CN105199011B

CN105199011B - 壳聚糖‑二（芳香基氨基甲酸酯）‑（烃氧基甲酰胺）、其手性固定相及其制备方法

Info

Publication number: CN105199011B
Application number: CN201510713105.6A
Authority: CN
Inventors: 柏正武; 冯子维; 陈伟
Original assignee: Wuhan Institute of Technology
Current assignee: Wuhan Institute of Technology
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2035-10-28
Also published as: CN105199011A

Abstract

本发明涉及壳聚糖‑二(芳香基氨基甲酸酯)‑(烃氧基甲酰胺)及其制备方法以及手性固定相及其制备方法，步骤如下：壳聚糖‑烃氧基甲酰胺的氨基甲酸酯化：将壳聚糖‑烃氧基甲酰胺溶解在氯化锂的N,N‑二甲基乙酰胺溶液中，加入过量的含不同取代基的苯基异氰酸酯，其中含不同取代基的苯基异氰酸酯的摩尔数与壳聚糖‑烃氧基甲酰胺重复单元摩尔数之比不低于3:1，于80‑95℃下反应不少于24小时生成壳聚糖衍生物，即壳聚糖‑二(芳香基氨基甲酸酯)‑(烃氧基甲酰胺)。本发明的有益效果在于：一、本发明制备的手性固定相有很强的手性分离性能，二、本发明中的手性分离材料有较好的耐用性。

Description

壳聚糖-二（芳香基氨基甲酸酯）-（烃氧基甲酰胺）、其手性固定相及其制备方法

技术领域

本发明涉及用于手性分离的功能材料，具体涉及壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)及其制备方法以及含有壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的手性固定相及其制备方法。

背景技术

“手性”作为自然界的固有特征之一，许多自然现象都与分子的手性有关。手性化合物的两个对映体会以不同的方式与生物大分子相互作用，从而产生不同的生物活性。例如有些手性药物的一个对映体能有效治疗疾病，而另一个对映体表现出没有活性或者有生物毒性[(1).Forjan D.M.,Kontrec D, V.Chirality,2006,18,857-869]。由此可见，手性化合物的拆分对于生物学和药学的研究具有重要的意义。获得手性化合物单一对映体的方法通常有：手性源合成法、不对称合成法和外消旋体拆分法三种方法。以使用手性固定相(Chiral Stationary Phase,CSP)为基础的液相色谱法是外消旋体拆分法中对映体批量分离的最效方法之一[(2).Ikai T,Yamamoto C,Kamigaito M,et al.Journal of theChemical Society.,Japan,2007,7(2):91-103.(3).Tang S.W.,Liu G.H.,Li X.F.,etal.Journal of Separation Science.,2011,34,1763-1771]。多糖衍生物类CSP以手性识别范围广、来源丰富且负载量高，已成为应用最多、最有效的手性固定相[(4).Al-Othman ZA,Al-Warthan A.,Ali I.Journal of Separation Science,2014,37(9-10):1033-1057.(5).Gebreyohannes K G.,McGuffin V L.Journal of Chromatography.A,2010,1217,5901-5912]。但这类涂覆型天然多糖衍生物手性固定相一般不能在含四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯等流动相中使用[(6).Welch C.J.,Fairchild J.,Sajonz P.,Chirality,2007,19,607–611]，这其中包括已经商业化的用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和纤维素-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)制备的固定相。

甲壳素是产量仅次于纤维素的天然高分子聚合物，具有光学活性，广泛存在于许多低等动物的外壳和低等植物的细胞壁中。因为结构与纤维素非常相似，在很久以前甲壳素就被尝试用作高效液相色谱的手性固定相[(7).Zhang L L,Shen J,Zuo W L,etal.Chemistry Letters.,2014,43,92-94]。Okamoto等[(8).Yamamoto C.,Hayashi T.,Okamoto Y.,Journal of Chromatography A,2003，1021,83–91]曾用一系列异氰酸酯修饰甲壳素来制备手性固定相，因甲壳素衍生物在绝大多数有机溶剂中的溶解度较小，这些固定相在应用时表现出较好的稳定性。但这些固定相总的分离性能稍逊于纤维素和直链淀粉衍生物类固定相。还有一些文献报道了用脱乙酰度不高的壳聚糖制备手性固定相，由于壳聚糖的脱乙酰度不高，其衍生物的结构不够规整，不利于手性分离。

总之，至今为止，涂覆型多糖衍生物手性固定相仍然面临着既保证有优越的分离性能，又能够在较为广泛的有机溶剂流动相中使用的问题。有些固定相能够在含一定比例的氯仿和乙酸乙酯的流动相中使用，但氯仿或乙酸乙酯所占的比例一般都不高[(9).Yamamoto C.,Fujisawa M.,Kamigaito M.,Okamoto Y.,Chirality,2008,20,288–294]。

