CN104311700B - 壳聚糖‑二(芳香基氨基甲酸酯)‑(酰胺)及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类用于制备手性固定相的材料壳聚糖‑二(芳香基氨基甲酸酯)‑(酰胺)及其制备方法，其制备方法步骤如下：1)壳聚糖氨基的酰基化：将脱乙酰度在98％以上的壳聚糖与过量的酸酐等反应得到N‑酰化壳聚糖；2)N‑酰化壳聚糖的氨基甲酸酯化：将N‑酰化壳聚糖溶解在氯化锂的N,N‑二甲基乙酰胺溶液中，加入过量的苯环上含不同取代基的异氰酸酯，于80‑95℃下反应24‑36小时生成壳聚糖衍生物，即壳聚糖‑二(芳香基氨基甲酸酯)‑(酰胺)，其结构式如下：
Description
技术领域
本发明涉及用于手性分离的功能材料，具体涉及壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)及其制备方法。
背景技术
许多自然现象与分子的手性有关，如手性高分子有特殊的光、电性能，一些作为药物使用的手性小分子对映体在生理活性方面有很大差异，其中一个对映体能有效地治疗疾病，而另一个对映体可能表现出毒副作用等，因此，手性分子的制备、分离与检测已成为热门的研究领域。除不对称合成与生物催化的手性合成外，以使用手性固定相(ChiralStationary Phase,CSP)为基础的液相色谱法是对映体批量分离的有效方法[⑴.HsuL.C.,Kim H.,Yang X.,et al,Large scale chiral chromatography for theseparation of an enantiomer to accelerate drug development,Chirality,23,361–366,2011；⑵.Grinberg N.,Thompson R.,Chiral separations by HPLC,Encyclopediaof chromatography,3rd Edition,Volume I,II,and III,Ed.Cazes J.,Taylor andFrancis Group,pp427–432,2010]。此外，在用常规高效液相色谱、微色谱及毛细管电色谱检测手性化合物的对映体含量时，也需要使用性能优越的手性固定相，故而有关新型手性分离材料的研究有非常重要的意义[⑶.Tang M.,Zhang J.,Zhuang S.,et al,Development of chiral stationary phases for high-performance liquidchromatographic separation,Trends in Analytical Chemistry,39,180-194,2012；⑷.Tsioupi D.A.,Staden S.-v.R.-I.,Kapnissi-Christodoulou C.P.,Chiral selectorsin CE:Recent developments and applications,Electrophoresis,34,178–204,2013]。
在高分子型手性分离材料中，多糖衍生物型固定相因其卓越的手性识别性能而最受青睐[⑸.Zhang Y.,Wu D.-R.,Wang-Iverson D.B.,et al, Enantioselectivechromatography in drug discovery,Drug Discovery Today,10(8):571-577,2005]。由于这类固定相对手性化合物有较高的负载量，而且制备这类固定相的原料廉价易得，所以用纤维素和直链淀粉制备的固定相已经商业化。其中，以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和纤维素-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)制备的手性固定相被公认为具有最强的手性分离性能。但这类固定相还存在以下问题：①一些涂覆型固定相上的多糖衍生物因溶于有机流动相中，或者在流动相中高度溶胀，所以固定相的使用寿命不长，且一些有机溶剂不能用作流动相的组份[⑹.Ikai T.,Yamamoto C.,Kamigaito M.,Okamoto Y.,Immobilization of polysaccharide derivatives onto silica gel-Facile synthesisof chiral packing materials by means of intermolecular polycondensation oftriethoxysilyl groups,Journal of Chromatography A,1157,151–158,2007]。现有的涂覆型天然多糖衍生物手性固定相一般不能在含四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯等流动相中使用。尤其是四氢呋喃，因极易破坏多糖衍生物的高级结构而被严格禁止用作流动相的组份[⑺.Welch C.J.,Fairchild J.,Sajonz P.,Investigation of the stability ofchiralpak AD chiral stationary phase under various solvent conditions anddevelopment of a method to identify stationary phase-derived polymercontamination,Chirality,19:607–6112007]。如果固定相能够在更多的有机溶剂流动相中使用，这种固定相将有明显的优势，因为手性化合物的溶解度及分离度与有机溶剂密切相关，固定相所适用的有机流动相越多，其应用范围更广；②共价键合型固定相的稳定性虽有大幅度的提高，但在其制备中交联剂的用量至关重要，如果交联剂稍微多加一点，固定相的分离性能会降低，如果交联剂用得太少，多糖衍生物交联得不够紧密，载体(通常为硅胶)会从多糖衍生物的凝胶中隙漏，所以固定相的制备不易重现。
除用纤维素和直链淀粉制备手性固定相外，甲壳素(Chitin)和壳聚糖(Chitosan)也曾经用来制备手性固定相。Okamoto等[⑻.Yamamoto C.,Hayashi T.,Okamoto Y.,High-performance liquid chromatographic enantioseparation using chitin carbamatederivatives as chiral stationary phases,Journal of Chromatography A,1021,83–91,2003] 用一系列异氰酸酯修饰甲壳素(Chitin)，制备出手性固定相，因甲壳素衍生物在绝大多数有机溶剂中的溶解度小，这些固定相在使用时有很好的稳定性。但这些固定相总的分离性能不及纤维素和直链淀粉衍生物固定相的分离性能，原因是甲壳素乙酰基中的甲基较小，在手性识别中不能造成适当的空间障碍，从而不利于手性识别。左文丽等[⑼.左文丽，新型壳聚糖衍生物的合成及其手性识别能力的研究，哈尔滨工程大学专业硕士学位论文，2012年；⑽.祁媛,复合型壳聚糖类手性固定相的合成与应用,兰州交通大学硕士学位论文,2013；⑾.Han X.,An L.,Cui H.,Li H.,Liu W.,Enantioseparation using chitosantris(3-chlorophenylcarbamate)as a chiral stationary phase for HPLC,Chromatographia,73:1043–1047,2011]将超高脱乙酰度壳聚糖与异氰酸酯反应，制备出壳聚糖-二(氨基甲酸酯)-(脲)，并以此制备了相应的手性固定相，但所制备的壳聚糖-二(氨基甲酸酯)-(脲)是用四氢呋喃为溶剂涂覆的，表明其在四氢呋喃中有较大的溶解度，因而这类固定相不能在含四氢呋喃的流动相中使用。另外，Okamoto等[⑿.Yamamoto C.,Fujisawa M.,Kamigaito M.,Okamoto Y.,Enantioseparation using urea-and imide-bearing chitosan phenylcarbamate derivatives as Cciral stationary phases forhigh-performance liquid chromatography,Chirality,20:288–294,2008]制备了酰亚胺壳聚糖氨基甲酸酯，在制备酰亚胺时，反应温度高达120℃，表明这步反应难以完全地进行，也就不容易制备结构相对规整的衍生物。再者，酰亚胺中的氮原子上没有连接氢原子，这就减弱了所制备的酰亚胺壳聚糖氨基甲酸酯与手性样品之间的作用，不利于手性识别。在这一工作中，所制备的酰亚胺壳聚糖氨基甲酸酯也是用四氢呋喃为溶剂涂覆的，所以，这些固定相也应不能在含四氢呋喃的流动相中使用。还有一些文献报道了用脱乙酰度不高的壳聚糖制备手性固定相，由于壳聚糖的脱乙酰度不高，其衍生物的结构不够规整，不利于手性分离。
总之，至今为止，涂覆型多糖衍生物手性固定相仍然面临着既保证有优越的分离性能，又能够在较为广泛的有机溶剂流动相中使用的问题。有些固定相能够在含一定比例的氯仿和乙酸乙酯的流动相中使用，但氯仿或乙酸乙酯所占的比例一般都不高[⒀.Yamamoto C.,Fujisawa M.,Kamigaito M., Okamoto Y.,Enantioseparation usingurea-and imide-bearing chitosan phenylcarbamate derivatives as Cciralstationary phases for high-performance liquid chromatography,Chirality,20:288–294,2008]。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种手性识别及分离性能强且对有机溶剂耐用性好的手性固定相材料及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
