CN104230901A - 用于调节ire1、src和abl活性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于调节Ire1、Src或Abl的组合物，用于鉴定测试化合物的调节活性的方法，以及用于治疗Ire1、Src或Abl活性或失活引起的疾病的方法，等等。

Description

用于调节IRE1、SRC和ABL活性的方法和组合物
本申请是申请日为2009年9月15日、申请号为“200980145225.3”、发明名称为“用于调节IRE1、SRC和ABL活性的方法和组合物”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2009/056993的中国国家阶段申请。
相关申请的交叉引用
本申请是2009年9月15日提交的PCT/US2009/056993的国家阶段，要求2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,173的权利，其通过参考全部并入本文。
对联邦政府资助的研发所作出的发明的权利声明
本发明得到来自国立卫生研究院的资助(GM60641)以及美国陆军医学研究与装备司令部资助合同No.W81XWH-06-1-0383的支持。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及用于调节IRE1、SRC和ABL活性的方法和组合物。
背景技术
真核生物中所有蛋白质的大约三分之一进入内质网(ER)进行翻译后加工和折叠。蛋白质折叠的质量受定位于内质网膜的由错误折叠的蛋白质所活化的激酶-RNA酶Ire1的监测。Ire1起始转录因子编码mRNA的非剪接体的细胞质剪接反应，其起始基因组规模的转录程序，称为未折叠蛋白应答(unfolded protein response，UPR)。剪接的mRNA的翻译产生UPR特异性转录因子，其在酵母中称为Hac1(Cox，J.S.等，Cell87：391-404(1996))而在后生动物中称为Xbp1(Yoshida，H.等，Cell107：881-91(2001))，其活化参与内质网中蛋白质生物合成和恢复蛋白质折叠的基因。UPR在癌症(Koong，A.C.等，Cancer Biol Ther5(2006)；Ma，Y.等，Nat Rev Cancer4：966-77(2004))中、在阿尔茨海默氏病中(Kudo，T.等，Ann N YAcad Sci977：349-55(2002))以及多种其他细胞异常(cellular anomalies)(Zheng，Y.等，J Microbiol43：529-36(2005)；Naidoo，N.等，J Neurochem92：1150-7(2005)；Doody，G.M.等，Eur J Immunol36：1572-82(2006))中活化，这表明异常的Ire1活化与细胞功能障碍间存在多种可能的关联。
UPR期间，ER-腔内域(lumenal domain，LD)作为未折叠蛋白质的感受器，并促进Ire1在ER膜平面中的侧面自缔合(self-association)(图1A)。值得注意的是，纯化的LD以寡聚物的形式结晶，所述寡聚物具有两个不同的晶体学界面。两个界面上的Ire1表面残基和Ire1的体内活化有关(Credle，J.J.等，Proc Natl Acad Sci USA102：18773-84(2005))。这一发现解释了之前观察到的UPR期间Ire1寡聚化(Shamu，C.E.等，Embo J15：3028-39(1996))，并为通过活细胞成像可观察到的UPR诱导病灶(foci)中Ire1组织化提供了首个结构上的合理解释(Kimata，Y.等，J Cell Biol179：75-86(2007))(Aragon等，2008)。已有人提出LD的寡聚化会增加Ire1的激酶-RNA酶结构域在ER膜胞浆侧的局部浓度，并通过二聚化活化酶结构域(Credle，J.J.等，Proc NatlAcad Sci USA 102：18773-84(2005))。这种活化机制和很多熟知的细胞表面信号受体相似。例如，表皮生长因子受体(EGFR)配体诱导的二聚化(Zhang，X.等，Cell125：1137-49(2006))，通过诱导构象改变来活化激酶结构域，所述构象改变包括激酶N-和C-叶的打开以及活化环和高度保守的αC螺旋的重排(Zhang，X.等，Cell125：1137-49(2006))。除了自结合，Ire1的活化还涉及自磷酸化以及结合ADP作为辅因子。认为所有这些事件有助于活化核糖核酸酶的构象改变(Papa，F.R.等，Science302：1533-7(2003)；Gonzalez，T.N.等，Methods Mol Biol160：25-36(2001))。
已经报道了Ire1激酶-RNA酶结构域的晶体结构(Lee，K.P.等，Cell132：89-100(2008))。此结构揭示了两重的对称二聚体，其具有背靠背排列的与拥有两个独立活性位点的RNA酶二聚体紧密相连的激酶结构域。除了活化环、激酶结构域αD螺旋后的环、以及RNA酶结构域中功能上重要且明显高度动态的环之外，这种结构是非常有序的。二聚体中激酶的背靠背排列是出人意料的，因为其使得活化环中磷酸化位点位于距离二聚体中配对分子的活性位点的位置。这种排列不表现出产生在体内(Shamu，C.E.等，Embo J15：3028-39(1996))和体外(Lee，K.P.等，Cell132：89-100(2008))观察到的Ire1反式-自磷酸化。已有人提出RNA酶结构域的二聚化允许识别HAC1/XBP1mRNA中含有剪接位点的保守串联茎环结构(Lee，K.P.等，Cell132：89-100(2008))(图1B)。
内质网应激(ER stress)和多种人类疾病(如癌症、糖尿病、蛋白病(proteinopathies)和病毒感染)的关系，为通过操作UPR来改变发病提供了理论支持。例如，在囊性纤维化中，提高蛋白折叠能力来产生更多呈现在细胞表面的氯通道是有益的。另一方面，在糖尿病中，胰岛细胞由于UPR诱导凋亡而死亡，UPR的Ire1分支(branch)已显示是细胞保护性的。在神经退行性疾病和其他蛋白质折叠疾病中，如导致失明的视网膜色素变性，细胞由于UPR诱导凋亡而死亡。相同的概念适用于很多其他和UPR有关的疾病。
本发明提供了下述出乎意料的方法，即在药理上调节(如不同程度上的提高或降低)细胞折叠蛋白质的能力以及防止UPR诱导的细胞死亡的方法。本文描述了第一种能够调节野生型Ire1的小分子及其作用模式。此外，提供了用于筛选Ire1调节剂的靶标和作用模式的强大且高效的测定，还提供了其筛选方法。
发明内容
本文公开了具有下式的Ire1活化剂：
式I中，R5、R6、R7和R8独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR15R16、-OR17、-COOR18、-SR19、-COR20、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基，其中R6和R7任选地共同形成取代或未取代的杂环烃基或者取代或未取代的杂芳基。R15、R16、R17、R18、R19和R20独立地是R30-取代或未取代的烃基、R30-取代或未取代的杂烃基、R30-取代或未取代的环烃基、R30-取代或未取代的杂环烃基、R30-取代或未取代的芳基、或者R30-取代或未取代的杂芳基。R30独立地是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R31-取代或未取代的烃基、R31-取代或未取代的杂烃基、R31-取代或未取代的环烃基、R31-取代或未取代的杂环烃基、R31-取代或未取代的芳基、或者R31-取代或未取代的杂芳基。R31独立地是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
