CN104232686A - 小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α（RORα）腺相关病毒载体及其构建方法，属于疾病的基因治疗领域。本发明所提供的载体基因组小，含4.7～6kb之间的线状单链DNA基因组，本发明采用降低腺病毒污染的三质粒共转染法以及不会破会AAV的肝素琼脂糖纯化法和利用AmiconUtra-15高效的浓缩作用包装rAAV-RORα，且应用于转染肿瘤细胞。该载体可感染分裂期及静止期细胞，整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性且免疫原性弱，可用于体内试验以及体外实验，从而充分发挥AAV载体在基因治疗中的作用，以及RORα于多种重要生理过程的调节作用。

Description

小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体

技术领域

本发明涉及一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α（RORα）腺相关病毒载体及其构建方法，属于疾病的基因治疗领域。

背景技术

   维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptor, RORα, NRIFI)，属类固醇激素受体超家族成员的转录调控因子，可直接进入细胞核调节靶基因的转录，从而参与多种重要生理过程的调节，在形态发育、细胞增殖分化、机体稳态维持、生物代谢调控、高级神经功能控制以及免疫调节等方面发挥重要作用。研究发现，RORα基因缺陷的模型小鼠，体内出现了广泛而严重的功能性障碍，尤其是容易发生自身免疫性疾病和过敏性疾病，或表现出明显的免疫功能异常，如T和B细胞功能缺陷、巨噬细胞释放致炎因子(如IL-1、IL-6、TNF-a)等。RORα与免疫系统的密切关系还在多种动物模型的研究中得以证实，并被视为化学治疗的潜在靶点。

    基因治疗的常用载体包括病毒载体和非病毒载体，非病毒载体转染效率低、体内表达不稳定，包括脂质体、多聚阳离子聚合物、纳米粒、胶束、细菌质粒等；病毒载体不仅有较高的基因转染效率，而且有实现外源基因稳定表达的优势，故是目前基因治疗中应用最广泛的载体类型。但因病毒载体有激活体内原癌基因的可能性而存在安全隐患。逆转录病毒做为载体用于治疗，也有引起死亡和诱发发白血病的报道，因此逐渐被淘汰。腺病毒载体表达外源基因时间短，免疫原性强，可引发机体产生强烈的炎症反应和免疫应答，不适于慢性免疫紊乱性疾病的治疗。

发明内容

   针对上述问题，本发明提供一种二型腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV2)载体，基因组小，含4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组，可感染分裂期及静止期细胞，整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性且免疫原性弱，是目前较为理想的基因治疗载体。

  本发明解决其上述问题所采用的技术方案如下：

1. 小鼠维甲酸相关的孤核受体α（RORα）腺相关病毒载体的构建方法，按照以下步骤进行：

 （1）克隆小鼠RORα基因（参考NCBI中提供的序列：NM_013646.2），应用PCR技术于小鼠的脑组织扩增出RORα mRNA的CDS区，共1572bp，于CDS区的上下游分别引入EcorI和XbaI酶切位点，将琼脂糖凝胶电泳并胶回收后的RORα片段和pMD18T克隆载体(购自TARAKA)进行T-A克隆，转化大肠杆菌Stbl3（购于上海迈其生物科技有限公司）并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行AMP抗性筛选，挑取阳性菌于液体培养菌增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体记为pMD18-T-RORα克隆载体。

 （2）将pMD18-T-RORα以及PZAC2.1(核心质粒)(盘尼西亚大学赠送，本实验室保存)进行EcorI和XbalI双酶切，再分别胶回收琼脂糖凝胶后的PZAC2.1的载体片段和RORα片段，在T4DNA连接酶的作用下连接过夜，同样转化stbl3并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行筛选，挑选阳性菌落，次日取菌液按照菌液与培养基比例为1:100接种于的肉汤增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体命名为pZAC2.1-RORα。

    2. AAV2-RORα（小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒）的包装，按照以下步骤进行：

（1）首先制备各种质粒：pZAC2.1-RORα、pAd-detaF6（辅助质粒）、p5E18（包装质粒）（其中pAd-deltaF6 和 p5E18为盘尼西亚大学赠送，本实验室保存）；

（2）复苏并传代HEK293细胞(购自ATCC)，采用磷酸钙共沉淀的方法将pZAC2.1-RORα、pAd-detaF6、p5E18按一定比例（1:2:1）共转染70%-80%汇合度的HEK293细胞。