提供壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)，其结构式如下：
其中，取代基R1为2-5个碳原子的饱和脂肪族烃基，或者为以下基团：
R2为以下基团：
聚合度n为100-2100。
本发明还提供上述壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)的制备方法，其步骤如下：
1)壳聚糖氨基的酰基化：将脱乙酰度在98％以上的壳聚糖溶于有机酸水溶液中，再向所得溶液中加入过量的所述有机酸的酸酐和甲醇，于室温下反应5-10h，其中壳聚糖重复单元的摩尔数与酸酐的摩尔数之比为1：2.2-10，得到N-酰化壳聚糖；或
在上述方法中，控制壳聚糖重复单元的摩尔数与酸酐的摩尔数之比在1:2-5之间，得到部分氨基被酰基化的产物(即不完全N-酰化壳聚糖)，将此产物溶于离子液体中，再加入甲醇和酸酐，于室温下反应5-10h，其中壳聚糖重复单元的摩尔数与酸酐的摩尔数之比为1：1-3，制得N-酰化壳聚糖；
2)N-酰化壳聚糖的氨基甲酸酯化：将步骤1)得到的N-酰化壳聚糖溶解在氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液中，加入过量的含不同取代基的苯基异氰酸酯，其中N-酰化壳聚糖重复单元摩尔数与异氰酸酯的摩尔数之比为1:2-5，于80-95℃下反应24-36小时生成壳聚糖衍生物，即壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)。
本发明壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)是用脱乙酰度在98％以上的壳聚糖制备的，其过程依次分为壳聚糖氨基的酰基化和N-酰化壳聚糖上羟基的氨基甲酸酯化两个过程，如下所示：
本发明中的脱乙酰度在98％以上的壳聚糖是根据文献方法从甲壳素制备的[⒁.宋庆平，汪泳，丁纯梅，醇溶剂法制备高脱乙酰度壳聚糖，化学世界，(7)：422–423，433，2005；⒂.Muzzarelli R.A.A.,Petrarulo M.,Solubility and structure of N-carboximethyl Chitosan,International Journal of Biological Macromolecules,16(4):177–180,1994；⒃.Tolaimate A.,Desbrieres J.,Rhazi,M.,et al,Contribution tothe preparation of chitins and chitosans with controlled physico-chemicalproperties,Polymer,44,7939–7952,2003]。同样，按文献报道的方法降解壳聚糖[⒄.覃彩芹，肖玲，杜予民等，过氧化氢氧化降解壳聚糖的可控性研究，武汉大学学报(自然科学版)，46(2)：195–198，2000；⒅.赵海峰，张敏卿，曾爱武，H2O2氧化降解壳聚糖研究，化工进展，22(2)：160–164，2002]以制备不同分子量的壳聚糖。
按上述方案，步骤1)所述壳聚糖数均分子量为2万-35万；所述有机酸为R1-COOH，其中R1为2-5个碳原子的饱和脂肪族烃基，或者为以下基团：
按上述方案，步骤1)所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐。
按上述方案，步骤2)所述含不同取代基的苯基异氰酸酯结构式为：
其中R2为以下基团：
按上述方案，步骤1)中所述的壳聚糖、有机酸水溶液和甲醇的质量比为1:20-70:20-240，有机酸水溶液的质量百分比浓度为1-3％；所述的部分氨基被酰基化的产物、离子液体和甲醇的质量比为1:7-12:1-2；步骤2)中所述的N-酰化壳聚糖、氯化锂和N,N-二甲基乙酰胺溶液的质量比为1:1-1.5:10-15。
本发明还提供一种手性固定相，其含有上述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)。
以及上述手性固定相的制备方法：将上述壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)溶于强极性有机溶剂中，再将所得溶液与硅胶或羟基被封端的硅胶相混合，随后减压蒸出溶剂，壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)沉积在硅胶或端羟基被封端的硅胶的表面，即得到手性固定相。
按上述方案，所述强极性有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。
本发明的有益效果在于：
一、本发明制备的手性固定相有很强的手性分离性能，这是因为：
⑴、本发明选用脱乙酰度为98％以上的壳聚糖为手性原料制备固定相，所合成的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)上残留的乙酰基很少，因而其结构规整，有利于手性识别；
⑵、因壳聚糖中氨基与羟基的反应活性差别大，可用含不同基团的衍生化试剂分两个阶段对氨基和羟基分别进行修饰，在壳聚糖重复单元的2位上生成酰胺，在3位和6位上生成氨基甲酸酯，酰胺上连接的基团与氨基甲 酸酯上连接的基团可以不相同，这些不相同的基团在电子效应及空间位阻方面能相互补充，从而使所制备的分离材料能识别更多的手性小分子，扩大其所能识别手性化合物的范围；
⑶、已有文献报道直接将甲壳素的羟基进行氨基甲酸酯化，用甲壳素氨基甲酸酯制备手性分离材料，其中的一些材料也有较好的分离性能。但甲壳素重复单元上的氨基被乙酰化，是固定不变的，乙酰基中的甲基较小，不利于手性识别。而在本发明中，用来对壳聚糖重复单元上的氨基进行酰基化的基团都比乙酰基要大，这些基团的结构可多样化，对提高所制备固定相的分离性能有利；
⑷、因结构与现有的壳聚糖或甲壳素固定相不同，与现有的壳聚糖或甲壳素类的固定相在手性分离上起到相互补充的作用，即能分离现有的甲壳素或壳聚糖固定相不能分离的手性化合物。
二、本发明中的手性分离材料有很好的耐用性
现有的纤维素或直链淀粉衍生物涂覆型固定相，不能在含氯仿、乙酸乙酯或四氢呋喃等溶剂的流动相中使用。文献报道的壳聚糖衍生物固定相是用四氢呋喃作溶剂涂覆的，因此也不能在含四氢呋喃的流动相中使用。本发明制备的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)在绝大多数有机溶剂中难以溶解，与现有的已商业化的多糖衍生物手性固定相相比，本发明制备的固定相能在更多的有机溶剂中使用，这些材料不需要经过共价交联，对有机溶剂流动相就有很好的耐用性。
附图说明
图1为本发明实施例所制备的壳聚糖的1H NMR谱图，其中I：用戊醇和氢氧化钠脱乙酰制备的壳聚糖；II：用氢氧化钠水溶液脱乙酰制备的壳聚糖；
图2为实施例1所制备的N-异丁酰化壳聚糖(I)和实施例2制备的N-环丁甲酰化壳聚糖(II)的红外光谱图；
图3为实施例1所制备的N-异丁酰化壳聚糖(I)和实施例2制备的N-环丁甲酰化壳聚糖(II)的1H NMR谱图；
图4为实施例1所制备的壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异 丁酰胺)的1HNMR谱图；
图5为实施例3所制备的壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的热重分析图；
图6为实施例11-12所用手性化合物样品；
图7为实施例所制备的CSP1、CSP2、CSPa、CSPb和CSPc上分离样品的总个数和基线分离的个数的统计图；
图8为实施例1所制备的CSP1在经历不同有机溶剂流动相后的分离结果柱状图；
图9为实施例2所制备的CSP2在经历不同有机溶剂流动相后的分离结果柱状图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
本发明实施例所用硅胶(球形，平均粒径7μm，孔径)购自Daiso Co.，Ltd.；所用环丁基甲酸酐、环己甲酸酐、环丙甲酸酐和糠酸酐参照文献[⒆.Malkoch M.,E.,Hult A.,Rapid and efficient synthesis of aliphatic ester dendrons anddendrimers,Macromolecules,35,8307-8314,2002]中的方法制备，当有机羧酸难溶于二氯甲烷时，可以使用丙酮等非质子极性溶剂代替二氯甲烷。
N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)在使用前经分子筛干燥两次，氯化锂在使用前于140℃下真空干燥24小时。
硅胶表面羟基的封端按文献[⒇.Lai X.-H.,Bai Z.-W.,Ng S.-C.,et al,Preparation and enantioseparation characteristics of two chiral stationaryphases based on mono-(6A-azido-6A-deoxy)-perphenylcarbamoylatedα-and γ-cyclodextrin,Chirality,16,592-597,2004]方法完成。
称取真空干燥至恒重的硅胶8.98g于150mL三口烧瓶中，加入25mL甲苯、0.25mL三乙胺和10mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，于95℃下搅拌24h。常压过滤，得到的3-氨基丙基硅胶用丙酮抽提12h，然后真空干燥至恒重，得到3-氨基丙基硅胶9.13g。