另一方面，本发明提供了在细胞中调节Ire1活性的方法。所述方法包括使细胞与有效量的本文所述Ire1调节剂或有效量的舒尼替尼(sunitinib)相接触。
另一方面，本发明提供了在有此治疗需要的对象中治疗由异常Ire1活性引起的疾病的方法。所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述Ire1调节剂或治疗有效量的舒尼替尼。
另一方面，本发明提供了测试化合物的Ire1活化活性的方法。所述方法包括使测试化合物与溶液中多个非寡聚化Ire1蛋白相接触。然后检测所述多个Ire1蛋白的寡聚化，从而鉴定测试化合物中Ire1调节活性。
另一方面，本发明提供了检测测试化合物的Ire1失活活性的方法。所述方法包括使测试化合物与溶液中多个寡聚化Ire1蛋白相接触。然后，对所述多个寡聚化Ire1蛋白分离形成多个非寡聚化Ire1蛋白进行检测，从而鉴定测试化合物中Ire1失活活性。
另一方面，本发明提供了调节Src酪氨酸激酶活性的方法。所述方法包括使Src酪氨酸激酶(例如在细胞中的)与有效量的本文所述调节剂相接触。
又一方面，本发明提供了调节Abl酪氨酸激酶活性的方法。所述方法包括使Abl酪氨酸激酶(例如在细胞中的)与有效量的本文所述调节剂相接触。
另一方面，本发明提供了基本上如本文所述的方法和化合物。
附图说明
图1。通过自缔合实现的Ire1活化。A.内质网(endoplasmicreticulum，ER)中未折叠蛋白质与腔内域(LD)结合并活化Ire1的激酶(kinase，K)和核糖核酸酶(ribonuclease，R)结构域。B.所用Ire1底物的图示。图注：HP21(SEQ ID NO：5)。C.用于切割测定和结构测定的Ire1构建物。D.有(+ADP)或没有(-ADP)辅因子的情况下，采用5′-32p-HP21获得的Ire1KR、Ire1KR24和Ire1KR32的协同活化谱。
图2。接头控制Ire1的寡聚化和活化。A.在所有测试浓度下Ire1KR都是可溶的，而Ire1KR32在浓度高于10μM时形成浑浊溶液。B.在聚集条件(a)下对Ire1KR32进行分析型超速离心显示出单体、二聚体和更高的组装体(assemblies)。C.盐协同性抑制Ire1KR32的RNA酶活性。D.与Ire1KR和Ire1KR24相比，在切割HP21和XBP1的过程中，Ire1KR32表现出更高的RNA酶活性。
图3。激酶抑制剂活化野生型Ire1的RNA酶。A.丝氨酸和酪氨酸激酶的抑制剂活化Ire1KR32的RNA酶。B.与Ire1KR32激酶ATP穴结合的APY29的分辨率良好的电子密度。C.APY29和Ire1KR32激酶ATP穴之间的相互作用网络。D.APY24、舒尼替尼和AIN54的结构，其具有以虚线表示的所提出与Ire1结合形成的氢键。E.在Ire1二聚体结构中ADP-Mg和Ire1激酶ATP穴之间的相互作用网络。F.在ADP存在时，与来自反应缓冲液的镁的螯合抑制Ire1KR32的RNA酶活性，APY29则不然。
图4。通过Ire1胞浆结构域形成的寡聚物的结构。A.Ire1KR32组装成长管状寡聚物。B.在寡聚物中单体以反向平行双链排列方式堆积。C.Ire1KR32·APY29的IF1和Ire1-ADP共结晶结构中的相似。D.IF2具有两重非晶体学对称性，并包含对角定位的Ire1单体，其形成新的RNA酶-RNA酶界面(IF2)和更小的激酶-RNA酶界面(IF2)。E.在寡聚物相同“链”的单体之间形成IF3，其仅涉及激酶-激酶相互作用，并且使得活化环处于适合反式自磷酸化的位置。
图5。Ire1的三个界面对RNA酶活性有贡献。A.寡聚物中Ire1三个界面以及新结构元件的位置。B.三个界面中每一个中各侧链间的接触。C.在设计用来减弱或破坏IF1、IF2和IF3处接触的突变之后，Ire1RNA酶活性显著降低。
图6。Ire1活化的模式。A.Ire1KR32切割具有单茎环的截短的XBP1(XBP1/PstI)，其速率与具有两个茎环的XBP1相同。B.(a)中凝胶的定量，以及数据的单指数最小二乘法拟合。C.比较具有一个和两个茎环的底物的切割速率。D.HLE的a3′-a4环的两种构象。E.UPR期间Ire1活化的一般模式。
图7。所用蛋白质构建物的序列。Ire1构建物的概览。图注：Pro-Ire1KR32(SEQ ID NO：1)、Ire1KR24(SEQ ID NO：1，残基10-476)、Ire1KR(SEQ ID NO：1，残基34-476)。
图8。所研究的RNA底物，其内含子序列以下划线表示。图注：XBP1(443nt)(SEQ ID NO：2)、XBP1/Pst(354nt)(SEQ ID NO：3)、HAC1(514nt)(SEQ ID NO：4)、HP21(SEQ ID NO：5)、HAC128-mer(SEQ ID NO：6)、XBP158-mer(SEQ ID NO：7)
图9。Ire1KR32的电子密度实例。A.由于高度的非晶体学对称性(non-crystallographic symmetry，NCS)，在分辨率下显示的Ire1KR32的侧链。B.显示A链的αD-螺旋的电子密度图。C.A链的活化环的电子密度。D.开放构象中的a3′螺旋和a3′-a4环的电子密度(B链)。E.闭合构象中的a3′螺旋和a3′-a4环的电子密度(A链)。
图10。Ire1寡聚物的双螺旋结构。
图11。Ire1KR32的质谱图，以确定其磷酸化状态。
图12。Ire1的RNA酶结构域的寡聚化结构。
图13。磷酸化在活化Ire1中的作用。A.Ire1KR32的非磷酸化变体(D828A)通过协同寡聚化而活化。B.非磷酸化的Ire1KR32具有降低的辅因子敏感性。C.活化环在寡聚物中的位置相当于CDK2-型激酶的典型开放(磷酸化的)状态。
图14。体内Ire1病灶的模型构造。A.在Ire1的腔内域(PDB ID2be1)和胞质域(目前的结构)的晶体结构中，单体沿纤维轴的堆积密度的比较。B.显示了寡聚化腔内域的纤维(上部)，建模的膜以及寡聚化胞质域的多个拷贝(沿图4A中的方向，侧视图)。
图15。数据采集和精细统计。
图16。在Ire1KR32的MALDI谱中不存在胰蛋白酶肽。图注：N端野生型和激酶死亡(SEQ ID NO：1，残基1-20)、N叶野生型和第二N叶激酶死亡肽(SEQ ID NO：1，残基154-157)、活化环野生型(SEQID NO：1，残基196-213)、aEF-aF野生型(SEQ ID NO：1，残基214-240)、第六C叶野生型和激酶死亡肽(SEQ ID NO：1，残基472-476)。
图17。HEK293细胞中APY29和APY24对Ire1的活化。
图18。示例性化合物对UPR的抑制。
图19。示例性化合物对UPR的活化。
图20。用示例性化合物进行的基于RNA切割的yIre1活化分析。
图21A和B。A.在具有预活化的Ire1的条件下，使用纯化的Ire1进行的基于RNA切割的yIre1抑制测定。此处，多种化合物抑制Ire1，最显著的是APY81。因此，有些APY化合物既可作为Ire1RNA酶抑制剂，也可作为Ire1RNA酶活化剂，这取决于实验设置。