（3）过夜更换新鲜完全培养液，48-72小时收获细胞，其间于荧光显微镜下检测转染的效率以及产毒的效果；收获细胞，加DMEN重悬已含病毒的HEK293细胞，-80和-37℃反复冻融三次，加入40微升的Benzonase(250U/微升)，37℃30min，去除非病毒核酸，以3000g常温离心，收集的上清即为病毒粗制液。

（4）加入10%DOC（脱氧胆酸），37℃孵育20min，先后经过5μm和0.8μm的滤膜滤去细胞碎片，收集过滤液。

    3. AAV2-RORα的纯化方法，按照以下步骤进行：

（1）于用于纯化的分离柱内加入肝素琼脂糖，用PBS分2次进行平衡。而后加入步骤（3）所得小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒的包装滤液，调整流速为1滴/秒，直至滤液全部虑过琼脂糖柱子，用洗脱液（0.1M NACL PBS）洗涤柱子，流速控制为1滴/秒，等洗脱液全部流过柱子，最后加入洗脱缓冲液（0.4M MACL PBS），收集洗脱液，留作浓缩。

（2）将离心过滤装置放入离心管中，以灭菌的PBS漂洗滤器。将步骤（1）收集的纯化后的洗脱液加入滤器，4℃、3000rpm离心5分钟，根据流率再离心五分钟，浓缩样本至1mL。加入PBS进行洗涤，离心混匀后收集于Eppendorf 管中4℃保存。

4. AAV2-RORα的滴度的测定，按照以下步骤进行：

在离心管中依次加入病毒液10微升，10×DNaseI缓冲液10微升，40U无PNA酶的DNase I 4微升，无核酸酶的纯H2O76微升，37℃孵育1，以去除未包装成病毒而转入细胞的质粒的干扰而后立即煮沸五分钟，使病毒衣壳裂解，立即冰浴备用。以纯化的重组质粒pZAC2.1-RORα为标准品DNA的模板，用纯的H2O10倍连续稀释成10¹⁰ -10⁴水平，和rAAV2-RORα（重组腺相关病毒载体）一起用荧光定量PCR检测病毒的滴度。

     本发明的有益效果是：

    （1）本发明载体高度稳定，易制备，可浓缩和纯化，无毒性，有利于基因高效转移和长期表达；本研究应用AAV2作为基因治疗载体，AAV2进入细胞的过程是由基础受体(硫酸肝素蛋白多糖受体)和辅助受体[包括1型成纤维细胞生长因子受体(FGFR-1)和整合素αVβ1整合素α5β1]介导产生。AAV2载体对多种组织细胞(如表面具有硫酸肝素蛋白多糖受体的肌肉、视网膜、肝脏、神经元细胞等)具有较好的转导效率。

（2）AAV不能独立复制，需在辅助病毒如腺病毒存在的条件下，才能在感染的宿主细胞中进行复制并合成蛋白,形成新的病毒颗粒。传统包装rAAV载体的方法为“双质粒共转染加辅助病毒(腺病毒)感染法”，即用重组质粒和辅助质粒共转染腺病毒感染的人胚肾293细胞。重组质粒含有目的基因和两端的ITR序列，辅助质粒含有AAV的rep和cap基因，这种方法易被腺病毒污染。本研究为“三质粒共转染法”，首先将小鼠RORα基因成功插入AAV2表达质粒pZac2.1，形成重组质粒Pzac2.1-RORα。其次是应用腺病毒的E1A、E1B、E4、EZA以及VARNA基因片段所构建的腺病毒辅助质粒协P-deltaF6，代替辅助病毒感染，与重组质粒Pzac2.1-T-bet和包装质粒p5E18一起通过磷酸钙共沉淀法转染293细胞，从而生成含目的基因RORα片段的重组腺相关病毒rAAV2-RORα，这种方法既减少了腺病毒污染，又简化了AAV2的包装步骤。

（3）本发明在病毒载体纯化方法上，既往常用的氯化艳梯度密度离心法已被证明会破坏AAV2，由于硫酸乙酞肝素是AAV2的表面受体，因此，利用重力作用,通过肝素琼脂糖亲和层析法分离纯化AAV2成为新方法,且在本研究中得到了成功应用。纯化的rAAV2病毒需要浓缩，因为rAAV2的滴度是影响靶细胞转染效率的重要因素。Amicon Ultra-15离心过滤器为纯化的rAAV2-RORα病毒液提供了简单且快速的浓缩去盐方法，病毒回收率大于95%,浓缩能力达到100倍。