按上述相同的方法，以甲基三甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷和3-氯丙基三乙氧基硅烷等硅氧烷或氯硅烷代替APTES，均可以用来将硅胶表面羟基封端。
用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)制备的固定相被公认为具有最强的手性分离能力，为比较本发明中制备的固定相和这两种固定相的手性分离性能，发明人还参照文献[(21).Chen J.,Duan R.,Chen W.,et al,Enantioseparation properties of the biselector chiral stationary phasederived from amylose tris(phenylcarbamate)and amylose tris(benzoate),CurrentAnalytical Chemistry,9,128-137,2013]中的方法制备了直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)：称取干燥至恒重的纤维素微晶2.50g于100mL三口烧瓶中，再加入36.3mg DMAP(4-N,N-二甲基氨基吡啶)和40mL吡啶搅拌升温，于110℃下加入12mL 3,5-二甲基苯基异氰酸酯，反应48h。待稍冷却，将此溶液逐滴滴加到300mL甲醇中，剧烈搅拌，生成沉淀，过滤，滤饼用100mL二氯甲烷溶解，再将此溶液逐滴滴加到500mL甲醇中进行二次沉淀，抽滤，用甲醇洗涤滤饼数次，真空干燥至恒重，得到纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)7.63g，产率82％。元素分析(％)：计算值(C33H37N3O8·0.5H2O)n C 64.69，H 6.25，N 6.86；实测值C 64.29，H 6.22，N 6.74。
按上述方法，用2.50g直链淀粉代替微晶纤维素，制备直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)7.64g，产率82％。元素分析(％)：计算值(C33H37N3O8·0.5H2O)n C 64.69，H6.25，N 6.86实测值C 64.85，H 6.23，N6.78。
为比较甲壳素衍生物和本发明中的壳聚糖衍生物的手性识别及分离性能，按参考文献8中的方法制备了甲壳素-二(3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯)：将干燥好的甲壳素2.3g在70mL DMAc中于160℃下回流1h，冷却过滤，得到的滤饼用丙酮洗涤数遍后，于真空干燥箱中干燥备用。将4g充分干燥的LiCl加入到40mL DMAc中搅拌，加热到85℃，待LiCl完全溶解后，加入上述已活化并干燥好的甲壳素2g，继续搅拌24h，再将6.6g 3-氯-4-甲基苯基异氰酸酯及催化量的DMAP加入到反应体系中，于90℃的条件下，继续反应 48h，反应完后，将反应液滴加到300mL乙醇中，并剧烈搅拌，过滤，得到的滤饼用50mL DMF溶解，用乙醇进行二次沉淀，过滤，并用甲醇多次洗涤，真空干燥，得4.2g甲壳素-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)，产率80％。元素分析(％):计算值(C24H25Cl2N3O7·0.5H2O)C 53.66，H 4.79，N 7.68；实测值C53.13，H 5.24，N 7.79。
壳聚糖的制备：
将购买的片状甲壳素(虾壳)用粉碎机粉碎，过筛(355μm)，收集筛网下的甲壳素作为原料，使用两种方法对甲壳素进行脱乙酰(文献14-16)；并用双氧水降解壳聚糖(文献17、18)，调节双氧水的浓度和反应温度可以得到不同分子量的壳聚糖。经降解后，壳聚糖的脱乙酰度基本不变。
以正戊醇为溶剂制备壳聚糖：
称取已干燥的20g甲壳素置于三口瓶中，按壳聚糖/NaOH/正戊醇＝1/5/11(质量比)加入NaOH和正戊醇，加热回流3h，过滤，用水洗至中性，烘干得13.64g白色固体，产率86％；其1H NMR图如附图1(I)所示，1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):5.78-3.24(氨基葡萄糖骨架上的H),2.26(-NH-CO-CH3)；根据该谱图计算出壳聚糖的脱乙酰度为98.2％。元素分析(％)：计算值(C6.04H11.04NO4.02·0.4H2O)n C:42.87,H:7.05,N:8.28；实测值C:43.20,H:7.18,N:7.70。数均分子量为6.0万。
本发明实施例采用凝胶色谱法测定壳聚糖及壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)的数均分子量(Mn)，在测定壳聚糖分子量时，以醋酸(0.3M)-醋酸铵(0.1M)缓冲溶液为流动相，以聚乙二醇为标准品；在测定壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)时，以DMF为流动相，以聚苯乙烯为标准品。
壳聚糖、N-酰化壳聚糖和绝大多数壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)都能吸附水分子，因此在计算元素值时，要考虑吸附水分子的存在。
以水为溶剂制备壳聚糖：
称取已干燥的20g甲壳素置于三口瓶中，再加入163.64g NaOH、2.02g NaBH4和200g蒸馏水，加热至回流，搅拌3小时，过滤，洗至中性，干燥后再按相同方法反应3小时，得13.80g白色固体，产率87％；其1H NMR图如附图1(II)所示，1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):5.76-3.23(氨基葡萄糖骨 架上的H),2.26(-NH-CO-CH3)；根据该谱图计算出壳聚糖的脱乙酰度为99.9％。元素分析(％)：计算值(C6H11NO4·0.3H2O)n：C:43.27,H:7.02,N:8.41；实测值C:43.21,H:7.09,N:7.87。
测得壳聚糖的数均分子量为35.0万。
实施例1
壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的合成
N-异丁酰化壳聚糖的制备：将1.50g(9.32mol重复单元)壳聚糖(数均分子量6.0万、脱乙酰度98.2％)加入到250mL的三口烧瓶中，并加入0.75g异丁酸和30g蒸馏水，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。再加入70mL甲醇，机械搅拌均匀后，快速加入8.84g(55.92mmol)异丁酸酐(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为6:1)和80mL甲醇，于16℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入240mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌两小时，静置过夜，过滤，用乙醇和水将产物洗至中性，干燥，得2.01g N-异丁酰化壳聚糖，产率：93％；红外光谱图如附图2(I)所示：IR(KBr,cm-1)υ:3523-3254(-OH,-NH-),2971,2876(-C-H),1656,1551(-CONH-)；1HNMR图如附图3(I)所示：1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):4.86-3.69(m,7H,氨基葡萄糖骨架H),2.64-1.21(m,7H,异丙基H)；元素分析(％)：计算值(C9.88H16.80NO5·0.8H2O)n：C 48.83,H7.63,N 5.70；实测值C 49.06,H 7.92,N 5.57。
壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备：称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入20mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.44g(6.23mmol重复单元)干燥的N-异丁酰壳聚糖，溶解24h，再加入3.21mL 3-甲基苯基异氰酸酯(异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为4:1)及催化量的DMAP，继续反应30小时。趁热将反应液逐滴加入到200mL甲醇中，出现沉淀，过滤，将固体溶解在15mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到200mL甲醇中沉淀，重沉淀的过程重复三次。最后所得固体用水洗涤，过滤，干燥，得2.02g壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)，产率：65％；测得分子量(Mn)为1.1×105；IR(KBr,cm-1)υ:3405-3280(-NH-),3084(Ph-H),2970-2873(-C-H),1725(-CO2-),1659,1616,1544(-CONH-,-Ph)；其1H NMR谱图如附图4所示，δ0.72、2.15分别对应异丁酰基中的甲基质子及次甲 基质子；δ2.21对应苯环上甲基质子；δ3.38-4.89对应的是壳聚糖重复单元碳架上的质子；δ6.68-7.20对应苯环上的质子；δ8.87-9.16对应的是酰胺中的N-H，说明所制备的材料为壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)；元素分析(％)：计算值(C25.72H30.66N3O7·0.50H2O)n C 61.63,H 6.36,N 8.30；实测值C 61.85,H6.47,N 8.48。