图22。用hIre1滴定APY29和AD75。
具体实施方式
I.缩写和定义
本文所用缩写具有化学和生物学领域中常规的含义。
当通过其常规化学式表示取代基时，从左至右书写，其同样包括其从右至左书写结构所得到的化学上等同的替代，如-CH2O-等同于-OCH2-。
术语“烃基”自身或作为另一取代基的一部分时，除非另有指明，表示直链(即未分支的)或分支的碳链，或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的，可以包含二价和多价基，具有指定数目的碳原子(即C1-C10表示1个至10个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物或异构体。不饱和烃基是指具有一个或多个双键或三键的烃基。不饱和烃基的实例包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。
术语“亚烃基”自身或作为其他取代基的一部分时表示衍生自烃基的二价基，例如但不限于，-CH2CH2CH2CH2-。典型情况下，烃基(或亚烃基)基团具有1至24个碳原子，本发明中优选具有10个或更少碳原子的基团。“低级烃基”或“低级亚烃基”是指较短链的烃基或亚烃基基团，通常具有8个或更少的碳原子。
术语“杂烃基”自身或和另一术语相组合时，除非另有指明，表示由至少一个碳原子和至少一个选自O、N、P、Si、S的杂原子组成的，稳定的直链或支链或者环状烃基，或其组合，其中氮和硫原子任选地可以是氧化的，氮杂原子任选地可以是季铵化的。杂原子O、N、P和S和Si可位于杂烃基基团的任何内部位置，或者位于烃基与分子其他部分相连的位置。实例包括但不限于，-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、O-CH3、-O-CH2-CH3和-CN。最多两个杂原子可以是连续的，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。相似的，术语“杂亚烃基”自身或作为另一取代基的一部分时表示衍生自杂烃基的二价基，例如但不限于，-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烃基基团，杂原子还可以占据链末端之一或之二(如亚烷氧基、亚烷二氧基(alkylenedioxy)、亚烷酰胺基(alkyleneamino)、亚烷二酰胺基(alkylenediamino)等)。此外，对于亚烃基和杂亚烃基连接基团，连接基团式的书写方向并不暗示着连接基团的方向。例如，式-C(O)2R′-代表-C(O)2R′-和-R′C(O)2-。如上所述，本文使用的杂烃基基团，包括通过杂原子与分子其他部分相连的基团，如-C(O)R′、-C(O)NR′、-NR′R″、-OR′、-SR′和/或-SO2R′。当在特定杂烃基(如-NR′R″等)后使用“杂烃基”时，应当了解术语杂烃基和-NR′R″并不多余或互相排斥。而是，记载具体的杂烃基基团从而使得更加清楚。因此，本文中术语“杂烃基”不应解释为排除具体的杂烃基基团，如-NR′R″等。
术语“环烃基”和“杂环烃基”自身或和其他术语组合时，除非另有指明，分别代表“烃基”和“杂烃基”的环形形式。此外，对于杂环烃基来说，杂原子可以占据杂环与分子中其他部分相连的位置。环烃基的实例包括但不限于，环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烃基的实例包括但不限于，1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。“亚环烃基”和“杂亚环烃基”分别表示衍生自环烃基和杂环烃基的二价基。
术语“卤代”或“卤素”自身或作为另一取代基的一部分时，除非另有指明，表示氟、氯、溴或碘原子。此外，术语如“卤代烃基”意为包括单卤代烃基和多卤代烃基。例如，术语“卤代(C1-C4)烃基”意在包括但不限于，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
术语“芳基”，除非另有指明，表示多不饱和芳香烃取代基，其可以是单环或者稠合或共价连接的多环(优选1至3个环)。术语“杂芳基”表示含有1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地是氧化的，氮原子任选地是季铵化的。杂芳基可通过碳或杂原子与分子的其他部分相连。芳基和杂芳基基团的非限定性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系中每一个的取代基选自如下所述的可接受取代基。“亚芳基”和“杂亚芳基”是指分别衍生自芳基和杂芳基的二价基。“稠环”是指具有共用至少一个键和两个原子的两个或更多环的环系统。因此，“稠环芳基”和“稠环杂芳基”分别指具有至少一个下述芳基和杂芳基的环系统，即所述芳基和杂芳基与另一个环共有至少一个键以及两个原子。
简便起见，当术语“芳基”和其他术语组合使用时(如芳氧基、芳硫氧基(arylthioxy)、芳基烃基)包括上述定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烃基”意在包括下述基团，其中芳基与烃基相连(如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基)，所述烃基包括其中碳原子(如亚甲基基团)已被例如氧原子所取代的那些烃基(如苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
本文中使用的术语“氧代”表示氧以双键和碳原子结合。
本文中使用的术语“烃基磺酰基”表示具有式-S(O2)-R′的部分，其中R′是如上定义的烃基。R′可具有特定数目的碳(如“C1-C4烃基磺酰基”)。
上述每个术语(如“烃基”、“杂烃基”、“芳基”和“杂芳基”)意在包括取代和未取代形式的所述基团。每种类型基团的优选取代基如上所提供。
烃基和杂烃基(包括通常称为亚烃基、烯基、杂亚烃基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自下列但不限于此的多个基团中的一个或多个：-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R"R"′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，数目从0到(2m′+1)，其中m′是此基团中碳原子的总数。R′、R″、R″′和R″″各自独立地优选表示氢、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基(例如1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烃基、烷氧基或硫烷氧基(thioalkoxy)或者芳基烃基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，如同R′、R″、R″′和R″″基团中多于一个基团存在时这些基团的每一个那样，独立地选择每个R基团。当R′和R″与同一氮原子相连时，它们可与氮原子组合形成4-、5-、6-或7-元环。例如，-NR′R″意在包括但不限于，1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上述取代基的讨论，本领域技术人员将了解术语“烃基”意在包括下述基团，所述基团包含与除氢基以外的基团相连的碳原子，例如卤代烃基(如-CF3和-CH2CF3)和酰基(如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