附图说明

    图1为RORα的PCR图，图中泳道1为Marker；泳道2-3为为扩增出的RORα CDS区片段。

    图2为pMD18T-RORα酶切图，图中泳道1为Marker，泳道2，4，5为双酶切结果。  

    图3为PZAC2.1-RORα酶切图，图中泳道1为Marker，泳道2-4为双酶切结果。

    图4为病毒包装过程中eGFP荧光图。

    图5为病毒感染小鼠Levis胃癌细胞图，左图为48h后的荧光图，右图为3天后的荧光图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体描述或作进一步说明，其目的在于更好的理解本发明的技术内涵，但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。

实施例1：表达载体PZAC2.1-RORα的构建

1．小鼠RORα基因的克隆及与pMD-18T克隆载体的连接。

（1）应用Oligo6.0引物设计软件，根据NCBI中小鼠RORα的cDNA序列（ NM_013646.2），和所要连接的表达载体pZAC2.1的酶切位点，设计扩增RORα全长基因的引物如下：

         P1(上游引物)：5’ -GAATTCACATGGAGTCAGCTCCGGCAG -3’，于其5’端引入EcoRI酶切位点；

         P2(下游引物)：5’-TCTAGAGCGCGACATTTACCCATCGATT-3’，于其5’端引入XbaI酶切位点。

（2）应用RT-RCP(逆转录PCR)技术从小鼠的脑组织中扩增出小鼠RORα全长编码基因。

（3） PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1，图中2和3为扩增出的RORα CDS区片段。切取含目的片段的凝胶，并采用promega 公司的胶回收纯化试剂盒，回收并纯化PCR产物。

（4） 纯化的产物与TAKARA公司的T载体进行T-A克隆，16℃反应一小时，而后转化于本实验室保存的大肠杆菌Stbl3并涂布于含有100μg/mL的AMP的肉汤培养板进行筛选，37℃培养16h。

（5） 挑取一个单菌落，转到含100μg/mL的AMP的6mL的肉汤培养基，37℃（250rpm)培养12小时。

（6） 提取菌液质粒DNA，进行酶切鉴定，结果见图2，将鉴定正确的质粒DNA送至上海生工测序，测序正确，并命名为pMD-18T-RORα。

2. AAV2系统的表达载体PZAC2.1-RORα的构建

(1)将经过测序验证的pMD18T-RORα质粒与AAV2系统的表达质粒pZAC2.1一同经过EcoRI/XbaI双酶切，37℃，孵育3h。

(2)取50μL经过1%琼脂糖电泳，分别切取含目的片段以及pZAC2.1载体的凝胶，同样按照以上方式纯化目的片段和载体，应用T4DNA连接酶连接，16℃连接过夜。

(3)连接的产物同样转化于本实验室保存的大肠杆菌Stbl3并涂布于含有100μg/mL的AMP的肉汤培养板进行筛选，37℃培养16h。

(4)方法同前，液体增菌培养并提取质粒，酶切及测序鉴定，酶切结果见图3，将鉴定正确的质粒命名为pZAC2.1-RORα。

实施例2： rAAV2-RORα的包装

(1) 将本实验室保存的HEK293细胞冻存管，于37℃中转动至解冻，按照3x106接种入DMEM完全培养液的10cm培养皿20块，待其生长密度为70%-80%，包装前12h换新鲜培养液。

(2) 采用磷酸钙共沉淀的方法转染293细胞，包装病毒，其中，pZAC2.1-RORα和pAd-deltaF6、p5E18 3质粒按照12.5:25:12.5（μg）的含量及比例转染每皿细胞，其中对照以带有EGFP荧光基团的PZAC2.1-EGFP((盘尼西亚大学赠送，本实验室保存)代替pZAC2.1-RORα，同样的条件包装对照病毒。

(3)配置转染混合物：

       A液：59mL灭菌纯水，6.5 mL 2.5mol/L CaCL2, 1300μg pAd-deltaF6质粒，650μg pZAC2.1-RORα和650μg p5E18质粒。