发明内容

针对现有涂覆型多糖衍生物手性固定相耐受性差等劣势，提供一种壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)及其制备方法以及手性识别及分离性能强且对有机溶剂耐用性好的含有壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的手性固定相及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)，其结构式如下：

其中R₁为以下基团中任意一种：

m＝1-4；-CH₂(CH₂)_yCH₃，y＝0-6；

R₂为以下基团中任意一种：

聚合度n≥10。

所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的制备方法，其特征在于步骤如下：

壳聚糖-烃氧基甲酰胺的氨基甲酸酯化：将壳聚糖-烃氧基甲酰胺溶解在氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液中，加入过量的含不同取代基的苯基异氰酸酯，其中含不同取代基的苯基异氰酸酯的摩尔数与壳聚糖-烃氧基甲酰胺重复单元摩尔数之比不低于3:1，于80-95℃下反应不少于24小时生成壳聚糖衍生物，即壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)。

按上述方案，所述的含不同取代基的苯基异氰酸酯结构式为：

其中R₂为以下基团中任意一种：

按上述方案，所述的壳聚糖-烃氧基甲酰胺，其结构式如下：

其中：n≥10；

R₁为以下基团中任意一种：

m＝1-4；-CH₂(CH₂)_yCH₃，y＝0-6；

按上述方案，所述的壳聚糖-烃氧基甲酰胺的制备方法，其步骤如下：

1)壳聚糖氨基的部分酰基化：将脱乙酰度在98％以上的壳聚糖溶于稀盐酸水溶液中，或者将分子量小的水溶性的壳聚糖直接溶于蒸馏水中，再向所得溶液中加入过量的氯甲酸酯和适量甲醇，以三级胺为缚酸剂，调控反应体系的pH，于0-40℃下反应不少于2小时，得到部分N-酰化壳聚糖；

2)部分N-酰化壳聚糖的完全酰基化：将部分N-酰化壳聚糖溶解在氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液中，加入过量的氯甲酸酯和适量的甲醇，以三级胺为缚酸剂，调控反应体系的pH，于0-40℃下反应不少于2小时生成完全N-酰化的壳聚糖-烃氧基甲酰胺。

按上述方案，所述的三级胺为三乙胺。

按上述方案，步骤1)和步骤2)所述pH在5-6。

按上述方案，步骤1)和步骤2)中所述的氯甲酸酯总的摩尔数与步骤1)中所使用的壳聚糖重复单元的摩尔数之比不小于3：1。

按上述方案，步骤1)中所述加入甲醇的量以壳聚糖不从溶液中析出为限；步骤2)中所述的部分N-酰化壳聚糖溶于氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液中，其中氯化锂的浓度能使部分N-酰化壳聚糖溶解即可，所述的甲醇的量以使部分N-酰化壳聚糖不析出为限。

按上述方案，氯化锂的浓度能使壳聚糖-烃氧基甲酰胺溶解即可。

本发明壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的制备过程如下所示：

其中R₁为以下基团中任意一种：

m＝1-4；-CH₂(CH₂)_yCH₃，y＝0-6；

R₂为以下基团中任意一种：

聚合度n≥10。

本发明还提供一种手性固定相，其含有所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)。

所述的手性固定相的制备方法，其特征在于：将壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)溶于强极性有机溶剂中，再将所得溶液与硅胶或羟基被封端的硅胶相混合，随后减压蒸出溶剂，壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)沉积在硅胶或羟基被封端的硅胶的表面，即得到手性固定相。

按上述方案，所述强极性有机溶剂为四氢呋喃、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜中的任意一种。

本发明的有益效果在于：

一、本发明制备的手性固定相有很强的手性分离性能，这是因为：

(1)、本发明选用脱乙酰度为98％以上的壳聚糖为手性原料制备固定相，所合成的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)上残留的乙酰基很少，因而其结构规整，有利于手性识别；

(2)、制备的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的壳聚糖重复单元的2位上生成烃氧基甲酰胺，在3位和6位上生成氨基甲酸酯，烃氧基甲酰胺上连接的基团与氨基甲酸酯上连接的基团可以多样化，这些多样化的基团在电子效应及空间位阻方面能相互补充，从而使所制备的分离材料能识别更多的手性小分子，扩大其所能识别手性化合物的范围；

二、本发明中的手性分离材料有较好的耐用性

现有的纤维素或直链淀粉衍生物涂覆型固定相，不能在含氯仿、乙酸乙酯等溶剂的流动相中使用。本发明制备的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)在绝大多数有机溶剂中难以溶解，与现有的已商业化的多糖衍生物手性固定相相比，本发明制备的固定相能在更多的有机溶剂中使用，这些材料不需要经过共价交联，对有机溶剂流动相就有很好的耐用性。