和针对烃基基团所述的取代基相似，芳基和杂芳基的取代基多种多样，选自例如：卤素、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R"、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3，-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烃基，数目为0至芳香环体系上开放价的总数；其中R′、R″、R″′和R″″优选独立地选自氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，如同R′、R″、R″′和R″″基团中多于一个基团存在时这些基团的每一个那样，独立地选择每个R基团。
芳基或杂芳基环的相邻原子上取代基中的两个任选地可形成式-T-C(O)-(CRR′)q-U-的环，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR′-或单键，q是0至3的整数。作为替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上取代基中的两个任选地可被式-A-(CH2)r-B-的取代基所取代，其中A和B独立地是-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或单键，r是1至4的整数。如此形成的新环的单键之一任选地可被双键取代。作为替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上取代基中的两个任选地可被式-(CRR′)s-X′-(C″R″′)d-的取代基所取代，其中s和d独立地是0至3的整数，X′是-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR′-。取代基R、R′、R″和R″′优选独立地选自氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂芳基。
本文使用的术语“杂原子”或“环杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
本文使用的“取代基”表示选自下列部分的基团：
(A)-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤代、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、未取代的杂芳基以及
(B)烃基、杂烃基、环烃基、杂环烃基、芳基和杂芳基，被至少一个选自如下的取代基所取代：
(i)氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤代、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、未取代的杂芳基以及
(ii)烃基、杂烃基、环烃基、杂环烃基、芳基和杂芳基，被至少一个选自下列的取代基所取代：
(a)氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤素、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、未取代的杂芳基以及
(b)烃基、杂烃基、环烃基、杂环烃基、芳基或杂芳基，被至少一个选自下列的取代基所取代：氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤素、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基和未取代的杂芳基。
本文使用的“限定大小的取代基(size-limited substituent)”或“限定大小的取代基团”表示选自上文针对“取代基团”描述的所有取代基的基团，其中每个取代或未取代的烃基是取代或未取代的C1-C20烃基，每个取代或未取代的杂烃基是取代或未取代的2至20元杂烃基，每个取代或未取代的环烃基是取代或未取代的C4-C8环烃基，以及每个取代或未取代的杂环烃基是取代或未取代的4至8元杂环烃基。
本文使用的“低级取代基”或“低级取代基团”表示选自上文针对“取代基团”描述的所有取代基的基团，其中每个取代或未取代的烃基是取代或未取代的C1-C8烃基，每个取代或未取代的杂烃基是取代或未取代的2至8元杂烃基，每个取代或未取代的环烃基是取代或未取代的C3-C7环烃基，以及每个取代或未取代的杂环烃基是取代或未取代的3至7元杂环烃基。
术语“可药用盐”意在包括根据本文所述化合物上存在的具体取代基用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，可通过使此类化合物的中性形式与足量期望的碱(纯的或在合适的惰性溶剂中)相接触来获得碱加成的盐。可药用碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐、或者类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，可通过使此类化合物的中性形式与足量期望的酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)相接触来获得酸加成的盐。可药用酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸、或亚磷酸等)的盐，以及衍生自相对无毒的有机酸(如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等)的盐。还包括氨基酸盐如精氨酸盐等，有机酸盐如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等(参见例如，Berge等，″Pharmaceutical Salts″，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些特定化合物同时含有碱性和酸性官能团，其允许化合物转化成碱或酸加成盐。
因此，本发明的化合物可以和可药用酸一起以盐的形式存在。本发明包括这种盐。这种盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐(如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐和氨基酸盐如谷氨酸盐。可以通过本领域技术人员公知的方法制备这些盐。
优选通过使所述盐与碱或酸相接触然后以常规方式分离母体化合物以再生所述化合物的中性形式。化合物的母体形式在某些物理性质方面与多种盐形式有差异，如在极性溶剂中的溶解性。