       B液： 2xHBS

       将A液逐滴加入B液中，并迅速吹打，室温放置20-30min。

(4) 于每只培养皿加入2.5ML转染混合物，第二天更换新鲜DMEN完全培养液，第四天收获细胞。

(5) 收获的细胞置于-80℃和37℃反复冻融三次，加入40μL Benzonase (250U/μL),混匀，37℃孵育30min,去除非病毒核酸，3000g常温10min 离心，收集上清，此为病毒粗制液，即可用于体外实验。

(6)加入10%的脱氧胆酸1.5mL ，孵育，先后经过5μm和0.8μm的滤膜滤去细胞碎片，收集过滤液。

三质粒共转染的HEK293细胞包装rAAV2，病毒包装过程中eGFP荧光结果见图4。

实施例3：rAAV2-RORα的的纯化

(1)于用于纯化的分离柱内加入肝素琼脂糖4mL，用PBS分2次进行平衡。而后加入包装后的滤液，调整流速为1滴/秒，直至滤液全部虑过琼脂糖柱子。

(2)用洗脱液（0.1M NACL PBS）洗涤柱子，流速控制为1滴/秒，等洗脱液全部流过柱子，最后加入洗脱缓冲液（0.4M MACL PBS）,收集洗脱液，留作浓缩。

(3)将Milipore  Amicon Utra-15 100k离心过滤装置放入离心管中，以灭菌的PBS漂洗滤器。将收集的纯化后的洗脱液加入滤器，离心5分钟，根据流率在再离心五分钟，浓缩样本。加入PBS进行洗涤，按上诉步骤离心，混匀后收集于Eppendorf 管中4℃保存。

实施例4：rAAV2-RORα的滴度的测定

(1)在Eppendorf 管中依次加入病毒液10μL，10×DNaseI缓冲液10μL，无RNA酶的DNase I 4μL，无核酸酶的纯水76μL，37℃孵育1h,以去除未包装成病毒而转入细胞的质粒的干扰。

(2) 立即煮沸五分钟，使病毒衣壳裂解，立即冰浴备用。

以纯化的重组质粒pZAC2.1-RORα为标准品DNA的模板，用纯水10倍连续稀释成10¹⁰ --10⁴水平，和纯化前后的rAAV2-RORα一起用荧光定量PCR检测病毒的滴度，根据标准曲线求得其滴度。

实施例5：rAAV2-RORα转染小鼠肺癌细胞系（购自ATCC）

（1）应用转染的浓度应该为10^4-5 v.g/细胞，而我们的纯化前的rAAV2-RORα，滴度为10⁹ v.g/mL， 故于培养的小鼠肺癌细胞加入200μL的未纯化的rAAV2-RORα，对照加入rAAV2-EGFP。

（2）转染后48h看到荧光的表达，而第3天荧光较强，结果见图5。

（3）收获转染了rAAV2-RORα的细胞，提取RNA， RT-QPCR检测其RORα mRNA的表达，含量明显高于对照，约10倍。

Claims (5)

1.一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体为pZAC2.1-RORα，该载体含有小鼠基因RORα mRNA的CDS区序列。

2.根据权利要求1所述的一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体基因组小，能感染分裂期及静止期细胞，整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性且免疫原性弱。

3.一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

（1）克隆小鼠RORα基因，应用PCR技术于小鼠的脑组织扩增出RORα mRNA的CDS区，于CDS区的上下游分别引入EcorI和XbaI酶切位点，将琼脂糖凝胶电泳并胶回收后的RORα片段和pMD18T克隆载体进行T-A克隆，转化大肠杆菌Stbl3并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行AMP抗性筛选，挑取阳性菌于液体培养菌增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体记为pMD18-T-RORα克隆载体；

（2）将pMD18-T-RORα以及PZAC2.1核心质粒进行EcorI和XbalI双酶切，再分别胶回收琼脂糖凝胶后的PZAC2.1的载体片段和RORα片段，在T4DNA连接酶的作用下连接过夜，同样转化stbl3并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行筛选，挑选阳性菌落，次日取菌液按照菌液与培养基比例为1:100接种于的肉汤增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体命名为pZAC2.1-RORα。

4. 一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒的包装方法，其特征在于，采用三质粒磷酸钙共沉淀法转染HEK293细胞，其中所述的三质粒分别为pZAC2.1-RORα、pAd-detaF6、p5E18。

5.  一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒的纯化方法，其特征在于，采用肝素琼脂糖亲和层析法分离纯化rAAV。