CN115807039A - fiber假型禽4型腺病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了fiber假型禽4型腺病毒载体及其应用，载体包括禽4型腺病毒的基因组序列、pBR322的复制起点核酸序列和卡那霉素抗性核酸序列。所述基因组序列经过人工改造，包括：将fiber2的knob编码序列替换为CELO病毒fiber1的knob编码序列；在外源基因表达框启动子上游和目的基因编码区下游分别添加一个限制性内切酶SwaI酶切位点。本发明改造后的禽4型腺病毒载体能够提高对哺乳动物细胞和禽类细胞的基因转导效率，可以用于制备哺乳动物的重组疫苗或基因治疗试剂盒，也可以用于制备禽类的重组疫苗。

Description

fiber假型禽4型腺病毒载体及其应用

技术领域

本发明属于基因治疗和重组疫苗领域，具体而言，本发明涉及fiber假型禽4型腺病毒载体及其应用。

背景技术

腺病毒是一类非包膜病毒，其病毒粒子包裹长度为26-48 kb的线性双链DNA基因组。腺病毒科由6个属组成，其中哺乳动物腺病毒仅感染哺乳动物宿主，而鸟腺病毒仅发现于鸟类^[1]。人类腺病毒（HAdV），特别是人5型腺病毒（HAdV-5），已得到深入研究。腺病毒已从人，黑猩猩，猴，牛，羊，猪，狗，小鼠和其他哺乳动物中分离到，其中一些已被构建为基因转移载体。与其他病毒载体相比，腺病毒载体具有一些特征，其基因组稳定且便于遗传操作，可规模化生产和纯化，基因转移效率高，具有遗传安全性^{[2, 3]}。腺病毒载体已被广泛用于基因治疗和疫苗开发^{[2, 4]}。

预存免疫是腺病毒载体在人类基因治疗和疫苗接种中应用的主要障碍^{[5, 6]}。腺病毒是在人类广泛传播的病原体，成人中HAdV-5血清中和抗体阳性率高达50-90%，这降低了HAdV-5载体疫苗的免疫效果^{[7, 8]}。为了克服这一障碍，构建基于罕见血清型、非人类腺病毒甚至禽腺病毒载体的研究增多^[9-13]。

禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）归类于鸟腺病毒属。禽腺病毒基因组大小为43-46kb，比哺乳动物腺病毒长7-10kb。禽腺病毒基因组中部是属共有基因，表达病毒结构蛋白、病毒基因组复制酶或者参与病毒颗粒组装的蛋白质，在整个腺病毒科中都相对保守；属特异基因位于基因组左右两侧，其表达产物主要参与病毒与宿主的相互作用，为病毒复制营造适宜的细胞内环境。FAdV的属特异基因与哺乳动物腺病毒没有同源性，这使得FAdV无法在哺乳动物细胞复制。最近的研究结果表明，单个属特异基因对于禽4型腺病毒（FAdV-4）在体外复制都不是必需的^[14]。FAdV的上述特性使得FAdV载体与哺乳动物腺病毒载体具有互补性。

禽4型腺病毒（FAdV-4）的基因组已经得到克隆，并以其为基础构建了FAdV-4载体系统^{[15, 16]}。与现有腺病毒载体相比，FAdV-4载体可能优势和潜力表现在：外源基因载量大；其与哺乳动物腺病毒亲缘关系远，不能在哺乳动物细胞复制，安全性更高；作为哺乳动物基因转移载体时，FAdV-4自身基因的表达水平会更低，这将有利于延长目的基因的表达时间。此外，FAdV-4还可以用作禽类传染病的疫苗载体。野生型FAdV-4能够在肉鸡引发肝炎-心包积水综合征，主要通过粪口途径在鸡群传播，以其作为载体，可以制备其他禽病（例如禽流感、新城疫、传染性法氏囊病等）的载体疫苗，将可以同时预防鸡引发肝炎-心包积水综合征。同时，FAdV物理性质更稳定，可以用鸡胚扩增，因而载体的制备成本更低。如果采用口服途径免疫，将进一步减小病毒纯化、接种器材和人力成本。

FAdV-4载体用于哺乳动物的困难在于FAdV对哺乳动物细胞的基因转移效率低。嗜向性是选择腺病毒载体时需要考虑的最重要特性之一[5,6]。对靶细胞的亲和力越高，意味着基因转移效率越高，使用剂量越低，而副作用越小。不同的腺病毒具有不同的细胞嗜向性。然而，建立新的腺病毒载体系统是一项复杂的工作，并且新的腺病毒载体并不总是能满足嗜向性需求。因此靶向性修饰就成了腺病毒载体构建的一个重要内容。腺病毒感染细胞起始于衣壳蛋白的fiber的knob结构域与细胞表面的病毒受体结合，从而启动内吞过程。不同腺病毒的fiber不同，因而细胞结合受体不同。感染效率低的原因一般是由于靶细胞缺少fiber的对应受体。腺病毒靶向性改造的方法包括fiber knob结构域的替换，外源多肽插入fiber、pIX或Hexon蛋白等[5,6]。

