CN104232639A - 一种与植物木质化相关的microRNA857及其相关生物材料与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与植物木质化相关的microRNA857及其相关生物材料与应用。该应用为如下任一所述生物材料在降低植物木质化程度中的应用：(1)miR857；(2)miR857的编码基因；(3)表达miR857的重组载体。本发明通过实验证明，过量表达miR857导致茎干平均直径减小和机械强度减弱，木质素含量降低。本发明为木本植物以及有关农作物木质化程度的改变等提供了更多的有效途径。本发明为根据实际生产需要来培育木质素含量低的植物品种，提供了一种全新的并且简单有效的方法。

Description

一种与植物木质化相关的microRNA857及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与植物木质化相关的microRNA857及其相关生物材料与应用。

背景技术

植物的木质化与人类生活息息相关，木质化形成的木材是制浆造纸、建筑业以及纺织业的原材料，在人类的生产和生活中起着重要的作用。木质化是木质素在特化细胞的细胞壁中沉积的过程，如木质部导管分子和厚壁组织细胞壁的加厚等，在维持植物正常结构、输导水分和养料、防御机体不受病原菌侵害方面发挥着重要的作用。其中，木质素是植物体内比重仅次于纤维素的高分子化合物，与某些农艺形状和实际生产密切相关。譬如，木质素的含量和组分与作物的抗倒伏相关；作为黏合剂和各种添加剂已广泛应用于化学工业中；木质素具有高热能，分子中的碳氢含量高达70-80％，其内蕴含丰富的能量，将来可能作为燃料替代品等。然而，木质素的存在也会产生一些负面效应，例如它是造纸工业废水污染产生的主要源头物质，饲料植物中木质素含量及单体分布比例直接影响到牲畜的消化和吸收等。因此，利用分子生物学手段根据实际需要调控木质素的含量，进而改变植物的木质化程度，具有潜在的应用前景。

MicroRNA(miRNA)是一类内源的长约20～24核苷酸的非编码RNA，它是一类新型的调控基因表达的小分子RNA。miRNA通过与靶基因mRNA分子互补配对来识别并指导靶基因的切割或抑制靶基因的翻译等方式，特异地对靶基因进行转录后调控，从而调节真核生物的生长发育。近年来，研究人员发现miRNAs几乎参与了植物生长发育的所有重要过程，包括调控植物器官的发生发育(Yoon et al.,2010；Vidal et al.,2010；Wang et al.,2011)、参与激素应答途径(Gutierrez et al.,2009；Yoon et al.,2010；Navarro et al.,Schommer et al.,2008)、参与逆境响应途径(Navarro et al.,2006；Zhao etal.,2007)、参与对营养元素吸收的调控(Zhao et al.,2011；Kawashima et al.,2009；Bari etal.,2006)及其对自身合成代谢的反馈调节(Rajagopalan et al.2006)等。此外，大量miRNA的靶基因是编码转录因子的蛋白(Jones-Rhoades et al.,2006)。

以上实例均表明miRNA在基因表达调控中的发挥了重要的作用。如果能够利用miRNA这种新型的调控分子来研究植物木质化过程及其生物学特性，对于改良植物中木材性状以及改变木材生长量具有十分重要的意义。然而，到目前为止，关于miRNA参与对植物木质化调控的研究未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与植物木质化程度相关的microRNA857及其相关生物材料在降低植物木质化程度中的应用。

本发明所提供的应用为如下任一所述生物材料在降低植物木质化程度中的应用或在抑制植物中LAC7基因转录中的应用：

(1)miR857；

(2)miR857的编码基因；

(3)表达miR857的重组载体。

上述应用中，所述miR857的序列如SEQ ID No.2所示；

上述应用中，所述miR857的编码基因的序列如SEQ ID No.1所示；

上述应用中，所述表达miR857的重组载体是将SEQ ID No.1所示DNA插入植物表达载体的多克隆位点得到的。

上述应用中，所述降低植物木质化程度为降低植物茎干的木质化程度。

上述应用中，所述降低植物木质化程度体现在如下方面中的至少一种：

(1)降低木质素含量；

(2)降低植物茎干的机械强度；

(3)降低植物茎干的直径；

(4)降低植物茎干的鲜重；

(5)降低厚壁细胞占植物茎干横切面的比例；

(6)降低植物单个维管束中木质细胞的数目；

(7)使植物木质部细胞排列更加松散。

上述应用中，所述植物为草本植物或木本植物；所述草本植物具体为拟南芥。

本发明的另一个目的是提供一种构建转基因植物的方法。

本发明所提供的构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使受体植物中过表达miR857，得到木质化程度低于所述受体植物的转基因植物。