附图说明

图1为实施例1所制备的壳聚糖-乙氧基甲酰胺(B)和制备其所用的壳聚糖(A)的红外谱对比图，用KBr压片法测试；

图2为实施例1所制备的壳聚糖-乙氧基甲酰胺的¹H NMR谱图；600MHz，氘代三氟乙酸为溶剂，测试温度25℃；

图3为实施例6所制备的壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)的红外谱图.用KBr压片法测试；

图4为实施例6所制备的壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)的¹H NMR谱图.600MHz,氘代二甲亚砜为溶剂，测试温度为90℃；

图5为实施例所制备的CSP3、CSPa和CSPb上分离样品总个数和基线分离个数的统计图；

图6为实施例6所制备的CSP1在经历不同有机溶剂流动相后分离样品总个数和基线分离个数的统计图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

本发明实施例所用硅胶(球形，平均粒径7μm，孔径)购自Daiso Co.，Ltd.

N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)在使用前经分子筛干燥三次，氯化锂在使用前于140℃下真空干燥24小时，或300℃煅烧3小时以上。

硅胶表面羟基的封端按文献[(10).Lai X.-H.,Bai Z.-W.,Ng S.-C.,et al,Chirality,2004,16,592-597]方法完成。

用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)制备的固定相被公认为具有最强的手性分离能力，为比较本发明中制备的固定相和这两种固定相的手性分离性能，发明人还参照文献[(11).Chen J.,Duan R.,Chen W.,et al,Current Analytical Chemistry,2013,9,128-137]中的方法制备了直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。本发明中使用的壳聚糖的制备及壳聚糖分子量的测定参照文献[(12)柏正武等，壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)及其制备[P],申请号：201410594564.2]完成。

绝大多数壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)都能吸附水分子，因此在计算元素值时，要考虑吸附水分子的存在。

实施例1

壳聚糖-乙氧基甲酰胺的合成

1)将1.50g(9.32mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量10万、脱乙酰度100％)加入到250mL的三口烧瓶中，加入20.00g已配制的1.2wt％的稀盐酸溶液，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。再称取25.00g甲醇，加入约20.00g甲醇于三口烧瓶内，机械搅拌均匀后将三口烧瓶置于冰水浴中(温度约4℃)。待溶液内温度下降稳定后快速加入2.01g(18.64mmol)的氯甲酸乙酯。在4℃下反应约15min后称取1.88g(18.64mmol)的三乙胺(三乙胺与氯甲酸乙酯的摩尔之比为1:1)与剩余的甲醇混合，加入适量的三乙胺调节反应液的pH约为6，反应过程中间断的加入三乙胺调节反应液pH约为6直至加入完毕。在4-5℃下反应5h。反应完毕后，将反应液倾入250mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥，得2.02g部分N-酰化壳聚糖，产率：93％。

2)称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入20mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入2.00g干燥的部分N-酰化壳聚糖，搅拌溶解24h，然后拆除油浴换成冰水浴控制温度在4-5℃范围内，待温度稳定后加入0.96(29.96mmol)干燥的甲醇，再加入1.01g(9.32mmol)的氯甲酸乙酯。称取0.94g(9.32mmol)干燥的三乙胺(三乙胺与氯甲酸乙酯的摩尔之比为1:1)分若干次加入，搅拌反应8h，反应完毕后，将反应液倾入250mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥。红外图谱如附图1(B)：IR(KBr,cm^-1)υ:3487-3303(-OH,-NH-),2977-2875(-C-H),1707,1549,1248(-OCONH-)；图1(B)的1707处出现较强的酯基吸收峰，表明壳聚糖被乙氧基甲酰化，生成了酯基。¹H NMR图如附图2所示：¹H NMR(600MHz,25℃,CF₃COOD,δ/ppm):5.35-3.62(m,9H,氨基葡萄糖骨架H和乙基亚甲基H),1.65-1.08(m,3H,乙基的甲基H)；元素分析(％)：计算值(C₉H₁₅NO₅·1.2H₂O)_n：C 42.68,H 7.56,N 5.53；实测值C 42.01,H 7.08,N 5.28。

实施例2

壳聚糖-异丙氧基甲酰胺的合成

1)将1.00g(6.21mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量25万、脱乙酰度100％)加入到250mL的三口烧瓶中，加入30.88g已配制的1.0wt％的稀盐酸溶液，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。再称取53.40g甲醇，加入约45.00g甲醇于三口烧瓶内，机械搅拌均匀后将三口烧瓶置于冰水浴中(温度约4℃)。待溶液内温度下降稳定后快速加入6.09g(49.69mmol)的氯甲酸异丙酯。在4℃下反应约18min后称取5.02g(49.69mmol)的三乙胺(三乙胺与氯甲酸异丙酯的摩尔之比为1:1)与剩余的甲醇混合，加入适量的三乙胺调节反应液的pH约为6，反应过程中间断地加入三乙胺调节反应液pH约为6直至加入完毕。在4-5℃下反应8h。反应完毕后，将反应液倾入250mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥，得1.40g部分N-酰化壳聚糖，产率：91％。