目前缺少能够应用于哺乳动物的高效FAdV载体，鉴于FAdV载体能够互补现有哺乳动物腺病毒应用的某些缺陷，因此，本领域对靶向哺乳动物细胞的禽腺病毒载体存在需求。另外，如果能进一步提高FAdV对禽类组织细胞的基因转移效率，也有助于减少载体疫苗的使用剂量，增强免疫效果。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种高效转导哺乳动物细胞或禽类细胞的禽4型腺病毒载体及其应用。本发明改造后的禽4型腺病毒载体能够提高对哺乳动物细胞和禽类细胞的基因转移效率，可以用于制备哺乳动物或禽类的重组疫苗或基因治疗试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种高效转导哺乳动物或禽类细胞的禽4型腺病毒载体，载体包括人工改造的禽4型腺病毒（FAdV-4）基因组序列、pBR322复制起点核酸序列和卡那霉素抗性核酸序列；所述人工改造FAdV-4基因组序列中删除了ORF0, ORF1, ORF1B,ORF2和ORF19A病毒基因；在基因组左侧原属特异基因位置放置有外源基因表达框，包括CMV启动子、GFP基因编码区和SV40 polyA加尾信号；并且对病毒基因组fiber2核酸序列进行改造，将fiber2基因knob编码序列替换为鸡胚致死孤儿病毒（chick embryo lethal orphanvirus, CELO）fiber1的knob序列；为了便于外源基因表达框的替换，在CMV启动子上游和GFP基因编码区下游分别添加了限制性酶切位点。

本发明中，由已有的FAdV-4载体系统出发，对原有系统进行改造，进一步删除了ORF0基因，在外源基因表达框（包括CMV启动子和GFP报告基因）两侧分别添加SwaI酶切位点，构建了pKFAV4S-GFP腺病毒质粒，建立了新的基于单质粒的FAdV-4载体系统。在新的系统，仅需要一个腺病毒质粒pKFAV4S-GFP，PCR扩增靶基因，通过限制性酶切-组装（restriction-assembly）或酶切-连接克隆，即可构建携带靶基因的腺病毒质粒；再使用PmeI酶切线性化该质粒，转染鸡细胞（例如LMH细胞），能够拯救出重组病毒。而原有系统，需要使用穿梭质粒、中间质粒和骨架质粒，进行多次克隆操作，才能获得拯救用腺病毒质粒。

在制备pKFAV4S-GFP腺病毒质粒的基础上，对fiber2基因核酸序列进行了改造，将fiber2的knob序列替换为CELO病毒fiber1的knob序列。

具体的，发明人先对前期构建的中间质粒pKFAV7087-Che进行改造，将改造后的中间质粒整合到感染性克隆质粒pKFAV4M，得到单质粒的FAdV-4载体系统pKFAV4S-GFP。pKFAV4M含有AvrII位点突变的FAdV-4基因组，该FAdV-4基因组与野生型FAdV-4基因组（GenBank：MG547384）仅有一个核苷酸的差异，即fiber2基因内部的AvrII位点cctagg被同意突变为cctTgg。中间质粒pKFAV7087-Che含有FAdV-4基因组左右两侧AvrII和SpeI位点以外的序列，其中属特异基因ORF0, ORF1, ORF1B, ORF2和ORF19A缺失；同时pKFAV7087-Che在FAdV-4基因组左侧位置还含有外源基因表达框，包括CMV启动子、mCherry基因编码区和SV40 polyA加尾信号。先对pKFAV7087-Che进行改造，删除ORF0，更换外源基因为GFP编码区，并且在CMV启动子上游和mCherry编码区下游分别添加一个SwaI酶切位点，得到中间质粒pK6797-GFP。再将pK6797-GFP替换pKFAV4M相应部位，得到腺病毒质粒pKFAV4S-GFP。