上述方法中，所述使受体植物中过表达miR857的方法为：向受体植物中导入miR857的编码基因。

上述方法中，所述木质化程度为植物茎干的木质化程度。

上述方法中，所述木质化程度体现在如下方面中的至少一种：

(1)木质素含量；

(2)植物茎干的机械强度；

(3)植物茎干的直径；

(4)植物茎干的鲜重；

(5)厚壁细胞占植物茎干横切面的比例；

(6)植物单个维管束中木质细胞的数目；

(7)植物木质部细胞排列状况。

上述方法中，所述植物为草本植物或木本植物；所述草本植物具体为拟南芥。

本发明通过实验证明，过量表达miR857导致茎干平均直径减小和机械强度减弱，木质素含量降低。本发明为木本植物以及有关农作物木质化程度的改变等提供了更多的有效途径。本发明为根据实际生产需要来培育木质素含量低的植物品种，提供了一种全新的并且简单有效的方法。

附图说明

图1为AtMIR857基因PCR扩增产物的电泳鉴定。

图2为重组质粒pBI121-35S-miR857载体示意图。

图3为35S:MIR857过表达植株中靶基因AtLAC7的转录水平的表达。

图4为35S:MIR857过表达植株木质素含量测定。

图5为35S:MIR857过表达植株木质化特性分析图。

图6为35S:MIR857过表达植株茎部解剖结构图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：植物表达载体pBI121-35S-miR857的构建。

1、DNA的提取。采用CTAB法提取野生型拟南芥的基因组DNA。

2、引物的设计。在上下游引物的5’端分别引入BamH I和EcoR I的酶切位点(下划线)以及保护碱基。引物序列如下：

miR857-F:5’-GCGGATCCTTCGACTCCTACAACAAACTTTC-3’；

miR857-R:5’-GCGAATTCTCCGATTCCTACAATACACCTTC-3’。

3、目的基因的扩增。以野生型拟南芥基因组DNA为模版，采用miR857-F和miR857-R进行PCR扩增，得到长度为377bp的目的基因片段。

PCR反应结束后，取2μL反应液进行2％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，扩增出的约377bp的AtMIR857基因特异条带如图1所示。PCR产物回收连入T载体后测序，结果正确。

4、载体的构建。用限制性内切酶BamH I和EcoR I对表达载体pBI121和上述PCR纯化产物分别进行双酶切，连接，得到重组表达载体pBI121-35S-miR857，

图2为重组质粒pBI121-35S-miR857的构建示意图。测序表明，连入pBI121的基因序列如SEQ ID No.1所示。该载体在植物体内表达的产物为miR857，miR857序列如SEQID No.2所示。

实施例2：转基因植株的获得及Real-time PCR分析

一、农杆菌介导的浸花法转化拟南芥。

将构建好的重组质粒转化到农杆菌GV3101中，采用活体植株农杆菌浸花法进行转化，通过农杆菌浸染野生型拟南芥植株，将目的片段插入到拟南芥基因组DNA中。具体步骤如下：

1、挑取农杆菌单菌落接种到5-10mL含抗生素(Rif+Gen+Kan)的LB液体培养基中，在28℃、250rpm条件下，振荡培养至对数生长晚期。

2、以1:50比例转接至新鲜的抗生素(Rif+Gen+Kan)LB液体培养基中，同样条件下培养至OD600为1-2左右。6000rpm离心收集菌体，用5％蔗糖洗两遍，然后用适量浸花液(5％蔗糖，0.02％silwet L-77)重悬到OD600为0.8。

3、选取四周左右刚开花的拟南芥植株，剪去果荚，然后将整个花序浸泡在上述浸花液中15s，同时不停搅动。

4、农杆菌浸染后的拟南芥放于阴暗环境下保湿培养24h，然后将拟南芥移到培养室中正常培养，7d后再浸泡转化一次。

二、转基因植株筛选

1、将收获成熟的种子放到10mL的离心管中，加入5mL消毒液[0.5％(v/v)NaClO+0.01％(v/v)Triton X-100]表面消毒10-15min，期间不停颠倒混匀。

2、倒掉消毒液，加入5mL灭菌水，洗3-4次。

3、将消毒好的种子铺到含有卡那霉素(50μg/mL)的1/2MS固体平板上。

4、将平板在4℃低温处理3d，然后转移到培养箱中培养。培养条件为：22℃，16h光照/8h黑暗。

5、挑取抗性植株移入土中继续培养。

6、采用CTAB法从转基因植株的叶片中提取DNA。

7、以转基因植株叶片的基因组DNA为模板，以野生型拟南芥基因组DNA为阴性对照，以pBI121-35S-miR857重组质粒为阳性对照，以质粒上35S启动子的5’端为上游引物，以AtMIR857基因的3’端为下游引物分别进行PCR扩增，进行阳性转基因植株的鉴定。引物如下：

F：5’-AGGCCATGGAGTCAAGATTCAAATAGAGG-3’；

R：5’-GCGAATTCTCCGATTCCTACAATACACCTTC-3’。

此后，将T1代种子进行筛选，获得纯合体植株。

三、靶基因AtLAC7转录水平表达量的检测。

提取纯合体植株的RNA，进行反转录获得cDNA。以所获得的cDNA为模板，采用LAC7qPCR-F和LAC7qPCR-R引物，通过Real-time PCR检测miR857靶基因AtLAC7转录水平表达量的变化。引物序列如下：