2)称取1.40g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入15mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.20g干燥的部分N-酰化壳聚糖，搅拌溶解 24h，然后拆除油浴换成室温(25-26℃)，待温度稳定后加入1.20(37.45mmol)干燥的甲醇,再加入2.28g(18.60mmol)的氯甲酸异丙酯。称取1.88g(18.60mmol)的干燥的三乙胺分若干次加入，搅拌反应12h.反应完毕后，将反应液倾入100mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥。IR(KBr,cm^-1)υ:3479-3319(-OH,-NH-),3087-2878(-C-H),1708,1552,1251(-OCONH-)；¹H NMR：¹H NMR(600MHz,25℃,CF₃COOD,δ/ppm):5.58-3.62(m,8H,氨基葡萄糖骨架H和异丙基次甲基H),1.92-1.01(m,6H,异丙基两个甲基H)；元素分析(％)：计算值(C₁₀H₁₇NO₅·2.5H₂O)_n：C 41.09,H 7.59,N 4.79；实测值C 41.20,H 7.37,N 4.82。

实施例3

壳聚糖-正戊氧基甲酰胺的合成

1)将1.40g(8.69mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量35万、脱乙酰度98％)加入到250mL的三口烧瓶中，加入36.95g已配制的0.87wt％的稀盐酸溶液，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。再称取36.08g甲醇，加入约90％甲醇于三口烧瓶内，机械搅拌均匀后将三口烧瓶移至冰水浴中(温度约6℃)。待溶液内温度下降稳定后快速加入10.18g(69.52mmol)的氯甲酸正戊酯。搅拌30min混合均匀后拆冰水浴使反应在26-27℃下进行，称取7.02g(69.52mmol)的三乙胺(三乙胺与氯甲酸正戊酯的摩尔之比为1:1)与剩余的甲醇混合，加入适量的三乙胺调节反应液的pH约为6，反应过程中间断地加入三乙胺调节反应液pH约为6直至加入完毕。在26-27℃下反应8h。反应完毕后，将反应液倾入250mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥，得1.96g部分N-酰化壳聚糖，产率：82％。

2)称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入50mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.89g干燥的部分N-酰化壳聚糖，搅拌溶解24h，然后降低温度控制温度在26-27℃范围内，待温度稳定后加入0.54g(16.85mmol)干燥的甲醇,再加入4.58g(30.41mmol)的氯甲正戊酸酯。称取3.07g(30.41mmol)的干燥的三乙胺(三乙胺与氯甲酸正戊酯的摩尔之比为1:1)分若干次加入，搅拌反应12h.反应完毕后，将反应液倾入250mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥。IR(KBr,cm^-1)υ:3483-3328(-OH,-NH-),3087,2869(-C-H),1703,1543,1251(-OCONH-)；¹H NMR(CF₃COOD,δ/ppm):5.28-3.78(m,9H,氨基葡萄糖骨架H和-OCH₂(CH₂)₃CH₃),1.85-1.68(m,2H,-OCH₂CH₂(CH₂)₂CH₃)，1.55-1.36(m,4H, -OCH₂CH₂(CH₂)₂CH₃)，1.05-0.92(m,3H,正戊基的甲基H)；元素分析(％)：计算值(C₁₂H₂₁NO₅·1.2H₂O)_n：C 48.54,H 7.94,N 4.72；实测值C 48.22,H 7.65,N 4.63。因壳聚糖的脱乙酰度接近100％，所以壳聚糖衍生物元素分析理论值就按完全脱乙酰的壳聚糖衍生物重复单元分子式进行计算。

实施例4

壳聚糖-苄氧基甲酰胺的合成

1)将1.11g(6.89mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量5万、脱乙酰度99％)加入到250mL的三口烧瓶中，加入36.05g已配制的1.0wt％的稀盐酸溶液，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。再称取35.55g甲醇，加入约30.00g甲醇于三口烧瓶内，机械搅拌均匀后转移三口烧瓶到冰水浴中(温度约5℃)。待溶液内温度下降稳定后快速加入3.15g(18.45mmol)的氯甲酸苄酯。在5℃搅拌混合约30min后,拆除冰水浴在室温(24-25℃)下反应。称取1.86g(18.45mmol)的三乙胺(三乙胺与氯甲酸苄酯的摩尔之比为1:1)与剩余的甲醇混合，加入适量的三乙胺调节反应液的pH约为6，反应过程中间断的加入三乙胺调节反应液pH约为6直至加入完毕。在此室温下反应8h。反应完毕后，将反应液倾入250mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥，得1.82g部分N-酰化壳聚糖，产率：89％。