对pKFAV4S-GFP质粒的fiber2基因进行改造。先前构建的中间质粒pMD-FAV4Fs质粒含有FAdV-4的fiber1和fiber2基因，PCR扩增CELO病毒fiber1 knob序列通过重叠延伸PCR和酶切-连接克隆，将CELO fiber1 knob （CF1K）序列替换FAdV-4 fiber2中对应部分，构建新的中间质粒pMD-FAV4FS-F2CF1K质粒。再通过限制性酶切-组装方法，将改造后质粒pMD-FAV4FS-F2CF1K的fiber基因替换pKFAV4S-GFP质粒的对应部分，得到最终的腺病毒质粒pKFAV4S-F2CF1K-CG。

pKFAV4S-F2CF1K-CG是携带GFP基因的腺病毒质粒，可以采用已知的限制性酶切-组装方法构建携带其他报告基因或目的基因的腺病毒质粒。PmeI酶切线性化腺病毒质粒，转染包装细胞，可以制备和扩增重组腺病毒。本发明的重组腺病毒是fiber假型FAdV-4载体，能够有效地转导哺乳动物细胞或禽类细胞，包括人类细胞或鸡细胞，提高基因转导效率。

本发明的第二目的是提供上述的fiber假型禽4型腺病毒载体在制备基因治疗试剂盒或疫苗中的应用。

本发明的第三目的是提供一种基因治疗试剂盒，包括上述方案所述的fiber假型禽4型腺病毒载体；

优选的，所述禽4型腺病毒载体中携带与治疗哺乳动物疾病相关的外源基因。

取决于选择的外源目的基因，所得的基因治疗试剂盒可用于治疗哺乳动物中与所述外源目的基因相关的疾病。例如，将免疫调节因子GM-CSF插入腺病毒质粒，利用所述fiber修饰的FAdV-4腺病毒质粒制备所需要的重组病毒，可以用于治疗人类相关恶性肿瘤。

本发明的第四目的是提供一种重组疫苗，所述重组疫苗采用上述的fiber假型禽4型腺病毒载体，载体中携带与预防哺乳动物或禽类传染病相关的外源基因。

取决于携带的外源目的基因，所得的重组疫苗可用于预防哺乳动物或禽类中与所述外源目的基因相关的疾病，包括但不限于：在温血动物中传播的狂犬病、包虫病或埃博拉出血热等，在禽类传播的禽流感、新城疫、传染性法氏囊病等。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明的fiber假型禽4型腺病毒载体，对其FAdV-4 fiber2基因进行了改造，改造后的禽4型腺病毒载体能够提高对哺乳动物细胞和禽类细胞的基因转移效率。因此，本发明制备了能够用于转导哺乳动物细胞或禽类细胞的高效FAdV载体。

2、本发明的fiber假型禽4型腺病毒载体可以携带外源目的基因，能够用于制备哺乳动物重组疫苗或基因治疗试剂盒，也能够用于制备禽类的重组疫苗，具有广阔的应用前景。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是单质粒pKFAV4S-GFP禽4型腺病毒载体系统构建示意图；其中，Kan：卡那霉素抗性开放阅读框（kanamycin resistance ORF）； Ori：pBR322复制起点（origin ofreplication）；CMVp：人巨细胞病毒启动子；ITR：反向末端重复序列；mCherry：红色荧光蛋白报告基因；GFP：绿色荧光蛋白报告基因；pA：SV40 polyA加尾信号。

图2显示fiber假型禽4型腺病毒载体构建过程。图2A是fiber假型禽4型腺病毒载体pKFAV4S-F2CF1K-CG的构建示意图；图2B显示改造后的FAdV-2 fiber2蛋白序列拼接部位的细节；其中，Amp：氨苄青霉素抗性开放阅读框（ampicillin resistance ORF）； Ori：pBR322复制起点（origin of replication）；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框（kanamycinresistance ORF）；CMVp：人巨细胞病毒启动子；ITR：反向末端重复序列；GFP：绿色荧光蛋白报告基因；CF1K：CELO病毒fiber1基因knob编码序列；F2-ST：FAdV-4 fiber2基因杆部（shaft）和尾部（tail）编码序列。

图3是在腺病毒质粒pKFAV4S-F2CF1K-CG中替换目的基因表达框构建pKFAV4S-F2CF1K-EG质粒示意图；其中，Kan：卡那霉素抗性开放阅读框（kanamycin resistanceORF）；Ori：pBR322复制起点（origin of replication）；CMVp：人巨细胞病毒启动子；ITR：反向末端重复序列；GFP：绿色荧光蛋白报告基因；CF1K：CELO病毒fiber1基因knob编码序列；F2-ST：FAdV-4 fiber2基因杆部（shaft）和尾部（tail）编码序列；EF1ap：人EF1a基因启动子；pA：SV40 polyA加尾信号。