称取本实施例制备的干燥的壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)0.65g于50mL小烧杯中，加入30mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌至溶解。称取2.60g干燥的3-氨基丙基硅胶于100mL茄形瓶中，向其中加入10mL上述高分子溶液，超声使硅胶在其中分散均匀，保持温度在55℃，用旋转蒸发仪缓慢均匀地蒸出DMF。重复上述过程，共三次。真空干燥至恒重，得到白色细粉末状固体，即为手性固定相，称之为CSP1，壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)在涂覆中的投料量为20％。
实施例2
壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(环丁基甲酰胺)的合成
N-环丁基甲酰壳聚糖的制备：将1.0g(6.21mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量3.2万、脱乙酰度98.0％)加入250mL三口烧瓶中，加入0.60g环丁基甲酸，20g蒸馏水，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。加入30mL甲醇，机械搅拌均匀后，快速加入7.92g(43.47mmol)环丁基甲酸酐(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为7:1)和70mL甲醇，于25℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入185mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌两小时，静置过夜。过滤，用乙醇和水将产物洗至中性，干燥，得1.37g N-环丁甲酰化壳聚糖，产率：91％；其红外光谱图如附图2(II)所示：IR(KBr,cm-1)υ:3533-3234(-OH,-NH-),2946,2866(CH2-，-CH-),1655,1550(-CONH-)。由图2可看出，(I)和(II)两个图上均没有酯基峰出现，表明酰基化反应发生在壳聚糖的氨基上。
本实施例所制备的N-环丁甲酰化壳聚糖的1H NMR图如附图3(II)所示1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):5.09-3.95(m,7H,氨基葡萄糖骨架H),3.55-2.11(m,7H,环丁基H)；元素分析(％)：计算值(C10.94H16.92NO5·0.5H2O)nC 52.25,H 7.18,N 5.57；实测值C 52.41,H7.19,N 5.65。
壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(环丁基甲酰胺)的制备：称取1.50g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入15mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.15g(4.73mmol重复单元)干燥的N-环丁基甲酰壳聚糖，溶解24h，再加入1.94mL(14.19mmol)3-氯-4-甲基苯基异氰酸酯(异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为3:1)及催化量的DMAP，继续反应36小时。趁热将反应液逐滴加入到150mL甲醇中，出现沉淀，过滤，将滤饼溶解在15mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到200mL甲醇中沉淀，后续处理过程同实施例1中的“壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备”，得2.19g壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(环丁基甲酰胺)，产率：80％；测得分子量(Mn)：4.7×104；IR(KBr,cm-1)υ:3399-3312(-NH-),3099-3051(Ph-H),2949-2865(-C-H),1727(-CO2-),1656,1605,1528(-CONH-,-Ph)；元素分析(％)：计算值(C26.94H28.92Cl2N3O7·0.8H2O)n C54.65,H 5.20,N 7.10；实测值C 54.92,H 5.49,N 7.11。
按实施例1中的方法，称取0.65g本实施例制备的壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(环丁酰胺)代替壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.60g 3-氨基丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP2)，壳聚糖-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(环丁酰胺)在涂覆中的投料量为20％。
实施例3
壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的合成
N-异丁酰化壳聚糖的制备：将1.50g(9.32mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量35.0万、脱乙酰度99.9％)加入到250mL的三口烧瓶中，并加入0.75g异丁酸和30g蒸馏水，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。再加入70mL甲醇，机械搅拌均匀后，快速加入7.36g(46.60mmol)异丁酸酐(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为5:1)和80mL甲醇，于16℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入200mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌两小时，静置过夜。过滤，用乙醇将产物洗至中性，干燥，得2.0g N-异丁酰壳聚糖，产率：93％；IR(KBr,cm-1)υ:3481-3292(-OH,-NH-),2975-2876(-C-H),1656, 1547(-CONH-)；1H NMR(CF3COOD,δ):5.06-3.84(m,7H,氨基葡萄糖骨架H),2.82-1.37(m,7H,异丙基H)；元素分析(％)：计算值(C9.99H16.97NO5·0.50H2O)n C:49.96,H:7.55,N:5.83；实测值C:49.74,H:7.49,N:5.47。
壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备：按照实施例1中制备壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的方法，以4-三氟甲氧基苯基异氰酸酯代替3-甲基苯基异氰酸酯，异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为3:1，制备出3.50g壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)，产率：88％；测得其分子量(Mn)：1.4×106；其热重分析图见附图5，由图5可知：当温度由20℃上升到160℃时，壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的重量逐渐减小，表明逐渐失去吸附的水；当温度上升到160℃时，壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的重量急剧降低，表明其发生热分解。根据热重分析图，计算出壳聚糖-二(4-三氟甲氧基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)含吸附水约为15％。这一结果与根据元素分析值计算的含水量相一致。IR(KBr,cm-1)υ:3506-3343(-NH-),3067(-Ph-H),2972-2879(-C-H),1726(-CO2-),1656,1547(-CONH-,-Ph),1316-1057(-OCF3)；元素分析(％)：计算值(C26H25F6N3O9·6H2O)n C:41.88,H:5.00,N:5.64；实测值C:41.86,H:5.40,N:6.13。
实施例4
壳聚糖-二(4-氯-3-三氟甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的合成
N-异丁酰化壳聚糖的制备：按照与实施例3相同的方法制备N-异丁酰化壳聚糖。