2)称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入40mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.50g干燥的部分N-酰化壳聚糖，搅拌溶解24h，然后拆除油浴控制温度在24-25℃范围内，待温度稳定后加入1.43g(44.63mmol)干燥的甲醇,再加入2.73g(16.00mmol)的氯甲酸苄酯。称取1.61g(16.00mmol)的干燥的三乙胺(三乙胺与氯甲酸苄酯的摩尔之比为1:1)分若干次加入，搅拌反应12h.反应完毕后，将反应液倾入250mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥。IR(KBr,cm^-1)υ:3480-3314(-OH,-NH-),3065-2878(-C-H),1703,1548,1251(-OCONH-)；¹H NMR(600MHz,25℃,CF₃COOD,δ/ppm):5.81-3.50(m,9H,氨基葡萄糖骨架H和苄基亚甲基H),7.68-7.18(m,5H,苄基苯环H)；元素分析(％)：计算值(C₁₄H₁₇NO₅·1.5H₂O)_n：C 51.88,H 6.28,N 4.32；实测值C52.33,H 6.53,N 3.82。

实施例5

壳聚糖-环己氧基甲酰胺的合成

1)将1.00g(6.21mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量0.2万、脱乙酰度98％)加入到250mL的三口烧瓶中，加入70.00g蒸馏水，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。再称取80.00g甲醇，加入约70.00g甲醇于三口烧瓶内，机械搅拌均匀后将三口烧瓶置于冰水浴中(温度约4℃)。待溶液内温度下降稳定后快速加入10.09g(62.10mmol)的氯甲酸环己酯。在4℃下反应约20min后拆除冰浴在28℃下反应。称取6.28g(62.10mmol)的三乙胺(三乙胺与氯甲酸环己酯的摩尔之比为1:1)与剩余的甲醇混合，加入适量的三乙胺调节反应液的pH约为5，反应过程中间断的加入三乙胺调节反应液pH约为5直至加入完毕。在28℃下反应10h。反应完毕后，将反应液倾入250mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥，得1.38g部分N-酰化壳聚糖，产率：77％。

2)称取1.38g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入20mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.38g干燥的部分N-酰化壳聚糖，搅拌溶解24h，然后降低油浴温度为28℃，待温度稳定后加入0.42(12.42mmol)干燥的甲醇,再加入2.52g(15.53mmol)的氯甲酸环己酯。称取1.57g(15.53mmol)的干燥的三乙胺分若干次加入，搅拌反应12h.反应完毕后，将反应液倾入100mL乙醇溶液中搅拌2h，过滤，再重复若干次直至将产物洗至中性，干燥。IR(KBr,cm^-1)υ:3483-3254(-OH,-NH-),3071-2865(-C-H),1702,1555,1251(-OCONH-)；¹H NMR(600MHz,25℃,CF₃COOD,δ/ppm):5.57-3.02(m,8H,氨基葡萄糖骨架H和环己基次甲基H),1.80-1.43(m,10H,环己基五个亚甲基H)；元素分析(％)：计算值(C₁₃H₂₁NO₆·H₂O)_n：C 51.14,H 7.59,N 4.59；实测值C 51.35,H 7.92,N 4.67。

实施例6

壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)的合成

称取2.50g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入25mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.70g(7.29mmol重复单元)干燥的实施例1制备的壳聚糖-(乙氧基甲酰胺)，溶解24h，再加入4.90mL(36.45mmol)4-甲基苯基异氰酸酯(4-甲基苯基异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为5:1)及催化量的DMAP，继续反应24小时。趁热将反应液逐滴加入到25mL蒸馏水和100mL甲醇混合液中，出现沉淀，过滤，将固体溶解在18mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到20mL蒸馏水和80mL甲醇混合液中重沉淀，重沉淀的过程重复三次。最后所得固体干燥，得2.47g壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，产率：68％；红外谱图如附图3所示。IR(KBr,cm^-1)υ：3389-3331(-NH-),3031,1596,814(-Ph-),2977-2866(-C-H),1720(-CO₂-),1311-1055(C-O-C),1570-1510(N-H)；其¹H NMR谱图如附图4所示，¹H NMR(600MHz,90℃,氘代DMSO为溶剂,δ/ppm):0.9(m,3H,乙基中的甲基H)；2.21-2.16(m,6H,与两个苯环相连接的两个甲基H)；3.30-4.91(m,9H,壳聚糖重复单元骨架和乙基中亚甲基H)；6.34(m,1H,2位乙氧基甲酰胺中的H)；6.97-7.26(m,8H,两个苯环上的H)；8.70-8.89(m,2H,氨基甲酸酯中两个酰胺中的N-H)。积分面积比与相应的质子个数比基本吻合。说明所制备的材料为壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)；元素分析(％)：计算值(C₂₅H₂₉N₃O₈·2.50H₂O)_n C 55.14,H 6.29,N 7.72；实测值C 55.52,H6.09,N 7.55。