图4显示重组腺病毒FAdV4-F2CF1K-CG在鸡LMH细胞拯救过程中形成荧光灶和噬斑。

图5是腺病毒FAdV4-F2CF1K-CG基因组和质粒pKFAV4S-F2CF1K-CG酶切鉴定示意图；其中，M1：M1: Lambda/HindIII DNA分子量标记；M2：DL-2000分子量标记；G：基因组DNA；P：质粒DNA。基因组酶切片段分子量（bp）：AgeI, 11688, 7081, 5495, 2854, 2623, 2077,1946, 1598, 1507, 1476, 1082; BspHI, 14,730, 8092, 5113, 3296, 3185, 2474,1440, 1395; ScaI, 9473, 7406, 5942, 5522, 3641, 3398, 2561, 1461。质粒酶切片段分子量（bp）：AgeI, 11688, 7081, 5495, 5060, 2854, 2623, 2077, 1946, 1598, 1476;BspHI, 14730, 8892, 5113, 3296, 3185, 2474, 1786, 1440, 1395; ScaI, 9473,7406, 5942, 5522, 4377, 3641, 3398, 2561。小于1000bp条带分子量未给出。

图6显示重组腺病毒FAdV4-F2CF1K-EG在鸡LMH细胞拯救过程中形成荧光灶和噬斑。

图7是腺病毒FAdV4-F2CF1K-EG基因组和质粒pKFAV4S-F2CF1K-EG酶切鉴定示意图；其中，M1：M1: Lambda/HindIII DNA分子量标记；M2：DL-2000分子量标记；G：基因组DNA；P：质粒DNA。基因组酶切片段分子量（bp）：AgeI, 11688, 7081, 5495, 3168, 2854, 2623,1946, 1598, 1507, 1476; BstZ17I, 12141, 6118, 5557, 4639, 2755, 2545, 2494,2337, 1956, 1018; ScaI, 10194, 7406, 5942, 5522, 3641, 3398, 2561, 1461。质粒酶切片段分子量（bp）：AgeI, 11688, 7081, 5495, 4690, 3168, 2854, 2623, 1946,1598, 1476; BstZ17I, 12141, 9046, 6118, 4639, 2755, 2545, 2494, 2337,1956;ScaI, 10194, 7406, 5942, 5522, 4377, 3641, 3398, 2561。小于1000bp条带分子量未给出。

图8显示重组腺病毒FAdV4-F2CF1K-CG对人类细胞系感染的荧光显微镜观察结果；以未改造的原始载体FAdV4-CG为对照。

图9显示重组腺病毒FAdV4-F2CF1K-CG对人类细胞感染的流式细胞术分析结果，以未改造的原始载体FAdV4-CG为对照。

图10显示重组腺病毒FAdV4-F2CF1K-CG对禽类细胞系感染的显微镜观察结果，以未改造的原始载体FAdV4-CG为对照。

图11显示重组腺病毒FAdV4-F2CF1K-CG对禽类细胞感染的流式细胞术分析结果，以未改造的原始载体FAdV4-CG为对照。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例中的附图对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施例中所用的出发腺病毒质粒pKFAV4M、pKFAV7087-Che、pKFAV4GFP、pMD-FAV4Fs和pKFAV4F1IJR-EG的构建过程已经公开发表^[15-18]；CELO病毒（VR-432，GenBank: NC_001720）购自购自美国模式培养物保藏库（American type culturecollection，ATCC）。

pKFAV4M质粒含有FAdV-4基因组（GenBank：MG547384），该FAdV-4基因组与野生型FAdV-4基因组（GenBank：MG547384）仅有一个核苷酸的差异，即fiber2基因内部的AvrII位点cctagg被同意突变为cctTgg^{[15, 16]}。质粒pKFAV7087-Che含有FAdV-4基因组左右两侧AvrII和SpeI位点以外的序列，其中属特异基因ORF0, ORF1, ORF1B, ORF2和ORF19A缺失；同时pKFAV7087-Che在FAdV-4基因组左侧位置还含有外源基因表达框，包括CMV启动子、mCherry基因编码区和SV40 polyA加尾信号；pKFAV7087-Che也含有FAdV-4基因组左右两侧AvrII和SpeI位点以内约25bp的序列，用于Gibson组装^[16]。pKFAV4GFP质粒含有FAdV-4基因组，其ORF1，ORF1b和ORF2由人巨细胞病毒启动子（CMVp）和SV40病毒polyA加尾信号控制的绿色荧光蛋白（GFP）编码区取代；由pKFAV4GFP拯救的重组病毒FAdV4-CG含有原始的FAdV-4病毒外壳，在本发明中用作对照病毒，具体构建过程参照CN108660158专利申请。pMD-FAV4Fs质粒含有FAdV-4基因组MauBI/SbfI位点内侧全部和外侧约25bp的序列，含有FAdV-4fiber1和fiber2基因^[18]。pKFAV4F1IJR-EG含有人EF1a启动子控制的GFP基因表达框^[17]，在本发明中用作扩增外源基因表达框的PCR反应模板，以验证在载体中更换目的基因表达框的操作，可以选用其他含有外源基因表达框的质粒或DNA代替。

