柱。通过采用正己烷/异丙醇（V/V,90/10）分散涂敷完的样品，采用滴加液体石蜡和超声的方法增加样品在正己烷/异丙醇中的分散性，在40MPa压力下将涂敷的样品拍到色谱柱中制备成壳聚糖类液相色谱手性柱。采用一系列对映体评价了本发明的壳聚糖衍生物的手性识别能力，结果如表1和表2所示。各对映体的结构式如式3所示。
表1.对映体在10种壳聚糖类手性固定相上的拆分结果
备注：色谱柱:25×0.20cm(i.d.);流速:0.1mL/min;流动相:正己烷/2-丙醇(90/10,v/v).检测波长:254nm;括号中的符号表示先洗脱异构体的旋光性；
表2.对映体在4种壳聚糖类手性固定相上的拆分结果
备注：色谱柱:25×0.20cm(i.d.);流速:0.1mL/min;流动相:正己烷/2-丙醇(90/10,v/v).检测波长:254nm;括号中的符号表示先洗脱异构体的旋光性；
表1和2中，k1'[=(t1-t0)/t0]和k2'[=(t2-t0)/t0是容量因子，表示被分离的对映体在手性固定相上的保留情况，k1'小说明化合物与手性固定相之间作用力小，第一个峰出的很快；否则相反。而α(=k2'/k1')是分离因子，表示被分离的对映体两个峰之间的分离情况。α=1说明手性固定相对对映体没有手性识别，在UV检测器上是一个色谱峰，在CD检测器上也是一个色谱峰；α≈1说明手性固定相对对映体有手性识别，在UV检测器上是一个色谱峰，而CD检测器上是两个色谱峰；α>1说明手性固定相对对映体有较好的手性识别，在UV检测器上是两个色谱峰，而CD检测器上也是两个色谱峰。
如表1和2所示，本发明实施例1-14中合成的14种壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物对各种对映体显示了良好的手性识别能力，且α≈1或者α﹥1。其中，安息香在由实施例6中得到的壳聚糖-4-氯苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物制备的手性固定相上的色谱拆分图参见图1；黄烷酮在由实施例14中得到的壳聚糖-3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物制备的手性固定相上的色谱拆分图参见图2。
实验例2
测定了实施例1-14中所制备的壳聚糖类衍生物在不同溶剂中的溶解性，结果如表2所示。
表3.壳聚糖衍生物溶解性测试结果
(+)表示完全溶解，（-）表示不溶解，（±）溶胀或部分溶解
如上表可知，相比于壳聚糖原料（表3中的最后一行），本发明的壳聚糖类衍生物在多种溶剂中都具有良好的溶解性。而且本发明的壳聚糖类衍生物不溶于氯仿，由其制备的涂敷型手性固定相可在以氯仿作为流动相的色谱条件下使用。
Claims (13)
1.壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物的制备方法，该方法包括：
采用壳聚糖与苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯反应，合成壳聚糖上的羟基和氨基完全地转化为氨基甲酸酯和脲基的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
2.权利要求1的制备方法，其中，作为反应原料的壳聚糖是完全脱乙酰化的壳聚糖。
3.权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其中，作为反应原料的壳聚糖的分子量在50000～300000。
4.权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其中，所述苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯选自：苯基异氰酸酯、4-甲氧基苯基异氰酸酯、4-乙基苯基异氰酸酯、4-甲基苯基异氰酸酯、4-氟苯基异氰酸酯、4-氯苯基异氰酸酯、4-溴苯基异氰酸酯、4-硝基苯基异氰酸酯、2-氯苯基异氰酸酯、2-甲基苯基异氰酸酯、3-氯苯基异氰酸酯、3-甲基苯基异氰酸酯、3,5-二氯苯基异氰酸酯和3,5-二甲基苯基异氰酸酯中的一种或多种。
5.权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其中，苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯的摩尔质量是壳聚糖的羟基和氨基的总摩尔质量的1.5-3倍。
6.权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其包括以下步骤：
(1)向壳聚糖原料中加入反应溶剂进行溶胀，
(2)加入所述苯基异氰酸酯或具有侧链的苯基异氰酸酯，在反应温度为40-150℃反应，反应时间为0.5-24小时，和
(3)将反应产物滴入隔离溶剂中，形成壳聚糖类衍生物沉淀析出。
7.权利要求6所述的制备方法，其还包括以下步骤：
在上述步骤(1)之前，将壳聚糖原料在60-100℃真空干燥；和/或在步骤(2)之前，加入氢键消除剂。
8.权利要求6-7中任一项所述的制备方法，其中，在步骤（1）中，所述的壳聚糖原料中加入反应溶剂配成质量浓度为0.013～0.025g/mL，反应溶剂为二甲基亚砜（DMSO）；
9.权利要求6-8中任一项所述的制备方法，其中，氢键消除剂是氯化锂。
10.权利要求6-9中任一项所述的制备方法，其中，所述的隔离溶剂选自甲醇、乙醚和乙酸乙酯中的一种或多种。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的制备方法得到的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
12.根据权利要求11的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物用于制备涂敷型高效液相手性固定相的用途。
13.涂敷型高效液相手性固定相，其包含根据权利要求11的壳聚糖类苯基氨基甲酸酯-脲基衍生物。
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