CN1958788B - 一种人神经营养素-3基因重组病毒 - Google Patents
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Abstract
一种重组腺病毒，使人神经营养素-3基因(NT-3)与腺病毒经重组连接后，可直接在真核细胞中表达。利用NT-3诱导轴突再生微环境、营养并修复中枢神经损伤的作用，将外源人NT-3基因克隆到缺失了E1区和E3区的复制缺陷型腺病毒内，使其替代腺病毒基因组DNA的E1区，通过CMV启动子控制NT-3基因的表达，再利用腺病毒特异性地将NT-3基因带入受损伤的中枢神经内，表达产生NT-3因子，解决了外源性神经营养因子难以通过血脑屏障进入中枢神经的问题，可用于人中枢神经损伤的修复及神经系统疾病的治疗。
Description
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及通过基因重组获得的含人神经营养素-3(NT-3)基因的重组腺病毒的制备及应用。具体说，本发明涉及腺病毒载体，神经营养素-3(NT-3)，两者通过重组结合的基因工程产物以及该产物的制备方法和在治疗神经系统疾病中的应用。
背景技术：
已有的科学研究表明，众多的人神经系统疾病是由于中枢神经损伤造成的。治疗这类疾病的关键在于营养并修复损伤的中枢神经，而中枢神经损伤后神经元轴突不能再生的主要原因之一是缺乏诱导受损伤轴突再生的微环境。
神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)是诱导轴突再生微环境中的重要因素，利用其特点，可以达到治疗人神经系统疾病的目的。文献(Blits B，OudegaM，Boer GJ，et al.Adeno-associated viral vector-mediated neurotrophin gene transferin the injured adult rat spinal cord improves hind-limb function[J].Neurosci，2003，118(1)：271-281)报道，神经营养因子及其基因转染对神经系统的损伤和疾病具有潜在的治疗作用。文献(Zhou L，Baumgartner BJ，Hill-Felberg SJ，et al.Neurotrophin-3 expressed in situ induces axonal plasticity in the adult injured spinalcord[J].J Neurosci，2003，23(4)：1424-1431)进一步报道神经营养素-3(NT-3)是一种具有广泛生物活性作用的神经营养因子。它能促进神经元及神经胶质细胞存活，促进成年大数横断的皮质脊髓束纤维再生，阻止神经元萎缩和死亡，诱导胚胎神经元分化，促进少突胶质细胞发育，还能诱导培养的海马神经元表达早期即刻基因，增加细胞内钙离子浓度。而最引人注目的是NT-3具有其他神经营养素所没有的功能，即挽救成年大鼠蓝斑核中退行性变神经元免于死亡，提示NT-3对阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)等中枢神经退行性疾病及其损伤方面具有很大的临床应用价值。
但是，人中枢神经系统所具有的免疫学特点使其形成了一种血脑屏障，阻挡了外源蛋白的进入。用于治疗的外源性的人NT-3因子由于难以通过血脑屏障，不能进入中枢神经，所以神经营养因子类药物的的给药途径就成为限制其临床应 用的瓶颈。
基因治疗可以使外源基因在治疗靶区持续稳定的表达，为应用神经营养因子治疗中枢神经系统疾病提供了新的可行性。利用基因技术来研究开发基因治疗药物，已经被公认为21世纪最有应用潜力的治疗技术，可以解决大多数目前难以解决的临床问题。其中，腺病毒载体是目前基因治疗中最常用的转基因载体之一，其在基因治疗中的优越性十分明显，除了感染谱广、安全性高、容量大、体外可操作性好等优点外，尤为重要的是：腺病毒载体利用真核细胞系统表达加工的蛋白能够进行翻译后处理，与天然蛋白的磷酸化、折叠、复折叠、二脂键一致，具有很高的生物活性。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种可在真核细胞中表达人神经营养素-3基因的重组腺病毒以及其制备方法，并揭示它在治疗神经系统疾病中的应用。