试剂：PCR耐热DNA聚合酶（Q5高保真DNA聚合酶）和DNA组装试剂（NEBuilder HiFiDNA Assembly Master Mix, Cat. E2621）购自美国NEB公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Cat. D4045）和DNA片段纯化和浓缩试剂盒（Cat. D4010）购自ZYMO RESEARCH公司；各种限制性内切酶购自NEB或Takara Bio公司；大肠杆菌TOP10感受态细胞购自天根生化科技有限公司；PCR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；人类细胞系293（Cat. CRL-1573）、HEp-2（Cat. CCL-23）和鸡肝癌细胞系LMH（Cat. CRL-2117）购自美国模式培养物保藏库（American type culture collection，ATCC）；原代鸡胚成纤维细胞分离自13日龄鸡胚^[19]。质粒转染用jetPRIME试剂购自法国Polyplus公司。

实施例1、构建腺病毒质粒pKFAV4S-GFP

禽4型腺病毒质粒pKFAV4S-GFP构建过程见图1。

以pKFAV7087-Che质粒为模板，2009FAV4SwaI1: gatggattgc acgcaggttc tcc和2009FAV4SwaI2r: tgattactat ttaaatagga agatctgtaa cgaaaggacg为引物PCR扩增EagI-ES片段（1395bp），该片段含有Kan编码区以及FAdV-4基因组ITR至包装信号部分；以pKFAV4GFP质粒为模板，2009FAV4SwaI3f：tcgttacaga tcttcctatt taaatagtaatcaattacgg ggtcattagt tca和2009FAV4SwaI4: cggtggatcg gatatcttat ctagatttaaatgtcgactt agagtccgga cttgtac为引物PCR扩增CMVp-GFP片段（1398bp），该片段含有CMVp控制的GFP表达框；电泳回收上述2个片段；EagI/HindIII双酶切pKFAV7087-Che，回收4089bp片段；上述3个片段进行DNA组装反应（NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix）。组装产物转化大肠杆菌TOP10感受态菌株，涂布含卡那霉素的LB平板，筛选得到质粒pKFAV4S-GFP。

该质粒含有FAdV-4基因组，缺失ORF0, ORF1, ORF1B, ORF2和ORF19A基因；在基因组左侧原属特异基因位置放置有外源基因表达框，包括CMV启动子、GFP基因编码区和SV40polyA加尾信号；在CMVp上游和GFP下游分别含有一个SwaI位点。通过SwaI酶切，利用建立的限制性酶切-组装技术，可以方便的更换目的基因表达框。

实施例2、将pKFAV4S-GFP质粒的fiber2基因knob编码区替换为CELO病毒fiber1knob的编码序列，得到腺病毒质粒pKFAV4S-F2CF1K-CG

质粒pKFAV4S-F2CF1K-CG构建过程见图2A。

以pMD-FAV4Fs质粒为模板，2206FAV4F2-CF1K1: cttacggtct ccgccaatggccttgggctg aagtacgaca ct和2206FAV4F2-CF1K2: gtgtggaact tcccccccct ccgaccacggtta为引物PCR扩增103bp片段；以2206FAV4F2-CF1K7：ggtactatca atgactctac agctgtccagcggcct和2206FAV4F2-CF1K8：gattggacgc gggaacaaag gagag为引物PCR扩增153bp片段。以CELO病毒基因组为模板，以2206FAV4F2-CF1K3：gagggggggg aagttccaca cccgaggtg和2206FAV4F2-CF1K4：gggatcgaag aagttagtac ccgaggagtt c为引物PCR扩增587bp片段；以2206FAV4F2-CF1K5：gaactcctcg ggtactaact tcttcgatcc c和2206FAV4F2-CF1K6：ggacagctgt agagtcattg atagtacccc agataagtaa acg为引物PCR扩增114p片段。上述4个PCR片段等摩尔混合，作为模板，以2206FAV4F2-CF1K1和2206FAV4F2-CF1K8为引物，重叠延伸PCR扩增CF1K片段（877bp），电泳割胶回收。AvrII/HindIII双酶切pMD-FAV4FS（754,4853bp），电泳割胶回收4853bp，与CF1K片段进行DNA组装，得到pMD-FAV4FS-F2CF1K质粒。KpnI/EcoRV双酶切pMD-FAV4FS-F2CF1K（2970, 2637bp），电泳割胶回收2970bp；MauBI/SbfI双酶切pKFAV4S-GFP（2903, 40335bp），电泳割胶回收40335bp；两片段混合，进行DNA组装，得到pKFAV4S-F2CF1K-CG质粒。

pKFAV4S-F2CF1K-CG含有CELO病毒fiber1 knob（CF1K）假型的fiber2基因，质粒的其他部分与pKFAV4S-GFP相同。CF1K与FAdV-4 fiber2拼接部位氨基酸序列的细节见图2B。