除了盐形式，本发明还提供前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是那些在生理条件下易于发生化学变化从而提供本发明化合物的化合物。而且，前药可以在离体环境下通过化学或生化方法转化成本发明的化合物。例如，当和适当的酶或化学试剂一起置于储库型透皮贴剂中时，前药可以缓慢转化成本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并包括在本发明范畴内。本发明的某些化合物可以多种晶体或不定型形式存在。一般来说，所有物理形式对于本发明设想的用途来说都是等同的，都包含在本发明的范围内。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；消旋体、非对映体、互变异构体、几何异构体和个体异构体(individualisomer)涵盖在本发明的范围内。本发明的化合物不包括那些本领域已知过于不稳定以至于不能合成和/或分离的化合物。
本发明的化合物在构成这些化合物的一个或更多原子上还可含有非自然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素对化合物进行放射性标记，所述放射性同位素例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)。本发明的化合物的所有同位素变化，无论放射性与否，都包括在本发明的范围内。
本文所使用的不带有数量词的名词表示一个或多个。此外，本文使用的短语“被取代”表示具体基团可被一个或多个任何或所有指定的取代基所取代。例如，当基团(如烃基或杂芳基)被“未取代的C1-C20烃基、或未取代的2至20元杂烃基所取代”时，所述基团可含有一个或多个未取代的C1-C20烃基、和/或一个或多个未取代的2至20元杂烃基。
本文使用的“治疗疾病的方法”涉及治疗疾病状态、由疾病状态所引起的状况、或者疾病症状。术语“治疗”及其结合，包括疾病的预防。
“舒尼替尼”是N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺及其可药用盐(如CAS号341031-54-7)。
“肽”是指单体是氨基酸且通过酰胺键连接起来的多聚体，作为替代地也称为“多肽”或“肽”。术语“蛋白质”涵盖多肽、蛋白质。此定义下，也包括非天然氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。非基因编码的氨基酸也可用于本发明。此外，经修饰而包含反应基团的氨基酸也可用于本发明。用于本发明的所有氨基酸可以是D-也可以是L-异构体。通常优选L-异构体。此外，其他肽模拟物也可用于本发明。对于一般性综述，参见Spatola，A.F.，CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRYOF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。因此，Ire1蛋白质(本文也简称“Ire1”)包括重组Ire1蛋白以及相同Ire1蛋白的拷贝或者来自不同来源的形式(如人Ire1、小鼠Ire1、酵母Ire1)。当Ire1蛋白是寡聚化的时候，形成寡聚物的Ire1蛋白质可来自相同或不同来源。
II.调节剂
本文公开了具有下式的Ire1调节剂：
式I中，R5、R6、R7和R8独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR15R16、-OR17、-COOR18、-SR19、-COR20、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基，其中R6和R7任选地共同形成取代或未取代的杂环烃基或者取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R5、R6、R7和R8独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR15R16、-OR17、-COOR18、-SR19、-COR20、R26-取代或未取代的烃基、R26-取代或未取代的杂烃基、R26-取代或未取代的环烃基、R26-取代或未取代的杂环烃基、R26-取代或未取代的芳基、或者R26-取代或未取代的杂芳基。R26独立地是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R27-取代或未取代的烃基、R27-取代或未取代的杂烃基、R27-取代或未取代的环烃基、R27-取代或未取代的杂环烃基、R27-取代或未取代的芳基、或者R27-取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R6和R7共同形成取代或未取代的杂环烃基或者取代或未取代的杂芳基。例如，R6和R7可共同形成取代或未取代的吡唑、或者取代或未取代的三唑。在一些实施方案中，R6和R7共同形成取代或未取代的吡唑。在一些实施方案中，R6和R7共同形成R28-取代或未取代的杂环烃基或者R28-取代或未取代的杂芳基。R28独立地是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R29-取代或未取代的烃基、R29-取代或未取代的杂烃基、R29-取代或未取代的环烃基、R29-取代或未取代的杂环烃基、R29-取代或未取代的芳基、或者R29-取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R5是取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R5是取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R5是取代或未取代的吡唑基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的咪唑基、取代或未取代的异噁唑基、取代或未取代的噁二唑基、取代或未取代的噁唑基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的哒嗪基、取代或未取代的噻唑基、取代或未取代的三唑基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的二氢噻吩并吡唑基、取代或未取代的硫茚基、取代或未取代的咔唑基、取代或未取代的苯并咪唑基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的苯并呋喃基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的喹唑啉基、取代或未取代的苯并三唑基、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的苯并噁唑基、取代或未取代的苯并咪唑基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的异吲哚基、取代或未取代的吖啶基、取代或未取代的苯并异噁唑基、或者取代或未取代的二甲基乙内酰脲。在一些实施方案中，R5是5-或6-元的R26-取代或未取代的含氮杂芳基。在有些事实方案中，R5可以是，例如，R26-取代或未取代的嘧啶基或者R26-取代或未取代的喹唑啉基。