本发明提供一种重组病毒，其特征在于该重组病毒可以是腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒。其中优选复制缺陷型腺病毒，最优选缺失了E1区和E3区的复制缺陷型腺病毒。
本发明提供一种重组腺病毒(简称Ad-NT-3)，将外源人NT-3基因克隆到缺失了E1区和E3区的复制缺陷型腺病毒内，使其替代腺病毒基因组DNA的E1区，通过CMV启动子控制NT-3基因的表达，再利用腺病毒特异性地将NT-3基因带入受损伤的中枢神经内，表达产生NT-3因子。其技术方案为以5′CGTCTAGAACAAGGTGTCCAT3′为上游引物和5′CAGGTACCAATTCATGTTCTTCCG3′为下游引物，通过PCR扩增NT-3基因。再用Xba I和Kpn I双酶切NT-3基因和原核质粒pShuttle，连接纯化的NT-3基因和线性化的pShuttle获得穿梭载体pShuttle-NT-3，再将pShuttle-NT-3用I-CeuI和PI-SceI双酶切后，与Adeno-XTMExpression System试剂盒中的腺病毒骨架质粒(已用I-CeuI和PI-SceI切开)连接，阳性病毒克隆经PCR筛选，扩增，转染HEK293细胞培养。
此重组病毒具有下列特点：
1、具有腺病毒载体转染率高、可操作性好，能携带较大的基因，可制备高效价的病毒颗粒，宿主范围广，安全性好，致病性低的优点；同时降低其引起的免疫反应，可使外源基因获得稳定、持久的表达。
2、由CMV启动子控制NT-3基因的高效表达，诱导轴突再生微环境、营养并修复中枢神经损伤，达到治疗神经系统疾病的作用。
3、由病毒载体将NT-3基因导入受损伤的中枢神经内，表达产生NT-3因子，解决了外源性神经营养因子难以通过血脑屏障进入中枢神经的问题。
所采用的NT-3的序列为：
5’-CGACTACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACGGGCCCTCTAGAA
CAAGGTGATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTCTCGCTTATCTCCGTGGCATCCAAGG
TAACAACATGGATCAAAGGAGTTTGCCAGAAGACTCGCTCAATTCCCTCATTATTAAGC
TGATCCAGGCAGATATTTTGAAAAACAAGCTCTCCAAGCAGATGGTGGACGTTAAGGA
AAATTACCAGAGCACCCTGCCCAAAGCTGAGGCTCCCCGAGAGCCGGAGCGGGGAGG
GCCCGCCAAGTCAGCATTCCAGCCAGTGATTGCAATGGACACCGAACTGCTGCGACAA
CAGAGACGC-TACAACTCACCGCGGGTCCTGCTGAGCGACAGCACCCCCTTGGAGCCC
CCGCCCTTGTATCTCATGGAGGATTACGTGGGCAGCCCCGTGGTGGCGAACAGAACAT
CACGGCGGAAACGGTACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGTACTCGGTATGTG
ACAGTGAGAGTCTGTGGGTGACCGACAAGTCATCGGCCATCGACATTCGGGGACACC
AGGTCACGGTGCTGGGGGAGATCAAAACGGGCAACTCTCCCGTCAAACAATATTTTTA
TGAAACGCGATGTAAGGAAGCCAGGCCGGTCAAAAACGGTTGCAGGGGTATTGATGAT
AAACACTGGAACTCTCAGTGCAAAACATCCCAAACCTACGT-CCGAGCACTGACTTCA
GAGAACAATAAACTCGTGGGCTGGCGGTGGATACGGATAGACACGTCCTGTGTGTGTG
CCTTGTCGAGAAAAATCGGAAGAACATGAATTGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCT
GATCAGC-3’