实施例3、使用限制性酶切-组装方法在腺病毒质粒pKFAV4S-F2CF1K-CG更换外源基因表达框

将pKFAV4S-F2CF1K-CG质粒中外源基因表达框更换为人EF1ap-GFP的构建过程如图3所示。

以pKFAV4F1IJR-EG质粒为模板，以2207F2CF1KEGf：cgtcctttcg ttacagatct tcct和2207F2CF1KEGr：cggtggatcg gatatcttat ctaga为引物，PCR扩增EF1a启动子和GFP基因编码区（EF1ap-GFP，2126bp），电泳割胶回收。SwaI酶切pKFAV4S-F2CF1K-CG质粒（2471,41560 bp），电泳割胶回收41560bp。两片段混合，进行DNA组装，得到pKFAV4S-F2CF1K-EG腺病毒质粒。

以PCR或重叠延伸PCR获得外源基因表达框，使用SwaI酶切pKFAV4S-F2CF1K-CG，去除CMVp-GFP，获得线性化载体片段，经过DNA组装，即可获得携带目的基因的腺病毒载体。这种限制性酶切-组装方法构建腺病毒载体，步骤简单，成功率高^{[20, 21]}。

实施例4、在鸡LMH细胞拯救fiber假型重组病毒FAdV4-F2CF1K-CG

pKFAV4S-F2CF1K-CG质粒转染LMH细胞、病毒拯救和增殖形成荧光灶的情况如图4所示。

使用PmeI酶切pKFAV4S-F2CF1K-CG质粒，将病毒载体基因组与质粒骨架片段分离，回收DNA转染鸡LMH细胞，将拯救获得活性病毒FAdV4-F2CF1K-CG。病毒从细胞内释放，感染周围细胞，外源GFP表达，形成荧光灶，细胞不断脱壁死亡，形成噬斑；噬斑继续增大，最终培养细胞发生完全细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）。实验结果说明成功拯救了重组病毒。

实施例5、fiber假型重组病毒FAdV4-F2CF1K-CG基因组的酶切鉴定

病毒FAdV4-F2CF1K-CG基因组的酶切鉴定图谱如图5所示。

拯救获得的种子病毒FAdV4-F2CF1K-CG在LMH细胞扩大培养，收获的子代病毒使用常规的密度梯度离心法进行纯化。提取纯化病毒的基因组，使用限制性内切酶AgeI，BspHI和ScaI进行酶切，以pKFAV4S-F2CF1K-CG质粒DNA为对照。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见酶切产物条带的分子量与理论计算值完全一致，说明FAdV4-F2CF1K-CG构建成功。

实施例6、fiber假型重组病毒FAdV4-F2CF1K-EG的拯救与鉴定

pKFAV4S-F2CF1K-EG质粒与pKFAV4S-F2CF1K-CG的不同在于更换了外源基因表达框。对应的FAdV4-F2CF1K-EG病毒的拯救、扩增、纯化和鉴定过程与FAdV4-F2CF1K-CG类似。

经PmeI酶切线性化的pKFAV4S-F2CF1K-EG质粒转染LMH细胞，FAdV4-F2CF1K-EG病毒拯救和增殖形成荧光灶的情况如图6所示。提取FAdV4-F2CF1K-EG病毒基因组，使用限制性内切酶AgeI，BstZ17I和ScaI进行酶切，酶切鉴定图谱如图7所示。可见酶切产物条带的分子量与理论计算值完全一致，说明FAdV4-F2CF1K-EG构建成功。这表明可以使用限制性酶切-组装技术方便地更换pKFAV4S-F2CF1K-CG载体的外源基因表达框。

实施例7、fiber假型重组病毒FAdV4-F2CF1K-CG对哺乳动物细胞的基因转导

对数生长期的293或HEp-2细胞接种24孔细胞培养板，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养1天后，去除培养基，添加使用2% FBS DMEM稀释的重组病毒液0.25毫升，混匀，37度细胞培养箱感染4小时；去除病毒液，每孔更换为含2%FBS DMEM 0.5毫升，继续培养44小时。荧光显微镜观察，拍照记录。胰酶消化细胞，使用含1%FBS的10mM磷酸盐缓冲液（PBS）制成细胞悬液，添加4%多聚甲醛溶液至多聚甲醛浓度达1.5%，固定于4摄氏度，一周内使用流式细胞仪测定GFP+细胞比例。