按照实施例1的方法，以4-氯-3-三氟甲基苯基异氰酸酯代替3-甲基苯基异氰酸酯，异氰酸酯与上述N-异丁酰壳聚糖重复单元摩尔数之比为4:1，制备出3.91g壳聚糖-二(4-氯-3-三氟甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)，产率：93％；测得其分子量(Mn)：1.5×106；IR(KBr,cm-1)υ:3500-3381(-NH-),3128-3065(-Ph),1736(-CO2-),1656,1601,1540(-CONH-,-Ph),1329-1028(-CCl,-CF3)；元素分析(％)：计算值(C26H23Cl2F6N3O7)n C:46.30,H:3.44,N:6.23；实测值C:46.56,H:4.26,N:6.44。
实施例5
壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(苯甲酰胺)的合成
N-苯甲酰化壳聚糖的制备：称取1g苯甲酸于250mL三口烧瓶中，加入30g蒸馏水，加热使苯甲酸完全溶解，将1.50g(9.32mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量2.0万、脱乙酰度98.4％)加入三口烧瓶中，搅拌使壳聚糖溶解。停止加热，加入80mL甲醇，搅拌均匀后，再加入16.85g(74.56mmol)苯甲酸酐(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为8:1)和70mL甲醇，于25℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入300mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌两小时，静置过夜。过滤，用乙醇和水将产物洗至中性，干燥得2.25g N-苯甲酰壳聚糖，产率：91％；IR(KBr,cm-1)υ:3440-3270(-OH,-NH-),3071(-Ph),1659,1543(-CONH-,-Ph)；1H NMR(CF3COOD,δ):7.73-7.44(t,5H,Ph-H),4.88-3.72(m,7H,氨基葡萄糖骨架H)；元素分析(％)计算值(C12.92H14.97NO5·H2O)n C 54.97,H 6.06,N 4.96；实测值C 54.89,H 6.32,N5.19。
壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(苯甲酰胺)的制备：称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入20mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.00g(3.77mmol重复单元)干燥的N-苯甲酰壳聚糖，溶解24h，再加入2.12mL(15.08mmol)3,5-二甲基苯基异氰酸酯(异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为4:1)及催化量的DMAP，继续反应30小时。趁热将反应液逐滴加入到200mL甲醇中，产生沉淀，过滤，将滤饼溶解在15mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到200mL甲醇中沉淀，后续处理过程同实施例1中的“壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备”，得1.86g壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(苯甲酰胺)，产率：88％；测得分子量(Mn)为4.1×104；IR(KBr,cm-1)υ:3478-3327(-NH-),3103-3010(-Ph),2921-2860(C-H),1720(-CO2-),1649,1614,1540(-CONH-,-Ph)；元素分析(％)：计算值(C30.92H32.97N3O7·0.5H2O)n C 65.43,H 6.03,N 7.40；实测值C 65.70,H 6.27,N 7.22。
按实施例1中的方法，称取0.226g本实施例所制备的壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(苯甲酰胺)代替壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)，并将其溶解在DMF中，再涂覆在2.60g三甲基氯硅烷封端的硅胶(即三甲基硅胶)上，制得手性固定相(CSP3)，壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(苯甲酰胺)在涂覆中的投料量为8％。
实施例6
壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(糠酰胺)的合成
N-糠酰化壳聚糖的制备：将1.95g(12.11mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量5.3万、脱乙酰度98.2％)加入500mL三口烧瓶中，加入1.08g糠酸，40g蒸馏水，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。加入100mL甲醇，机械搅拌均匀后，快速加入溶有17.46g(84.77mmol)糠酸酐(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为7:1)的甲醇(200mL)溶液，于16℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入360mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，磁力搅拌过夜。过滤，用乙醇和水将产物洗至中性，干燥，得2.50g N-糠酰壳聚糖，产率：81％；IR(KBr,cm-1)υ:3448-3279(-OH,-NH-),2932,2889(-CH2-,-CH-),1655,1538(-CONH-,呋喃基中的-C＝C-)；1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):8.1-6.7(t,3H,2-呋喃H),5.5-3.5(m,7H,氨基葡萄糖骨架H)；元素分析(％)：计算值(C10.95H13.00NO5.98·1.5H2O)n C:46.73,H:5.73,N:4.98；实测值C 47.09,H 6.00,N 4.98。
壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(糠酰胺)的制备：称取1.80g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入19mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在84℃，加入1.36g(5.33mmol重复单元)干燥的N-糠酰壳聚糖，溶解24h，加入催化量的DMAP，再加入2.39mL(18.66mmol)对氯苯基异氰酸酯(异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为3.5:1)继续反应30h。趁热将反应液逐滴加入到180mL甲醇/乙醇(1/1)中，产生沉淀，磁力搅拌，过滤，滤饼于76℃下干燥后，将滤饼溶解在15mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到200mL甲醇中沉淀，后续处理过程同实施例1中的“壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备”，得2.1g壳聚糖-二(对氯苯基氨基甲酸酯)-(糠酰胺)，产率：70％；测得分子量(Mn)为1.2×105；IR(KBr,cm-1)υ:3478-3366(-NH-)；3122,3058(Ph-H,呋喃基中的C-H),2956-2930(-C-H),1722(-CO2-)；1657,1600,1534(-CONH-,苯基及呋喃基中的-C＝C-)；N-酰化：1HNMR(CF3COOD,δ/ppm):8.17-6.77(m,4H,呋喃环H),5.40-4.08(m,7H,氨基葡萄糖骨架H)；元素分析(％)计算值(C24.95H21Cl2N3O8·H2O)n C:51.68,H:4.00,N:7.25；实测值C 51.98,H4.61,N 7.30。
实施例7
壳聚糖-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)-(环丙基甲酰胺)的合成
N-环丙基甲酰壳聚糖的制备：将1.50g(9.32mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量5.3万、脱乙酰度98.6％)加入250mL三口烧瓶中，加入0.63g环丙基甲酸，30g蒸馏水，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。加入50mL甲醇，机械搅拌均匀后，快速加入5.74g(37.28mmol)环丙基甲酸酐(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为4:1)和100mL甲醇，于25℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入165mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌两小时，静置过夜。过滤，用乙醇将产物洗至中性，干燥，得1.94g N-环丙甲酰壳聚糖，产率：91％；IR(KBr,cm-1)υ:3450-3277(-OH,-NH-),2930-2876(-C-H),1654,1556(-CONH-)；N-酰化：1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):5.14-4.01(m,5H,氨基葡萄糖骨架H),2.58-1.31(m,5H,环丙基H)；元素分析(％)：计算值(C9.97H14.97NO5·0.8H2O)n C 49.23,H 6.87,N 5.76；实测值C 49.12,H 7.27,N 5.67。