本发明利用腺病毒携带NT-3基因，从机理上解决了外源性神经营养因子难以通过血脑屏障进入中枢神经的问题。用腺病毒以及腺病毒相关病毒进行人中枢神经损伤的修复及神经系统疾病的治疗，病人可在受损伤的中枢神经内持续、高效表达NT-3因子，并且所表达的NT-3因子在蛋白质分子修饰程序上如蛋白质磷酸化、二酯键及蛋白质折叠等方面都具有与真核生物相近的特性，能够克服蛋白不稳定、半衰期短、活性低、成本高等缺点。
其中实验所用的HEK293细胞购买自美国ATCC。所用到的Adeno-XTM Expression System试剂盒(包括携带启动子CMV的穿梭质粒pShuttle和腺病毒骨架)购自CLONTECH公司。
附图说明：
图1是重组腺病毒的碱基序列结构。
图2是腺病毒载体的构建过程示意图。
图3是腺病毒载体的构建流程图。
图4是重组人NT-3基因载体的技术路线框图。
图5是以5′CGTCTAGAACAAGGTGTCCAT3′和5′CAGGTACCAATTCATGTTCTTCCG3′为引物，以从GenBank检索的人NT-3基因为模版，经扩增得到的801bp的RT-PCR产物PAGE图。
图6是pShuttle-NT-3的酶切鉴定电泳图。M：1kb Ladder DNA标志物；1：pShuttle-NT-3；2：pShuttle-NT-3/XbaI+KpnI；3：pShuttle-NT-3/ApaI；4：pShuttle-NT-3/KpnI；5：pShuttle；6：pShuttle/KpnI。
图7表示pAd-NT-3的酶切鉴定电泳图。M：1kb Ladder DNA标志物；1：pAd-NT-3；2：I-CeuI+PI-SceI；3：HindIII；4：XhoI
图8是pAdeno-NT-3转染体外培养的HEK293细胞第10天后，293细胞发生病变(↑，倒置显微镜，×100)。
图9是Ad-NT-3的PCR及RT-PCR鉴定电泳图。M：DL2000 DNA标志物；1：阳性对照；2：RT-PCR产物；3：PCR产物；4：阴性对照。
图10是培养的感染Ad-NT-3的293细胞图片。
图11是培养的感染Ad-LazZ的293细胞图片。
图12是正常的293细胞图片。
图13是293细胞内NT-3的Western blot结果电泳图。1：NT-3条带；2：阴性对照；3：空白对照。
图14是NT-3基因修饰施万细胞+神经干细胞荧光标记细胞图，其中蓝色荧光标记神经干细胞核，红色荧光标记阳性细胞浆。
图15是LacZ基因修饰施万细胞+神经干细胞荧光标记细胞图，其中蓝色荧光标记神经干细胞核，红色荧光标记阳性细胞浆。
图16是单纯神经干细胞荧光标记细胞图，其中蓝色荧光标记神经干细胞核，红色荧光标记阳性细胞浆。
具体实施例：
实施例1：如图1、图2和图3所示，构建重组腺病毒
构建人神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因重组的腺病毒表达载体。
从人脑组织mRNA中扩增NT-3基因全长cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle中，获得一个带有CMV启动子的表达盒。再将表达盒与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接，形成重组腺病毒质粒(pAd-NT-3)。用pAd-NT-3转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-NT-3)。
(1)引物设计合成：从GenBank检索人NT-3基因，针对基因全长，设计两端引物：5’-CGTCTAGAACAAGGTGTCCAT-3’和5’-CAGGTACCAATTCATGTTCTTCCG-3’。上、下游引物5′端分别包含XbaI和KpnI限制性内酶酶切位点，反应条件为：42℃60分种反转录，95℃50分种灭活反转录酶AMV；然后做PCR：94℃1分种、53℃1分种30秒、72℃50分种，35个循环，最后72℃7分种。另设一阴性对照，以dH20代替cDNA，其余相同。反应结束后，用PAGE分析结果如图4所示，扩增产物为801bp。M：DL2000DNA标志物；1：RT-PCR产物；2：阴性对照。