在荧光显微镜下观察，当以1000 vp/cell （viral particles per cell）的感染复数（multiplicity of infection, MOI）感染293细胞时，未改造的对照病毒FAdV4-CG的目的基因转导效率很低，每个视野仅见数个荧光细胞；而FAdV4-F2CF1K-CG重组病毒感染孔，几乎所有细胞均表达GFP蛋白。使用不同的MOI感染强度感染293细胞，或者以HEp-2细胞为靶细胞，FAdV4-CG与FAdV4-F2CF1K-CG之间的基因转导效率差异均非常明显（图8）。流式细胞术定量分析的结果显示在图9，当使用1000 vp/cell的FAdV4-F2CF1K-CG感染293细胞时GFP+细胞比例达到97.6%，而对照病毒FAdV-CG是3.7%，相差26倍。1000 vp/cell的FAdV4-F2CF1K-CG感染HEp-2细胞时GFP+细胞比例达到63.4%，而对照病毒FAdV-CG几乎不感染（0.7%）；当MOI值增加到10000vp/cell时，GFP+细胞比例达到98.1%，对照病毒FAdV-CG是4.9%，相差20倍（图9）。

实施例8、fiber假型重组病毒FAdV4-F2CF1K-CG对禽细胞的基因转导

重组病毒对禽细胞基因转导的操作步骤与哺乳动物细胞相同，在感染后30小时荧光显微镜观察（图10），并收集细胞进行流式细胞术定量检测（图11）。相对对照病毒FAdV-CG，FAdV4-F2CF1K-CG显著提高了对鸡LMH或原代鸡胚成纤维细胞的基因转导效率。在使用20 vp/cell的感染剂量时，FAdV4-F2CF1K-CG转导60.0%的LMH细胞，FAdV4-CG转导效率是2.8%，相差21倍。使用10000 vp/cell的感染剂量感染原代鸡胚成纤维细胞时，FAdV4-F2CF1K-CG能够转导22.1%的细胞，而对照病毒FAdV4-CG基本不能转导（0.7%）。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

参考文献：

[1]Benko M, Aoki K, Arnberg N, Davison AJ, Echavarria M, Hess M,Jones MS, Kajan GL, Kajon AE, Mittal SK, Podgorski, II, San Martin C, WadellG, Watanabe H, Harrach B, Ictv Report C. ICTV Virus Taxonomy Profile:Adenoviridae 2022. J Gen Virol, 2022,103(3). [pubmed:35262477]

[2]Crystal RG. Adenovirus: the first effective in vivo gene deliveryvector. Hum Gene Ther, 2014,25(1):3-11. [pubmed:24444179]

[3]Yamamoto Y, Nagasato M, Yoshida T, Aoki K. Recent advances ingenetic modification of adenovirus vectors for cancer treatment. Cancer Sci,2017,108(5):831-837. [pubmed:28266780]

[4]Fougeroux C, Holst PJ. Future Prospects for the Development ofCost-Effective Adenovirus Vaccines. Int J Mol Sci, 2017,18(4). [pubmed:28420073]

[5]Fausther-Bovendo H, Kobinger GP. Pre-existing immunity against Advectors: humoral, cellular, and innate response, what's important. Hum VaccinImmunother, 2014,10(10):2875-2884. [pubmed:25483662]

[6]Buchbinder SP, Mehrotra DV, Duerr A, Fitzgerald DW, Mogg R, Li D,Gilbert PB, Lama JR, Marmor M, Del Rio C, McElrath MJ, Casimiro DR,Gottesdiener KM, Chodakewitz JA, Corey L, Robertson MN, Step Study ProtocolT. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the StepStudy): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concepttrial. Lancet, 2008,372(9653):1881-1893. [pubmed:19012954]

[7]Mennechet FJD, Paris O, Ouoba AR, Salazar Arenas S, Sirima SB,Takoudjou Dzomo GR, Diarra A, Traore IT, Kania D, Eichholz K, Weaver EA,Tuaillon E, Kremer EJ. A review of 65 years of human adenovirusseroprevalence. Expert Rev Vaccines, 2019,18(6):597-613. [pubmed:31132024]

[8]Yang WX, Zou XH, Jiang SY, Lu NN, Han M, Zhao JH, Guo XJ, Zhao SC,Lu ZZ. Prevalence of serum neutralizing antibodies to adenovirus type 5 (Ad5)and 41 (Ad41) in children is associated with age and sanitary conditions.Vaccine, 2016,34(46):5579-5586. [pubmed:27682509]