壳聚糖-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)-(环丙基甲酰胺)的制备：称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入20mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.20g(5.24mmol重复单元)干燥的N-环丙甲酰壳聚糖，溶解24h，再加入2.86mL(20.96mmol)3,5-二氯苯基异氰酸酯(异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为4:1)及催化量的DMAP，继续反应30小时。趁热将反应液逐滴加入到200mL甲醇中，产生沉淀，过滤，将滤饼溶解在15mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到200mL甲醇中沉淀，后续处理过程同实施例1中的“壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备”，得2.09g壳聚糖-二(3,5-二氯苯基氨 基甲酸酯)-(环丙基甲酰胺)，产率：66％；测得分子量(Mn)为1.5×105；IR(KBr,cm-1)υ:3542-3254(-NH-),3094(Ph-H),2923-2881(-C-H),1656,1557(-CONH-,-Ph)；元素分析(％)：计算值(C24.02H21.01Cl4N3O7·0.5H2O)n C46.90,H 3.61,N 6.85；实测值C47.40,H 4.35,N 7.06。
按实施例1中的方法，称取1.11g本实施例制备的壳聚糖-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)-(环丙基甲酰胺)代替壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)，将其溶解在DMF中，再涂覆在2.60g 3-氯丙基硅胶上，制得手性固定相(CSP4)，壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(环丙基酰胺)在涂覆中的投料量为30％。
按实施例1中的方法，可将不同的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)以不同投料比涂覆在硅胶或其它硅羟基被封端的硅胶上，制备成手性固定相，在此不再一一列举。
实施例8
壳聚糖-二(3,5-二-甲基苯基氨基甲酸酯)-(丁酰胺)的合成
N-丁酰化壳聚糖的制备：将1.50g(9.32mmol重复单元)的壳聚糖(数均分子量22.7万、脱乙酰度98.5％)加入150mL三口烧瓶中，加入1.07g丁酸，30g蒸馏水，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。加入18mL甲醇，机械搅拌均匀后，快速加入3.24g(20.50mmol)丁酸酐(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为2.2:1)和20mL甲醇，于25℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入106mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌两小时，静置过夜。过滤，用乙醇将产物洗至中性，干燥，得1.91g N-丁酰壳聚糖，产率：89％；IR(KBr,cm-1)υ:3486-3380(-OH,-NH-),2967-2882(-C-H),1632,1553(-CONH-)；N-酰化：1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):4.91-3.74(m,7H,氨基葡萄糖骨架H),2.47-0.99(m,7H,正丙基H)；元素分析(％)：计算值(C9.97H16.94NO5·H2O)n C48.12,H 7.67,N 5.63；实测值C 47.84,H 7.74,N 5.47。
壳聚糖-二(3,5-二-甲基苯基氨基甲酸酯)-(丁酰胺)的制备：称取1.50g干燥的LiCl于50mL三口烧瓶中，加入15mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在85℃，加入1.02g(4.42mmol重复单元)干燥的N-丁酰壳聚糖，溶解24h，再加入1.56mL(11.05mmol)3,5-二甲基苯基异氰 酸酯(异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为2.5:1)及催化量的DMAP，继续反应36小时。趁热将反应液逐滴加入到200mL甲醇中，产生沉淀，过滤，将滤饼溶解在15mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到200mL甲醇中沉淀，后续处理过程同实施例1中的“壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备”，得1.79g壳聚糖-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)-(丁酰胺)，产率：77％；测得分子量(Mn)为5.7×105；IR(KBr,cm-1)υ:3442-3254(-NH-),3108(Ph-H),2957-2890(-C-H),1656,1558(-CONH-,Ph)；元素分析(％)：计算值(C27.97H34.94N3O7·H2O)n C 61.85,H 6.85,N 7.74；实测值C 61.86,H 7.08,N 7.77。
实施例9
壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(环己基甲酰胺)的合成
N-环己基甲酰化壳聚糖的制备：将0.91g环己甲酸加入100mL单口瓶内，并加入60g蒸馏水，加热至80℃使酸完全溶解，再降温至50℃，将1.00g(6.21mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量5.3万、脱乙酰度98.6％)加入到500mL三口烧瓶中，并将环己甲酸溶液加入三口烧瓶中，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。加入130mL甲醇，机械搅拌均匀后，快速加入14.78g(62.10mmol)环己甲酸酐(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为10:1)和170mL甲醇，于25℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入260mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌2h，静置过夜。过滤，用乙醇将产物洗至中性，干燥，得1.29g N-环己甲酰壳聚糖，产率：77％；IR(KBr,cm-1)υ:3440-3289(-OH,-NH-),2930-2850(-C-H),1652,1543(-CONH-)；1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):6.50-5.27(m,7H,氨基葡萄糖骨架H),4.01-3.87(m,1H,-CH-),3.45-2.92(m,10H,-CH2-)；元素分析(％)：计算值(C12.93H20.89NO5·0.5H2O)n C 55.59,H 7.90,N 5.01；实测值C55.79,H 7.83,N 4.83。
壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(环己甲酰胺)的制备：称取2.00g干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入20mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入1.50g(5.54mmol重复单元)干燥的N-环己基甲酰壳聚糖，溶解24h，再加入3.54mL(27.70mmol)4-氯苯基异氰酸酯(异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为5:1)及催化量的DMAP， 继续反应30小时。趁热将反应液逐滴加入到200mL甲醇中，出现沉淀，过滤，将滤饼溶解在15mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到200mL甲醇中沉淀，后续处理过程同实施例1中的“壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备”，得2.21g壳聚糖-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)-(环己甲酰胺)，产率：69％；测得分子量(Mn)为1.4×105；IR(KBr,cm-1)υ:3404-3321(-NH-),3116-3058(Ph-H),2927,2853(-C-H),1719(-CO2-),1655,1597,1530(-CONH-,-Ph)；元素分析(％)：计算值(C26.93H28.89Cl2N3O7·0.5H2O)n C55.15,H 5.14,N 7.16；实测值C 55.21,H 5.53,N 7.58。