LAC7qPCR-F:5’-GCAATCCCGTAACACTTTGGCTGTCCC-3’；

LAC7qPCR-R:5’-GCTATTATTGTTGTTTATGCATGAAAC-3’。

分析方法采用比较CT法，以Tubulin作为内参基因，未经处理的野生型样品作为对照。通过2-△△CT法计算AtLAC7基因表达量变化差异。各基因表达量用均值±标准差表示。结果显示，转基因植株中，靶基因AtLAC7转录水平表达量与野生型相比下降了40％(图3)。靶基因AtLAC7的genbank号为AT3G09220。基因AtLAC7是编码genbank号为NP_187533.1的蛋白序列。

实施例3：转基因植株木质素含量的测定。

利用傅里叶红外光谱测定转基因植株和野生型中木质素的含量，取生长6周的拟南芥茎部组织，先用PBS洗涤3次，再用双蒸水洗涤3次。置于BaF2晶片上，室温干燥。采用MAGNA750FTIR光谱仪进行红外光谱分析，并配备同一公司的显微镜，MCT检测器，光谱分辨率8cm^-1，扫描次数为128次，代表木质素的吸收峰大约在1356cm^-1处。通过统计1356cm^-1处的吸收光谱表明，转基因植株的木质素含量低于野生型，(图4A为野生型植株的光谱图，图4B是转基因植株的光谱图，而图4C是转基因植株的光谱图与野生型光谱图之间的差谱图，峰值在横坐标以下可以反映转基因植株的木质素含量低于野生型)。

实施例4：转基因植株木质化特性的测定。

用电子万能材料试验机来测定生长6周左右的拟南芥茎部的机械强度。用拉伸气动夹具来测定其茎部的力学性能，测力计的基本参数为500N和5N。用扫描仪和统计分析软件得到茎部的平均直径和高度。通过万分之一天平称重得到茎部的平均鲜重。

结果表明：与野生型相比，植株的高度变化不大，但转基因植株茎干的机械强度显著降低，茎干的平均直径和鲜重也有所减小(图5)。

实施例5：转基因植株解剖结构的观察。

鉴于转基因植株的木质化的相关参数有所变化，我们通过进行半薄切片对其解剖结构进行了观察，步骤如下：

1、配制2.5％戊二醛固定液(pH7.0磷酸缓冲液)，分别选取生长6周的野生型和过表达拟南芥相同部位的茎段和根段，投入固定液中，用真空泵抽气，4℃放置过夜。

2、在缓冲液中清洗3次，每次10min，依次经：30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％系列乙醇脱水，每级20min。

3、材料依次经：无水乙醇:L.R.White树脂比例为2:1、无水乙醇:L.R.White树脂比例为1:1和无水乙醇:L.R.White树脂比例为1:2，每级3h。最后在纯L.R.White树脂中渗透1d，期间更换1次。

4、60℃烘箱包埋24h。

5、取L.R.White包埋后的组织块于超薄切片机上，切取厚度为1μm的半薄切片，将其移到加水滴的载玻片上，然后于烘片机上加热烘干。

6、将1％硼砂甲苯胺蓝染液滴在切片上，约0.5min左右，用洗瓶冲洗切片上多余的染液，滤纸吸干水分，自然干燥，即可镜检。

结果显示，与野生型相比，转基因植株的厚壁组织细胞面积明显减少(图6A)，在野生型中厚壁组织所占茎部横切面总面积的21.3％，而转基因植株中厚壁组织仅占茎部横切面总面积的13.9％(图6B)。进一步的观察发现，与野生型相比，转基因植株的木质部细胞排列更为松散(图6A)，次生木质部细胞数目较少(图6C)。

Claims (10)

1.如下任一所述生物材料在降低植物木质化程度中的应用：

(1)miR857；

(2)miR857的编码基因；

(3)表达miR857的重组载体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述miR857的序列如SEQ ID No.2所示；

所述miR857的编码基因的序列如SEQ ID No.1所示；

所述表达miR857的重组载体是将SEQ ID No.1所示DNA插入植物表达载体的多克隆位点得到的。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述降低植物木质化程度为降低植物茎干的木质化程度。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述降低植物木质化程度体现在如下方面中的至少一种：

(1)降低木质素含量；

(2)降低植物茎干的机械强度；

(3)降低植物茎干的直径；

(4)降低植物茎干的鲜重；

(5)降低厚壁细胞占植物茎干横切面的比例；

(6)降低植物单个维管束中木质细胞的数目；

(7)使植物木质部细胞排列更加松散。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述植物为草本植物或木本植物；所述草本植物具体为拟南芥。

6.一种构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使受体植物中过表达miR857，得到木质化程度低于所述受体植物的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述使受体植物中过表达miR857的方法为：向受体植物中导入miR857的编码基因。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述木质化程度为植物茎干的木质化程度。

9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述木质化程度体现在如下方面中的至少一种：

(1)木质素含量；

(2)植物茎干的机械强度；

(3)植物茎干的直径；

(4)植物茎干的鲜重；

(5)厚壁细胞占植物茎干横切面的比例；

(6)植物单个维管束中木质细胞的数目；

(7)植物木质部细胞排列状况。

10.根据权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为草本植物或木本植物；所述草本植物具体为拟南芥。