R15、R16、R17、R18、R19和R20独立地是R30-取代或未取代的烃基、R30-取代或未取代的杂烃基、R30-取代或未取代的环烃基、R30-取代或未取代的杂环烃基、R30-取代或未取代的芳基、或者R30-取代或未取代的杂芳基。R30独立地是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R31-取代或未取代的烃基、R31-取代或未取代的杂烃基、R31-取代或未取代的环烃基、R31-取代或未取代的杂环烃基、R31-取代或未取代的芳基、或者R31-取代或未取代的杂芳基。
R27、R29和R31独立地是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，Ire1调节剂具有式：
不受理论限制，认为以上说明的3-氮基序负责Ire1调节作用。
式II中，R5与上文式I描述中对R5所定义的相同。
式II中，R1是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R1是R32-取代或未取代的烃基、R32-取代或未取代的杂烃基、R32-取代或未取代的环烃基、R32-取代或未取代的杂环烃基、R32-取代或未取代的芳基、或者R32-取代或未取代的杂芳基。R32是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R33-取代或未取代的烃基、R33-取代或未取代的杂烃基、R33-取代或未取代的环烃基、R33-取代或未取代的杂环烃基、R33-取代或未取代的芳基、或者R33-取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R1是R32-取代或未取代的C1-C10烃基、R32-取代或未取代的2至10元杂烃基、R32-取代或未取代的C3-C8环烃基、R32-取代或未取代的3至8元杂环烃基、R32-取代或未取代的芳基、R32-取代或未取代的杂芳基。在另一些实施方案中，R1是R32-取代或未取代的C1-C5烃基、R32-取代或未取代的2至5元杂烃基、R32-取代或未取代的C3-C6环烃基、R32-取代或未取代的5或6元杂环烃基、R32-取代或未取代的芳基、R32-取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R1是未取代的C1-C5烃基或未取代的C3-C6环烃基。在一些实施方案中，R1是未取代的C3-C6环烃基，例如环丙基。在另一些实施方案中，R1是R32-取代或未取代的5或6元杂环烃基，例如未取代的噻吩基或C1-C4取代的噻吩基。
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地是氢、R34-取代或未取代的烃基、R34-取代或未取代的杂烃基、R34-取代或未取代的环烃基、R34-取代或未取代的杂环烃基、R34-取代或未取代的芳基、或者R34-取代或未取代的杂芳基。R34独立地是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R35-取代或未取代的烃基、R35-取代或未取代的杂烃基、R35-取代或未取代的环烃基、R35-取代或未取代的杂环烃基、R35-取代或未取代的芳基、或者R35-取代或未取代的杂芳基。
R33和R35独立地是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
在另一些实施方案中，Ire1调节剂具有式：
在式III中，R1与上文式II描述中对R1所定义的相同。
相似的，R2独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地与上文式II描述中所定义的相同。
R2可以是取代或未取代的C1-C10烃基、取代或未取代的2至10元杂烃基、取代或未取代的C3-C8环烃基、取代或未取代的3至8元杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R2是R3-取代或未取代的芳基或者R3-取代或未取代的杂芳基。例如，R2可以是R3-取代或未取代的苯基。R3是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、-SH、-NO2、氧代、-NHR4、R4-取代或未取代的烃基、R4-取代或未取代的杂烃基、R4-取代或未取代的环烃基、R4-取代或未取代的杂环烃基、R4-取代或未取代的芳基、或者R4-取代或未取代的杂芳基。R4是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、-SH、-NO2、氧代、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
在另一些实施方案中，R2是取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡唑基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的咪唑基、取代或未取代的异噁唑基、取代或未取代的噁二唑基、取代或未取代的噁唑基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的哒嗪基、取代或未取代的噻唑基、取代或未取代的三唑基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的二氢噻吩并吡唑基、取代或未取代的硫茚基、取代或未取代的咔唑基、取代或未取代的苯并咪唑基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的苯并呋喃基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的苯并三唑基、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的苯并噁唑基、取代或未取代的苯并咪唑基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的异吲哚基、取代或未取代的吖啶基、取代或未取代的苯并异噁唑基、或者取代或未取代的二甲基乙内酰脲。R2还可以是取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的苯并咪唑基。在另一些实施方案中，R2是未取代苯基或未取代苯并咪唑基。在有些实施方案中R2是取代或未取代的稠环芳基或者取代或未取代的稠环杂芳基，如取代或未取代的苯并咪唑基或者取代或未取代的苯并噻唑基。
在另一些实施方案中，Ire1调节剂具有式：
在式IV和V中，R1与上文式II描述中所定义的相同。
相似的，R21和R22独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R21和R22独立地是卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、R25-取代或未取代的烃基(如C1-C10烃基)、R25-取代或未取代的杂烃基(如2-10元)、R25-取代或未取代的环烃基、R25-取代或未取代的杂环烃基、R25-取代或未取代的芳基、或者R25-取代或未取代的杂芳基。
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地与上文式II描述中所定义的相同。