实施例10
壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(己酰胺)的合成
N-己酰壳聚糖的制备：将0.79g环己甲酸加入100mL单口瓶内，并加入70g蒸馏水，加热至80℃使酸完全溶解，再降温至50℃，将1.00g(6.21mmol重复单元)壳聚糖(数均分子量5.3万、脱乙酰度98.7％)加入到500mL三口烧瓶中，并将环己甲酸溶液加入三口烧瓶中，搅拌使壳聚糖溶解至清澈透明。加入130mL甲醇，机械搅拌均匀后，快速加入6.65g己酸酐(31.05mmol)和170mL甲醇(酸酐与壳聚糖重复单元摩尔之比为5:1)，于25℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入140mL 0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌2h，静置过夜。过滤，用乙醇将产物洗至中性，干燥，得到1.30g第一次N-环己甲酰化的壳聚糖，再将1.00g第一次N-己酰化的壳聚糖加入50mL三口瓶中，称取10.00g 1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体，搅拌，使固体颗粒完全溶解。加入2mL甲醇，机械搅拌均匀后，再滴加0.27g(1.24mmol)己酸酐(己酸酐与壳聚糖重复单元的摩尔比为2:1)，于25℃下反应7h。反应完毕后，将反应液倾入5mL0.5mol/L KOH-乙醇溶液中，搅拌过夜。过滤，用乙醇将产物洗至中性，干燥，得0.98g N-己酰壳聚糖，产率：92％；IR(KBr,cm-1)υ:3484-3401(-OH,-NH-),2960-2860(-C-H),1633,1555(-CONH-)；1H NMR(CF3COOD,δ/ppm):4.88-3.72(m,7H,氨基葡萄糖骨架H),2.78-0.85(m,11H,正戊基H)；元素分析(％)：计算值(C11.95H20.90NO5·0.5H2O)n C 53.63,H 8.25,N 5.23；实测值C 54.05,H 8.51,N 4.85。
壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(己酰胺)的制备：称取1.50g 干燥的LiCl于100mL三口烧瓶中，加入15mL干燥的DMAc，加热使LiCl完全溶解，保持温度在80℃，加入0.90g(3.47mmol重复单元)干燥的N-己酰壳聚糖，溶解24h，再加入1.52mL(12.14mmol)4-甲基苯基异氰酸酯(异氰酸酯与壳聚糖衍生物重复单元摩尔数之比为3.5:1)及催化量的DMAP，继续反应30小时。趁热将反应液逐滴加入到200mL甲醇中，产生沉淀，过滤，将滤饼溶解在15mL DMF中，再将滤液逐滴滴加到200mL甲醇中沉淀，后续处理过程同实施例1中的“壳聚糖-二(3-甲基苯基氨基甲酸酯)-(异丁酰胺)的制备”，得1.70g壳聚糖-二(4-甲基苯基氨基甲酸酯)-(己酰胺)，产率：93％；测得分子量(Mn)为1.3×105；IR(KBr,cm-1)υ:3395-3337(-NH-),3128-3036(-Ph),2956-2869(-C-H),1720(-CO2-),1656,1598,1527(-CONH-,-Ph)；元素分析(％)：计算值(C27.95H34.90N3O7·0.5H2O)n C 62.88,H6.78,N 7.87；实测值C 62.47,H 7.19,N 7.82。
实施例11
手性识别及分离性能测试：
将实施例1、2中制备的手性固定相分别命名为CSP1和CSP2，用匀浆法[(21).ChenJ.,Duan R.,Chen W.,Zhang J.,Luo X-G.,Li J.,Bai Z-W.,Current AnalyticalChemistry,9,128-137,2013]将其填入空色谱柱(250×4.6mm,i.d.)中，制成手性色谱柱。为比较本发明中的手性固定相与目前熟知的分离性能最好的直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的手性识别性能，将这两种高分子涂覆在和CSP1与CSP2相同的载体上，两种高分子占总投料的20％，得到两种固定相，分别命名为CSPa和CSPb。相似地，为比较本发明手性固定相与甲壳素衍生物固定相的手性识别及分离性能，将甲壳素-二(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆于相同的载体上，此高分子占总投料的20％，相应的固定相命名为CSPc。按文献21中同样的方法填充CSPa、CSPb和CSPc，制得色谱柱。正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇和正己烷-(乙醇+甲醇)(在此将乙醇和甲醇的混合物称为混合醇)是评价多糖衍生物固定相手性分离性能的经典相流动相[(22).Ikai T.,Okamoto Y.,Chemical Reviews,109,6077-6101,2009]。本发明用如图6所示编号为1-20的手性化合物为样品， 在正己烷-异丙醇(90/10,体积比，下同)、正己烷-乙醇(90/10)和正己烷-混合醇(90/10)这三个流动相条件下测试这些固定相的手性识别与分离性能，混合醇是指由乙醇和甲醇按等体积混合而成的溶液。CSP1、CSP2、CSPa、CSPb和CSPc经历了完全相同的分离条件，每个固定相都尝试了对所有手性样品的分离，所以测试结果具有可比性。每个样品在各个固定相上进行分离得到的结果如表1所示，在CSP1、CSP2、CSPa、CSPb和CSPc上分离样品的总个数和基线分离的个数的统计如附图7所示，20个手性样品在CSP1和CSP2上均得到了识别，并且在CSP1和CSP2上达到基线分离(Rs≧1.5)的个数分别为13和12个；CSPa、CSPb和CSPc分别识别了16、16和9个手性样品，基线分离的个数分别是10、6和6个。从这些分离结果看，CSP1和CSP2的手性识别及分离性能甚至比目前熟知的分离性能最好的纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯基)和直链淀粉-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)固定相的还要好，说明本发明中壳聚糖衍生物有很好的手性识别及分离性能。CSP2和CSPc都是用3-氯-4-甲基苯基异氰酸酯制备的，不同之处在于CSP2上含环丁基甲酰基，CSPc上含乙酰基，说明环丁基比乙酰基中的甲基更有利于手性分离。
实施例12
对有机溶剂的耐用性测试：
一些纤维素和直链淀粉的衍生物能溶于含氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氢呋喃的流动相中，或在这些流动相中能高度溶胀，所以，纤维素和直链淀粉衍生物涂覆型手性分离材料一般不能在含上述有机溶剂的流动相中使用，否则，相应的固定相会遭到破坏，导致其分离性能降低。而本发明中所制备的壳聚糖衍生物在常用的有机溶剂如乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和氯仿中不能溶解，只有少数衍生物微溶于四氢呋喃。
本实施例测试了CSP1和CSP2对有机溶剂的耐用性能。测试方法如下：因CSP1、CSP2分别在正己烷-乙醇(90/10)及正己烷-混合醇(90/10)的流动相中手性识别及分离性能最好，故选用正己烷-乙醇(90/10)作为测试CSP1耐用性的流动相，正己烷-混合醇(90/10)作为测试CSP2耐用性的流动相。先在正己烷-乙醇(90/10)条件下用图6所示编号为1-20的手性样 品测试CSP1的手性识别及分离性能，然后用100％乙酸乙酯冲洗CSP1，流速为1mL/min，运行7小时后，再在正己烷-乙醇(90/10)条件下用图6所示编号为1-20的手性样品测试CSP1的手性识别及分离性能，比较经过乙酸乙酯前和经过乙酸乙酯后手性识别及分离性能的差异，以确定CSP1是否被破坏。之后，再用100％氯仿代替乙酸乙酯重复上述冲洗过程，在相同流动相下以相同的样品测试CSP1的手性识别及分离性能。以此类推，分别用正己烷-四氢呋喃(50/50)、正己烷-四氢呋喃(40/60)和正己烷-四氢呋喃(30/70)冲洗7小时，每一次冲洗之后，都在相同流动相下以相同的样品测试CSP1的手性识别及分离性能。用与上述类似的方法测试CSP2对有机溶剂的耐用性。
CSP1和CSP2经过乙酸乙酯、氯仿和正己烷-四氢呋喃前后的分离结果如表2及表3所示，其识别样品的总个数和基线分离化合物的个数如附图8和附图9所示(图8和图9中所用流动相及对“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”的说明分别与表2和表3中的相同)。由附图8可知，在正己烷-乙醇(90/10)的检测条件下，CSP1在经过乙酸乙酯、氯仿后识别手性化合物的总数少1个，但是达到基线分离的化合物多2个。而在经过具有不同含量四氢呋喃的流动相后，CSP1识别化合物的总数相对于a条件下的结果减少了1-2个，但是达到基线分离的化合物多了3个。同样，由附图9可知，CSP2在经过乙酸乙酯、氯仿和具有不同含量四氢呋喃的流动相后，CSP2识别化合物的总数相对于a条件下的结果相当，尽管达到基线分离的化合物少了1-2个，但是就化合物的分离度而言，变化幅度不大。总体而言，CSP1和CSP2在经历这些流动相后，其分离性能没有发生根本性的变化，说明这类固定相对上述有机溶剂有较好的耐用性，能够在这些流动相中使用。需要指出的是多糖衍生物手性固定相在使用一段时间后，其分离参数会有少许变化，只要总的手性识别及分离性能没有明显降低，都可以继续使用。CSP1和CSP2能够在100％乙酸乙酯、100％氯仿和具有不同含量四氢呋喃的流动相中使用，所以，与现有的多糖衍生物涂覆型固定相相比，CSP1和CSP2对有机溶剂的耐受性有显著的优势。