[9]Abbink P, Kirilova M, Boyd M, Mercado N, Li Z, Nityanandam R,Nanayakkara O, Peterson R, Larocca RA, Aid M, Tartaglia L, Mutetwa T, BlassE, Jetton D, Maxfield LF, Borducchi EN, Badamchi-Zadeh A, Handley S, Zhao G,Virgin HW, Havenga MJ, Barouch DH. Rapid Cloning of Novel Rhesus AdenoviralVaccine Vectors. J Virol, 2018,92(6):e01924-01917. [pubmed:29298888]

[10]Dakin RS, Parker AL, Delles C, Nicklin SA, Baker AH. Efficienttransduction of primary vascular cells by the rare adenovirus serotype 49vector. Hum Gene Ther, 2015,26(5):312-319. [pubmed:25760682]

[11]Lopez-Gordo E, Podgorski, II, Downes N, Alemany R. Circumventingantivector immunity: potential use of nonhuman adenoviral vectors. Hum GeneTher, 2014,25(4):285-300. [pubmed:24499174]

[12]Michou AI, Lehrmann H, Saltik M, Cotten M. Mutational analysis ofthe avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors.J Virol, 1999,73(2):1399-1410. [pubmed:9882345]

[13]Majhen D. Human adenovirus type 26 basic biology and its usage asvaccine vector. Rev Med Virol, 2022:e2338. [pubmed:35278248]

[14]Liu X, Zou X, Zhang W, Guo X, Wang M, Lv Y, Hung T, Lu Z. NoGenus-Specific Gene Is Essential for the Replication of Fowl Adenovirus 4 inChicken LMH Cells. Microbiol Spectr, 2022,10(3):e0047022. [pubmed:35638786]

[15]Zou XH, Bi ZX, Guo XJ, Zhang Z, Zhao Y, Wang M, Zhu YL, Jie HY,Yu Y, Hung T, Lu ZZ. DNA assembly technique simplifies the construction ofinfectious clone of fowl adenovirus. J Virol Methods, 2018,257:85-92.[pubmed:29703616]

[16]Yan B, Zou X, Liu X, Zhao J, Zhang W, Guo X, Wang M, Lv Y, Lu Z.User-Friendly Reverse Genetics System for Modification of the Right End ofFowl Adenovirus 4 Genome. Viruses, 2020,12(3):301. [pubmed:32168853]

[17]Zhang W, Guo X, Yin F, Zou X, Hou W, Lu Z. Fiber modificationsenable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. J Gene Med, 2021,23(10):e3368. [pubmed:34050587]

[18]Zou X, Rong Y, Guo X, Hou W, Yan B, Hung T, Lu Z. Fiber1, but notfiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). J GenVirol, 2021,102(3). [pubmed:33625352]

[19]Goldman A. Isolation of fibroblasts from chicken embryos. CSHProtoc, 2006,2006(2). [pubmed:22485826]

[20]Liu H, Lu Z, Zhang X, Guo X, Mei L, Zou X, Zhong Y, Wang M, HungT. Single Plasmid-Based, Upgradable, and Backward-Compatible AdenoviralVector Systems. Hum Gene Ther, 2019,30(6):777-791. [pubmed:30793964]

[21]Guo X, Sun Y, Chen J, Zou X, Hou W, Tan W, Hung T, Lu Z.Restriction-Assembly: A Solution to Construct Novel Adenovirus Vector.Viruses, 2022,14(3):546. [pubmed:35336953]

Claims (6)

1.一种fiber假型禽4型腺病毒载体，其特征在于，载体包括禽4型腺病毒的基因组序列、pBR322的复制起点核酸序列和卡那霉素抗性核酸序列；所述基因组的核酸序列经过人工改造，包括：对fiber2基因knob区进行型别替换，在外源基因表达框部位添加限制性酶切位点。

2.根据权利要求1所述的一种fiber假型禽4型腺病毒载体，其特征在于，所述fiber2基因的knob区被替换为CELO病毒fiber1的knob编码序列。

3.根据权利要求1所述的一种fiber假型禽4型腺病毒载体，其特征在于，在所述外源基因表达框启动子上游和目的基因编码区下游分别添加有一个限制性内切酶SwaI酶切位点。

4.如权利要求1-3任意一项所述的fiber假型禽4型腺病毒载体在制备基因治疗试剂盒或疫苗中的应用。

5.一种基因治疗试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任意一项所述的fiber假型禽4型腺病毒载体。

6.一种重组疫苗，其特征在于，所述重组疫苗采用如权利要求1-3任意一项所述的fiber假型禽4型腺病毒载体，载体中携带与预防哺乳动物或禽类疾病相关的外源基因。

Images