R25是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、-NO、-SH、-NO2、氧代、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R25是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、-SH、-NO2、-NO、氧代、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R21是-CN、-NO、-NO2、-OH、-COOR12、-SR13、取代或未取代的烃基(如C1-C10烃基)、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在另一些实施方案中，R21是R25-取代或未取代的C1-C4烃基或者R25-取代或未取代的2-4元杂烃基。在一些实施方案中，R25是-CN、-CF3、-OH或氧代。在一些实施方案中，R21是-CH2-CN。在另一些实施方案中，R21是-CH2CH2OH。在另一些实施方案中，R21是-NH-CO-CH3。
在式V中，X是NH或S。在一些实施方案中，X是NH。
符号x和z独立地是0至5的整数。在一些实施方案中，x和z独立地是0或1。在一个实施方案中，z是1。在另一实施方案中，x是0。
在另一个实施方案中，Ire1调节剂具有式：
在式VI中，R1、R21和z与上文式IV描述中所定义的相同。
在一些实施方案中，z大于1，且两个相邻的R21取代基共同形成取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。在一个实施方案中，两个相邻的R21取代基共同形成取代或未取代的噻唑基或者取代或未取代的咪唑基。
符号y是0至4的整数。在一些实施方案中，y是0、1或2。
R36独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地与上文式II描述中所定义的相同。在一些实施方案中，R36是取代或未取代的C1-C10烃基。在一个实施方案中，R36是未取代的C1-C4烃基，如甲基。
在一些实施方案中，y大于1，且两个相邻的R36取代基共同形成取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，两个相邻的R36取代基共同形成取代或未取代的苯基，从而在一个实施方案中，Ire1调节剂具有式：
在式VII中，R1、R21和z与上文式VI描述中所定义的相同。
在另一些实施方案中，Ire1调节剂具有式：
在式VIII中，R1与上文式VI描述中所定义的相同。
在式VIII中，L是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、-NH-C(O)-或-NH-C(O)-NH-。在一些实施方案中，L是键、R38-取代或未取代的亚烷基或者R38-取代或未取代的杂亚烷基。R38是卤素、氧代、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R39-取代或未取代的烃基、R39-取代或未取代的杂烃基、R39-取代或未取代的环烃基、R39-取代或未取代的杂环烃基、R39-取代或未取代的芳基、或者R39-取代或未取代的杂芳基。R39是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，L是R38-取代或未取代的杂亚烃基，其中R38是氧代。在一些实施方案中，L是-NH-C(O)-或-NH-C(O)-NH-。
在式VIII中，环A是芳基或杂芳基。在一些实施方案中，环A是芳基，如苯基。
在式VIII中，R37是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R37是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R40-取代或未取代的烃基、R40-取代或未取代的杂烃基、R40-取代或未取代的环烃基、R40-取代或未取代的杂环烃基、R40-取代或未取代的芳基、或者R40-取代或未取代的杂芳基。R40是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、或未取代的杂芳基。在一个实施方案中，R37是取代或未取代的C1-C4烃基。在一个实施方案中，R37是-CF3。
符号w是0至5的整数。在一个实施方案中，w是0或1。在另一个实施方案中，w是1。
在本文所述式的一些实施方案中，各取代基被至少一个取代基所取代。更具体的，在一些实施方案中，在上述式的化合物中的上述各取代的烃基、取代的杂烃基、取代的亚烃基、取代的杂亚烃基、取代的环烃基、取代的杂环烃基、取代的芳基和取代的杂芳基被至少一个取代基所取代。在另一些实施方案中，至少一个或所有这些基团被至少一个限定大小的取代基所取代。作为替代地，至少一个或所有这些基团被至少一个低级取代基所取代。
在上述式的化合物的另一些实施方案中，各取代或未取代的烃基是取代或未取代的C1-C20烃基，各取代或未取代的杂烃基是取代或未取代的2至20元杂烃基，各取代或未取代的亚烃基是取代或未取代的C1-C20亚烃基、各取代或未取代的杂亚烃基是取代或未取代2至20元杂亚烃基，各取代或未取代的环烃基是取代或未取代的C3-C8环烃基，以及各取代或未取代的杂环烃基是取代或未取代的3至8元杂环烃基。
在一些实施方案中，各取代或未取代的烃基是取代或未取代的C1-C8烃基，各取代或未取代的杂烃基是取代或未取代的2至8元杂烃基，各取代或未取代的亚烃基是取代或未取代的C1-C8亚烃基，各取代或未取代的杂亚烃基是取代或未取代的2至8元杂亚烃基，各取代或未取代的环烃基是取代或未取代的C3-C7(如C5-C7)环烃基，以及各取代或未取代的杂环烃基是取代或未取代的3至7(如5至7)元杂环烃基。
在此处所述式的某些实施方案中，化合物可包括至少两个与骨架(base)上相邻成员相连的取代基。在这些实施方案中，两个相邻取代基任选地共同形成芳基、杂芳基、环烃基或杂环烃基基团。
在另一个实施方案中，Ire1调节剂化合物具有下式之一：
在另一个实施方案中，Ire1调节剂化合物具有下式之一：
在一个实施方案中，化合物是AD75。
在另一些实施方案中，Ire1调节剂是根据下式的化合物。
在一个实施方案中，化合物表现出对Ire1的显著活化，如化合物AD75、AD74、AD76、AD77、APY29、APY69、APY24、APY76、APY83、APY77、APY67、APY65、APY84和APY85。在另一个实施方案中，化合物表现出在体内对Ire1的显著活化，如化合物APY69、APY24、APY76、APY83、APY65、APY84和APY82。在另一个实施方案中，化合物表现出对Ire1的显著抑制，如化合物APY84、APY33、APY81、APY80、APY79和APY86。
III.方法
另一方面，提供了在细胞中调节Ire1活性的方法。所述方法包括使所述细胞与有效量的上述Ire1调节剂(如式I-VIII的化合物)或有效量的舒尼替尼(sunitinib)相接触。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，如人细胞。所述细胞可以是体外分离的、在体外构成组织的一部分、或者构成器官的一部分。
调节Ire1活性包括直接或间接影响Ire1的一个或多个功能和/或Ire1的一个或多个下游作用。换言之，和不存在调节剂时Ire1的功能或作用相比，Ire1的功能或作用发生了改变。