总之，本发明制备的手性固定相有优越的手性识别性能，对有机溶剂有很好的耐受性。
S/N：样品编号；M.P.：流动相，A：正己烷/异丙醇(90/10,v/v)；B：正己烷/乙醇(90/10,v/v)；C：正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)。
色谱参数的定义：容量因子k＝(tR－t0)/t0，其中tR为某化合物一个对映体的保留时间，其中死时间t0用1,3,5-三叔丁基苯来测定；分离因子α＝k2/k1，其中k1和k2分别表示两个对映体的容量因子；分离度Rs＝2(tR2－tR1)/(W1+W2)，其中tR1和tR2分别表示第一、第二个被洗脱的对映体的保留时间，而W1和W2分别表示这两个对映体的峰底宽。
流速：1mL/min。
柱温：25℃。
*空白处表示该样品在固定相上保留时间太长，没有出峰。
表1、手性化合物在CSP1、CSP2、CSPa、CSPb和CSPc上的分离结果*
表2、CSP1对流动相中有机溶剂耐受性的测试结果
流动相：正己烷/乙醇(90/10,v/v)
a：CSP1先在正己烷/异丙醇(90/10)条件下对20个手性样品进行分离测试后，再于正己烷/乙醇(90/10)条件下对20个手性样品进行分离得到的结果；
b：经过a后，在CSP1于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)的流动相中对20个手性样品进行分离后，再将其在正己烷/乙醇(90/10,v/v)的条件下运行的结果；
c：经过b后，以100％乙酸乙酯为流动相，流速为1mL/min，运行7h，再将CSP1在正己烷/乙醇(90/10)条件下对样品进行分离得到的结果；
d：经过c后，以100％氯仿为流动相，流速为1mL/min，运行7h，再将CSP1在正己烷/乙醇(90/10)条件下对样品进行分离得到的结果；
e：经过d后，以正己烷/四氢呋喃(50/50)为流动相，流速为1mL/min，运行7h，再将CSP1在正己烷/乙醇(90/10)条件下对样品进行分离得到的结果；
f：经过e后，以正己烷/四氢呋喃(40/60)为流动相，流速为1mL/min，运行7h，再将CSP1在正己烷/乙醇(90/10)条件下对样品进行分离得到的 结果；
g：经过f后，以正己烷/四氢呋喃(30/70)为流动相，流速为1mL/min，运行7h，再将CSP1在正己烷/乙醇(90/10)条件下对样品进行分离得到的结果。
表3、CSP2对流动相中有机溶剂耐受性的测试结果
流动相：正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)
a：CSP2先依次在正己烷/异丙醇(90/10,v/v)和正己烷/乙醇(90/10,v/v)的条件下对20个手性样品进行分离测试后，再于正己烷/乙醇/甲醇 (90/5/5,v/v/v)条件下对20个手性样品进行分离得到的结果；
b：经过a后，将填充CSP2的手性色谱柱放置两个月，保存流动相为正己烷/异丙醇(90/10,v/v)，在此之后，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)的流动相中对20个手性样品进行分离测试得到的结果；
c：经过b后，CSP2经100％的乙酸乙酯冲洗，流速为1mL/min，运行7h，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)条件下对样品进行分离得到的结果；
d：经过c后，CSP2经100％的氯仿冲洗，流速为1mL/min，运行7h，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)条件下对样品进行分离得到的结果；
e：经过d后，CSP2经正己烷/四氢呋喃(50/50,v/v)冲洗，流速为1mL/min，运行7h，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)条件下对样品进行分离得到的结果；
f：经过e后，CSP2经正己烷/四氢呋喃(40/60,v/v)冲洗，流速为1mL/min，运行7h，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)条件下对样品进行分离得到的结果；
g：经过f后，CSP2经正己烷/四氢呋喃(30/70,v/v)冲洗，流速为1mL/min，运行7h，再于正己烷/乙醇/甲醇(90/5/5,v/v/v)条件下对样品进行分离得到的结果。
Claims (10)
1.壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)，其结构式如下：
其中，取代基R1为异丙基、正丙基、环丙基、环丁基、正戊基、或环己基；
R2为以下基团：
聚合度n为100-2100。
2.壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)，其结构式如下：
其中，取代基R1为以下基团：
R2为以下基团：
聚合度n为100-2100；
其制备方法步骤如下：
1)壳聚糖氨基的酰基化：将脱乙酰度在98％以上的壳聚糖溶于有机酸水溶液中，再向所得溶液中加入过量的所述有机酸的酸酐和甲醇，于室温下反应5-10h，其中壳聚糖重复单元的摩尔数与酸酐的摩尔数之比为1：2.2-10，得到N-酰化壳聚糖；或
将脱乙酰度在98％以上的壳聚糖溶于有机酸水溶液中，再向所得溶液中加入所述有机酸的酸酐和甲醇，于室温下反应5-10h，控制壳聚糖重复单元的摩尔数与酸酐的摩尔数之比在1:2-5之间，得到部分氨基被酰基化的产物，将此产物溶于离子液体中，再加入甲醇和酸酐，于室温下反应5-10h，其中壳聚糖重复单元的摩尔数与后加入的酸酐的摩尔数之比为1：1-3，制得N-酰化壳聚糖；
2)N-酰化壳聚糖的氨基甲酸酯化：将步骤1)得到的N-酰化壳聚糖溶解在氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液中，加入过量的含不同取代基的苯基异氰酸酯，其中N-酰化壳聚糖重复单元摩尔数与异氰酸酯的摩尔数之比为1:2-5，于80-95℃下反应24-36小时生成壳聚糖衍生物，即壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)。
3.一种权利要求1所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)壳聚糖氨基的酰基化：将脱乙酰度在98％以上的壳聚糖溶于有机酸 水溶液中，再向所得溶液中加入过量的所述有机酸的酸酐和甲醇，于室温下反应5-10h，其中壳聚糖重复单元的摩尔数与酸酐的摩尔数之比为1：2.2-10，得到N-酰化壳聚糖；或
将脱乙酰度在98％以上的壳聚糖溶于有机酸水溶液中，再向所得溶液中加入过量的所述有机酸的酸酐和甲醇，于室温下反应5-10h，控制壳聚糖重复单元的摩尔数与酸酐的摩尔数之比在1:2-5之间，得到部分氨基被酰基化的产物，将此产物溶于离子液体中，再加入甲醇和酸酐，于室温下反应5-10h，其中壳聚糖重复单元的摩尔数与后加入的酸酐的摩尔数之比为1：1-3，制得N-酰化壳聚糖；
2)N-酰化壳聚糖的氨基甲酸酯化：将步骤1)得到的N-酰化壳聚糖溶解在氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液中，加入过量的含不同取代基的苯基异氰酸酯，其中N-酰化壳聚糖重复单元摩尔数与异氰酸酯的摩尔数之比为1:2-5，于80-95℃下反应24-36小时生成壳聚糖衍生物，即壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)的制备方法，其特征在于步骤1)所述壳聚糖数均分子量为2万-35万；所述有机酸为R1-COOH。
5.根据权利要求3所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)的制备方法，其特征在于步骤1)所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐。
6.根据权利要求3所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)的制备方法，其特征在于步骤1)中所述的壳聚糖、有机酸水溶液和甲醇的质量比为1:20-70:20-240，有机酸水溶液的质量百分比浓度为1-3％；所述的部分氨基被酰基化的产物、离子液体和甲醇的质量比为1:7-12:1-2；步骤2)中所述的N-酰化壳聚糖、氯化锂和N,N-二甲基乙酰胺溶液的质量比为1:1-1.5:10-15。
7.一种手性固定相，其特征在于含有权利要求1或2所述的壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)。
8.一种权利要求7所述的手性固定相的制备方法，其特征在于：将权利要求1或2所述壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)溶于强极性有 机溶剂中，再将所得溶液与硅胶相混合，随后减压蒸出溶剂，壳聚糖-二(芳香基氨基甲酸酯)-(酰胺)沉积在硅胶的表面，即得到手性固定相。
9.根据权利要求8所述的手性固定相的制备方法，其特征在于：所述强极性有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。
10.根据权利要求8所述的手性固定相的制备方法，其特征在于：所述硅胶为端羟基被封端的硅胶。
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