(2)克隆穿梭载体pShuttle-NT-3的构建及鉴定：将RT-PCR反应液经0.8％琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化目的基因片断。分别用Xba I和Kpn I双酶切目的基因及载体pShuttle，反应条件：16℃温育过夜。连接纯化NT-3基因和线性化的pShuttle，产物，按常规方法转化DH5α菌感受态，将转化菌涂布于含20mg/mL卡那霉素的LB琼糖平板上，37℃培养过夜。挑取存活的菌落，扩增并提取质粒，进行Xba I和Kpn I酶切鉴定，结果如图5所示，可见4K和800bp、5kb、4.7kb和242bp的条带。
(3)重组腺病毒载体pAdeno-NT-3的构建及鉴定：将pShuttle-NT-3用I-CeuI和PI-SceI双酶切后，与Adeno-XTM Expression System试剂盒中的腺病毒骨架质粒(已用I-CeuI和PI-SceI切开)连接，常规方法转化后，将转化菌涂布于含501g/mL氨苄的LB琼脂糖平板，37℃过夜培养。挑取菌落，PCR鉴定，选阳性克隆扩增并提取质粒，HindIII和xhoI酶切鉴定，结果如图6所示，可见14502bp，8057bp，7514bp，2802bp，2466bp，1445bp，595bp和8010bp，5926bp，5324bp，4597bp，3825bp，3025bp，3064bp，2937bp，2081bp，75bp条带，证明NT-3基因已插入腺病毒骨架中。
(4)细胞包装：pAdeno-NT-3用PacI酶切成线性后，用脂质体介导在24孔板内转染HEK293细胞，细胞长满后，转入25m2培养瓶内继续培养，转染后第10天出现293细胞病变(cytopathic effect，CPE)。收集病变细胞于-80℃/37℃反复冻融3次获得病毒粗裂解液，并反复感染293细胞扩增病毒。结果如图7所示，第4-5天，细胞出现收缩、变圆等病理改变，第9-10天细胞出现噬斑，噬斑周围病变细胞呈原形，第12天有部分细胞剥离。
(5)重组腺病毒的鉴定：抽提病毒DNA为模板，以表达盒的一段序列 5’-AACCCACTGCTTACTGGCT-3’为上游引物和目的基因的下游引物5’-CAGGTACCAATTCATGTTCTTCCG-3’进行PCR鉴定，反应条件为：94℃1min、53℃1′30″、72℃50min，35个循环，最后72℃7min；用Ad-NT-3感染293细胞12小时后收获细胞，Trizol试剂提取总RNA进行反转录，42℃60min反转录，95℃5min灭活反转录酶AMV；然后做RT-PCR鉴定，反应条件同前，另设一阴性对照，以未感染病毒293细胞RNA反转录成的cDNA为模板，其余相同，阳性对照以质粒pAd-NT-3为模板。结果如图8所示，二者均扩增出约900bp左右的特异性条带，与阳性对照相符。阴性对照无片段扩出。
所构建的重组腺病毒的核酸碱基序列如图1所示。
实施例2：重组NT-3腺病毒功能鉴定
用Ad-NT-3感染293细胞，做免疫细胞化学、ELISA及Western blot，检测Ad-NT-3的体外表达。
(1)免疫细胞化学：粗裂解的病毒液感染293细胞，约培养12h后，用4％多聚甲醛固定293细胞，兔抗人NT-3为一抗做免疫细胞化学染色，DAB显色，阴性对照的293细胞感染Ad-LacZ，空白对照的293细胞没有腺病毒感染。结果如图9所示，感染Ad-NT-3的293细胞呈强阳性染色，感染Ad-LacZ的293细胞以及293细胞本身呈阴性染色。
(2)ELISA：6孔板内接种293细胞(4.5×105个/孔)，加入MOI为1的Ad-NT-3病毒液，24小时后换成含10％新生牛血清的DMEM培养液，继续培养48小时后收集培养液，做ELISA检测。同时设Ad-LacZ的阴性对照和不加病毒液的空白对照。结果如表1所示：感染Ad-NT-3的293细胞分泌的NT-3浓度最高。 应用SPSS10.0统计软件作方差分析，具有统计学显著性差异。
表1 3种处理的293细胞分泌的NT-3浓度(pg/mL)的比较
(3)Western blot：粗裂解的Ad-NT-3病毒液感染25cm2的293细胞(约2×106 个)，感染24小时后裂解细胞做Western blot，一抗为兔抗人NT-3。同时设立 Ad-LacZ感染的293细胞和不加病毒液的293细胞作为对照。结果如图10，感染Ad-NT-3的293细胞有特异性NT-3条带，分子量大小约为18KD。阴性对照和空白对照均无此特异性条带。
实施例3：Ad-NT-3对神经干细胞体外分化影响