称取本实施例制备的壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)0.64g于50mL小烧杯中，加入30mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌至溶解。称取2.56g干燥的3-氨基丙基硅胶于100mL茄形瓶中，向其中加入10mL上述高分子溶液，超声使硅胶在其中分散均匀，保持温度在55℃，用旋转蒸发仪缓慢均匀地蒸出DMF。重复上述过程，共三次。真空干燥至恒重，得到白色细粉末状固体，即为手性固定相，称之为CSP1，壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)在涂覆中的投料量为20％。

实施例7

壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)的合成

按照实施例6中制备壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)的方法，以4-三氟甲氧基苯基异氰酸酯代替4-甲基苯基异氰酸酯，异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为3:1，制备出3.26g壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，产率:70％。

按实施例6中的方法，称取0.64g本实施例制备的壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)代替壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.56g 3-氨基丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP2)，壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)在涂覆中的投料量为20％。

实施例8

壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丙氧基甲酰胺)的合成

称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入20mL干燥的DMAc，加热使LiCl 完全溶解，保持温度在80℃，加入1.35g(5.46mmol重复单元)干燥的实施例2制备的壳聚糖-(异丙氧基甲酰胺)，溶解24h，再加入4.41mL(32.76mmol)4-甲基苯基异氰酸酯(4-甲基苯基异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为6:1)及催化量的DMAP，继续反应30小时。趁热将反应液逐滴加入到25mL蒸馏水和100mL甲醇混合液中，出现沉淀，过滤，将固体溶解在18mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到20mL蒸馏水和80mL甲醇混合液中重沉淀，重沉淀的过程重复三次。最后所得固体干燥，得1.97g壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丙氧基甲酰胺)，产率：68％。

按实施例6中的方法，称取0.64g本实施例制备的壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丙氧基甲酰胺)代替壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.56g 3-氨基丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP3)，壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丙氧基甲酰胺)在涂覆中的投料量为20％。

实施例9

壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)的合成

称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入20mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.50g(5.45mmol重复单元)干燥的实施例3制备的壳聚糖-(正戊氧基甲酰胺)，溶解36h，再加入3.07mL(22.16mmol)3,5-二甲基苯基异氰酸酯(3,5-二甲基苯基异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为4:1)及催化量的DMAP，继续反应24小时。趁热将反应液逐滴加入到25mL蒸馏水和100mL甲醇混合液中，出现沉淀，过滤，将固体溶解在18mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到20mL蒸馏水和80mL甲醇混合液中重沉淀，重沉淀的过程重复六次。最后所得固体干燥，得2.33g壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)，产率：75％。

按实施例6中的方法，称取0.64g本实施例制备的壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)代替壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.56g 3-氨基丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP4)，壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)，在涂覆中的投料量为20％。

实施例10

壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)的合成

按照实施例9中制备壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)的方法，以4-氯苯基异氰酸酯代替3,5-二甲基苯基异氰酸酯，异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为6:1，制备出2.28g壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)，产率：72.5％。

按实施例6中的方法，称取0.64g本实施例制备的壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)代替壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.56g 3-氨基丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP5)，壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(正戊氧基甲酰胺)，在涂覆中的投料量为20％。

实施例11

壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基甲酰胺)的合成

称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入25mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.20g(4.07mmol重复单元)干燥的实施例4制备的壳聚糖-(苄氧基甲酰胺)，溶解24h，再加入2.78mL(20.33mmol)3-氯-4-甲基苯基异氰酸酯(3-氯-4-甲基苯基异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为5:1)及催化量的DMAP，继续反应48小时。趁热将反应液逐滴加入到25mL蒸馏水和100mL甲醇混合液中，出现沉淀，过滤，将固体溶解在18mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到20mL蒸馏水和80mL甲醇混合液中重沉淀，重沉淀的过程重复三次。最后所得固体干燥，得1.61g壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基甲酰胺)，产率：63％。

按实施例6中的方法，称取0.64g本实施例制备的壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基甲酰胺)代替壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.56g 3-氨基丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP6)，壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基甲酰胺)，在涂覆中的投料量为20％。

实施例12

壳聚糖-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基甲酰胺)的合成

按照实施例11中制备壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基基甲酰胺)的方法，以3,5-二氯苯基异氰酸酯代替3-氯-4-甲基苯基异氰酸酯，异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为4:1，制备出1.90g壳聚糖-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基甲酰胺).产率:70％。