将实施材料分成4组，A组为NT-3基因修饰施万细胞+神经干细胞组，B组为LacZ基因修饰施万细胞+神经干细胞组，C组为施万细胞+神经干细胞组，D组为单纯神经干细胞组。
将2块24孔培养板共48个孔分成4组，每组12孔，在各孔中加入1块消毒盖玻片，用多聚赖氨酸进行铺板。培养纯化后的施万细胞经胰酶消化并制成2.5×104个细胞/mL。在A、B、C组各孔加细胞悬液200μL，培养24h后，A、B组分别按前述方法接种Ad-NT-3和Ad-LacZ，C组不接种腺病毒，D组只用多聚赖氨酸铺板。将培养纯化的神经干细胞用Hoechst33342(10μg/mL)标记2h，含10％FBS的DMEM/F12培养液清洗并用极细的吸管尽可能将神经干细胞克隆球吹打散开。细胞计数后制成5×103个细胞/ml的细胞悬液。当A、B组基因修饰完成后，吸去A、B、C组培养孔内的原培养液，向包括D组在内的所以各孔内加入200μL神经干细胞悬液。继续培养2d后用含2.5％多聚甲醛的PBS固定，然后分别进行NF和GFAP的SABC-Cy3免疫荧光细胞化学。如图11，在荧光显微镜下观察经Hoechst33342标记的神经干细胞核(蓝色荧光)和Cy3免疫标记的阳性细胞胞浆(红色荧光)以及双标记情况，结果如表2所示，核荧光Hoechst33342标记的细胞中NF阳性细胞率在LacZ基因修饰施万细胞+神经干细胞组与施万细胞+神经干细胞组之间无显著差异(p＞0.05)，而其NF阳性细胞率显著高于单纯神经干细胞组(p＜0.05)，低于NT-3基因修饰施万细胞+神经干细胞组(p＜0.05)。本研究发现，人NT-3基因腺病毒转染的293细胞分泌的NT-3能更好地促进体外培养的神经干细胞分化为神经元样细胞。这为我们下一步应用人NT-3基因腺病毒转染的施万细胞，与神经干细胞联合移植治疗中枢神经损伤性疾病奠定了基础。
表2 NF阳性细胞数占Hoechst33342标记细胞数的百分率 
注：aVSb，aVSc，bVSd，cVSd p＜0.05；aVSd p＜0.01；bVSc P＞0.05A组为NT-3基因修饰施万细胞+神经干细胞组，B组为LacZ基因修饰施万细胞+神经干细胞组，C组为施万细胞+神经干细胞组，D组为单纯神经干细胞组。
Claims (7)
1.一种重组病毒，其特征是该病毒含有转入的基因碱基序列为序列SEQ ID NO：1的人神经营养素-3因子。
2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于该重组病毒是腺病毒或腺病毒相关病毒或逆转录病毒。
3.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于该病毒为重组腺病毒，其中人神经营养素-3结构基因DNA序列为序列SEQ IDNO：1。
4.一种病毒载体，其特征在于含有如权利要求1至3任一所述的重组病毒。
5.一种真核表达系，其特征在于含有如权利要求1至3任一所述的含有人神经营养素-3基因的重组病毒。
6.一种治疗神经系统疾病药物组合物，其特征在于含有如权利要求4所述的病毒载体。
7.一种治疗神经系统疾病药物组合物，其特征在于含有如权利要求5所述真核表达系。
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| BLITS B, ET AL,.ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR-MEDIATEDNEUROTROPHIN GENE TRANSFER IN THE INJUREDADULT RAT SPINAL CORD IMPROVEDS HIND-LIMCFUCTION.NEUROSCI118 1.2003,118(1),271-281. |
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| 王俊梅，等，.人神经营养素－3基因重组腺病毒载体的构建、表达和生物活性检测.解剖学报36 5.2005,36(5),460-464，具体参见摘要，第464页讨论第1段. |
| 王俊梅,等,.人神经营养素-3基因重组腺病毒载体的构建、表达和生物活性检测.解剖学报36 5.2005,36(5),460-464,具体参见摘要,第464页讨论第1段. * |
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