按实施例6中的方法，称取0.64g本实施例制备的壳聚糖-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基甲酰胺)代替壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.56g 3-氨基丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP7)，壳聚糖-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)-(苄氧基甲酰胺)，在涂覆中的投料量为20％。

实施例13

壳聚糖-二(4-氯-3-三氟甲基苯基氨基甲酸酯)-(环己氧基甲酰胺)的合成

称取2.50g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入25mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.20g(4.18mmol重复单元)干燥的实施例5制备的壳聚糖-(环己氧基甲酰胺)，溶解24h，再加入3.31mL(20.90mmol)4-氯-3-三氟甲基苯基异氰酸酯(4-氯-3-三氟甲基苯基异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为5:1)及催化量的DMAP，继续反应48小时。趁热将反应液逐滴加入到25mL蒸馏水和100mL甲醇混合液中，出现沉淀，过滤，将固体溶解在18mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到20mL蒸馏水和80mL甲醇混合液中重沉淀，重沉淀的过程重复三次。最后所得固体干燥，得2.07g壳聚糖-二(4-氯-3-三氟甲基苯基氨基甲酸酯)-(环己氧基甲酰胺)，率:65％。

按实施例6中的方法，称取0.64g本实施例制备的壳聚糖-二(4-氯-3-三氟甲基苯基氨基甲酸酯)-(环己氧基甲酰胺)代替壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(乙氧基甲酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.56g 3-氨基丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP8)，壳聚糖-二(4-氯-3-三氟甲基苯基氨基甲酸酯)-(环己氧基甲酰胺)，在涂覆中的投料量为20％。

实施例14

手性识别及分离性能测试：

分别将实施例6中的固定相CSP1和实施例8中的固定相CSP3用匀浆法[(13).ChenJ.,Duan R.,Chen W.,Zhang J.,Luo X-G.,Li J.,Bai Z-W.,Current AnalyticalChemistry,2013，9,128-137]将其填入空色谱柱(250×4.6mm,i.d.)中，制成手性色谱柱。为比较本发明中的手性固定相与目前公认的分离性能最好的以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)制备的手性固定相的手性识别性能，将这两种高分子涂覆在和CSP3相同的载体上，两种高分子占总投料的20％，得到两种固定相，分别命名为CSPa和CSPb。按文献13中同样的方法填充CSPa、CSPb，制得色谱柱。正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇和正己烷-(乙醇+甲醇)是评价多糖衍生物固定相手性分离性能的经典相流动相[(14).Ikai T.,Okamoto Y.,Chemical Reviews,2009，109,6077-6101]。本发明用如下所示编号为1-20的手性化合物为样品，在正己烷-异丙醇(90/10,体积比，下同)、正己烷-乙醇(90/10)和正己烷-混合醇(90/10)这三个流动相条件下测试这些固定相的手性识别与分离性能，混合醇是指由乙醇和甲醇按等体积混合而成的溶液。CSP3、CSPa、CSPb经历了完全相同的分离条件，每个固定相都尝试了对所有手性样品的分离，所以测试结果具有可比性。每个样品在各个固定相上进行分离得到的结果如表1所示，在CSP3、CSPa、CSPb上分离样品的总个数和基线分离的个数的统计如附图5所示。CSP3识别20个手性样品中的18个，基线分离(Rs≧1.5)的个数6个。CSPa和CSPb分别识别了16、15个手性样品，基线分离的个数分别是10、6。从这些分离结果上看，CSP3比CSPa和CSPb能识别更多的手性样品，虽然基线分离的个数比CSPa少，但是与CSPb持平。总体来说本发明中壳聚糖衍生物有较好的手性识别及分离性能。

实施例15

对有机溶剂的耐用性测试：

一些纤维素和直链淀粉的衍生物能溶于含氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等的流动相中，或在这些流动相中能高度溶胀，所以，纤维素和直链淀粉衍生物涂覆型手性分离材料一般不能在含上述有机溶剂的流动相中使用，否则，相应的固定相会遭到破坏，导致其分离性能降低。而本发明中所制备的壳聚糖衍生物在常用的有机溶剂如乙酸乙酯、二氯甲烷、和氯仿中不能溶解。

本实施例测试了CSP1对有机溶剂的耐用性能。测试方法如下：因CSP1在正己烷-混合醇(90/10)的流动相中手性识别及分离性能最好，故选用正己烷-混合醇(90/10)作为测试CSP1在经历不同有机溶剂后分离性能变化的流动相。先在正己烷-混合醇(90/10)条件下用下述(上述实施例14的13个手性样品)所示的手性样品测试CSP1的手性识别及分离性能，然后用纯的乙酸乙酯冲洗CSP1，流速为1mL/min，运行7小时后，再在正己烷-混合醇(90/10)条件下用下述所示的手性样品测试CSP1的手性识别及分离性能，比较经过乙酸乙酯前和经过乙酸乙酯后手性识别及分离性能的差异，以确定CSP1是否被破坏。之后，再用纯的氯仿代替乙酸乙酯重复上述冲洗过程，在相同流动相下以相同的样品测试CSP1的手性识别及分离性能。

CSP1经过乙酸乙酯、氯仿前后的分离结果如表2所示，其识别样品的总个数和基线分离化合物的个数如附图6所示(附图6中所用流动相及对“a”、“b”、“c”、和“d”的说明与表2中的相同)。由附图6可知，在正己烷-混合醇(90/10)的检测条件下，CSP1在放置两个月后和经过纯的乙酸乙酯、纯的氯仿的流动相后识别手性化合物的总数和达到基线分离的化合物的个数都没有变化，只有个别样品的分离度发生了轻微的变化。总体而言，CSP1在经历这些流动相后，其分离性能没有发生根本性的变化，说明这类固定相对上述有机溶剂有较好的耐用性，能够在这些流动相中使用。需要指出的是多糖衍生物手性固定相在使用一段时间后，其分离参数会有少许变化，只要总的手性识别及分离性能没有明显降低，都可以继续使用。CSP1能够在纯的乙酸乙酯和纯的氯仿的流动相中使用，所以，与现有的多糖衍生物涂覆型固定相相比，CSP1对有机溶剂的耐受性有显著的优势。

总之，本发明制备的手性固定相有优越的手性识别性能，对有机溶剂有较好的耐受性。

S/N：样品编号；

流动相：

A：正己烷/异丙醇(90/10)，

B：正己烷/乙醇(90/10)，

C：正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5)。

色谱参数的定义：容量因子k＝(t_R－t₀)/t₀，其中t_R为某化合物一个对映体的保留时间，其中死时间_t0用1,3,5-三叔丁基苯来测定；分离因子α＝k₂/k₁，其中k₁和k₂分别表示两个对映体的容量因子；分离度R_s＝2(t_R2－t_R1)/(W₁+W₂)，其中t_R1和t_R2分别表示第一、第二个被洗脱的对映体的保留时间，而W₁和W₂分别表示这两个对映体的峰底宽。

流速：1mL/min。

柱温：25℃。

表1、手性化合物在CSP3、CSPa、CSPb上的分离结果

表2、CSP1对流动相中有机溶剂耐受性的测试结果

流动相：正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5)

a：CSP1先依次在正己烷/异丙醇(90/10)和正己烷/乙醇(90/10)的条件下对13个手性样品进行分离测试后，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5)条件下对13个手性样品进行分离得到的结果；

b：经过a后，将填充CSP1的手性色谱柱放置两个月，保存流动相为正己烷/异丙醇(90/10)，在此之后，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5)的流动相中对13个手性样品进行分离测试得到的结果；

c：经过b后，CSP1经纯的乙酸乙酯冲洗，流速为1mL/min，运行7h，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5)条件下对样品进行分离得到的结果；

d：经过c后，CSP1经纯的氯仿冲洗，流速为1mL/min，运行7h，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5)条件下对样品进行分离得到的结果。

Claims

1.壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的制备方法，所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)，其结构式如下：

其中R₁为以下基团中任意一种：

R₂为以下基团中任意一种：

聚合度n≥10；

其特征在于步骤如下：

壳聚糖-烃氧基甲酰胺的氨基甲酸酯化：将壳聚糖-烃氧基甲酰胺溶解在氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液中，加入过量的含不同取代基的苯基异氰酸酯，其中含不同取代基的苯基异氰酸酯的摩尔数与壳聚糖-烃氧基甲酰胺重复单元摩尔数之比不低于3:1，于80-95℃下反应不少于24小时生成壳聚糖衍生物，即壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)；

所述的壳聚糖-烃氧基甲酰胺的制备方法，其步骤如下：

2.根据权利要求1所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的制备方法，其特征在于所述的含不同取代基的苯基异氰酸酯结构式为：

其中R₂为以下基团中任意一种：

3.根据权利要求1所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖-烃氧基甲酰胺，其结构式如下：

其中：n≥10；

R₁为以下基团中任意一种：

4.根据权利要求1所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的制备方法，其特征在于步骤1)和步骤2)中所述的氯甲酸酯总的摩尔数与步骤1)中所使用的壳聚糖重复单元摩尔数之比不小于3：1。

5.根据权利要求1所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(烃氧基甲酰胺)的制备方法，其特征在于氯化锂的浓度能使壳聚糖-烃氧基甲酰胺溶解即可。