在一个实施方案中，Ire1调节剂是Ire1抑制剂，其降低下列一项或多项：错误折叠的蛋白质对Ire1的活化、UPR的起始、Ire1的反式-自磷酸化、Ire1结合辅因子、Hac1的翻译、Xbp1的翻译以及正确的蛋白质折叠。例如，由于Xbp1过表达和多发性骨髓瘤有关，在一些实施方案中，Ire1的有效量是与没有Ire1抑制剂时Xbp1的表达相比使得Xbp1表达降低的量。在另一个实施方案中，Ire1抑制剂的有效量是与没有Ire1抑制剂时UPR的量相比足以降低细胞中Ire1活性从而使得UPR降低的量。
在另一个实施方案中，Ire1调节剂是Ire1活化剂，其提高下列一项或多项：错误折叠的蛋白质对Ire1的活化、UPR的起始、反式-自磷酸化、辅因子的结合、Hac1的翻译、Xbp1的翻译以及正确的蛋白质折叠。因此，Ire1活化剂或舒尼替尼的有效量是与Ire1活化剂或舒尼替尼不存在时错误折叠蛋白质积累的量相比足以提高细胞中Ire1的活性从而减少错误折叠的蛋白质积累的量。
在一个实施方案中，调节Ire1的活性包括Ire1调节剂与Ire1直接结合。在另一个实施方案中，间接实现对Ire1活性的调节。
本文还提供在有此需要的对象中治疗由异常的Ire1活性水平所引起的疾病的方法。所述疾病可由过低或过高的Ire1活性的量所引起。例如，所述疾病可由Ire1活性缺乏或Ire1活性异常高(例如Ire1活性过高(hyperactivity))引起。所述方法包括向对象施用治疗有效量的如上所述的Ire1调节剂(如式I-VIII的化合物)或治疗有效量的舒尼替尼。
Ire缺乏是与特定的对象或健康对象群体的正常Ire1活性水平相比，Ire1活性的量降低。降低的Ire1活性的量导致错误折叠蛋白质的过量聚集，从而导致疾病状态。
Ire1活性过高是与特定的对象或健康对象群体的正常Ire1活性水平相比，Ire1活性的量提高。提高的Ire1活性的量导致例如过量的细胞增殖，从而导致疾病状态。
在一些实施方案中，疾病和Ire1缺乏有关。此类疾病包括但不限于：囊性纤维化、视网膜色素变性、糖尿病或神经退行性疾病。神经退行性疾病可包括亚历山大病(Alexander’s disease)、阿尔珀病(Alper′sdisease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩性脊髓侧索硬化、共济失调毛细血管扩张症(Ataxia telangiectasia)、巴廷病(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海绵状脑病(Bovinespongiform encephalopathy，BSE)、卡纳范病(Canavan disease)、科克因综合征(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性(Corticobasaldegeneration)、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、HIV相关痴呆症、肯尼迪病(Kennedy’sdisease)、克拉伯病(Krabbe’s disease)、路易体痴呆(Lewy bodydementia)、神经系统亚速尔病(Machado-Joseph disease)(3型脊髓小脑共济失调)、多发性硬化症、多系统萎缩、嗜睡病、神经疏螺旋体病(neuroborreliosis)、帕金森病、佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、匹克氏病(Pick’s disease)、原发性侧索硬化症、朊病毒病、雷夫叙姆病(Refsum’s disease)、桑德霍夫病(Sandhoff’s disease)、希尔德病(Schilder’s disease)、恶性贫血继发的脊髓亚急性联合变性、精神分裂症、脊髓小脑共济失调(具有不同特征的多种类型)、脊髓性肌萎缩、斯-理-奥病(Steele-Richardson-Olszewski disease)、或脊髓痨(Tabesdorsalis)。
在其他一些实施方案中，疾病和异常高的Ire1有关。此类疾病包括但不限于，癌症、炎疾病和自身免疫病。示例性癌症包括但不限于：乳腺癌和多发性骨髓瘤。在一个实施方案中，所述疾病是多发性骨髓瘤。示例性炎性疾病包括但不限于：哮喘、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠病、盆腔炎性疾病；再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥和血管炎。示例性自身免疫病包括但不限于：XBP1-连锁的克罗恩病、乳靡病、I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病(IDDM))、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥综合征、变应性肉芽肿(Churg-Strauss syndrome)、桥本甲状腺炎、格氏眼病、特发性血小板减少性紫癜和类风湿性关节炎。在一个实施方案中，所述疾病是XBP1-连锁的克罗恩病。
治疗疾病的对象通常是哺乳动物。用Ire1调节剂或舒尼替尼治疗的哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、和/或非人哺乳动物(如啮齿类动物、犬类动物)。
另一方面，本文所述调节剂还可调节Src酪氨酸激酶的活性。因此，提供了调节Src酪氨酸激酶活性的方法。所述方法包括使Src酪氨酸激酶与有效量的上述调节剂(例如式I-VIII的化合物)相接触。
另一方面，本文所述调节剂还可调节Abl酪氨酸激酶的活性。因此，提供了调节Abl酪氨酸激酶活性的方法。方法包括使Abl酪氨酸激酶与有效量的上述调节剂(例如式I-VIII的化合物)相接触。
IV.测定
可通过在溶液中使Ire1蛋白与测试化合物相接触来鉴定Ire1活性的调节。
可以通过鉴定测试化合物中的Ire1调节活性来检测多个Ire1蛋白的寡聚化。所述多个Ire1蛋白的寡聚化(或寡聚化Ire1蛋白)是指两个或更多Ire1蛋白的非共价结合。在一些实施方案中，寡聚化是指两个以上Ire1蛋白的非共价结合。在一些实施方案中，寡聚化是指约3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个Ire1蛋白或者至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个Ire1蛋白的非共价结合。在其他一些实施方案中，寡聚化是数十个Ire1蛋白的非共价结合。在下文实施例章节中更详细地描述Ire1的寡聚化。非寡聚化的Ire1蛋白是指没有寡聚化的多个Ire1蛋白。
一方面，通过在溶液中使测试化合物与多个寡聚化的Ire1蛋白相接触来鉴定Ire1调节剂。然后所述多个寡聚化Ire1蛋白分离形成多个非寡聚化Ire1蛋白进行检测，由此鉴定测试化合物对Ire1活性的调节。
可以通过任何已知的技术实现多个非寡聚化Ire1蛋白的寡聚化的检测。例如，通过检测溶液透明度的降低(如浊度和光散射增加)来实现检测。作为替代地，多个Ire1蛋白的第一部分用供体荧光团标记，所述多个Ire1蛋白的第二部分用受体荧光团标记(如猝灭剂)。通过检测荧光信号的变化实现寡聚化的检测。相同技术可用于对多个寡聚化Ire1蛋白分离形成多个非寡聚化Ire1蛋白进行检测。还可通过使用放射性标记或荧光标记的RNA测量Ire1RNA酶的酶活性来检测寡聚化。在测试化合物引起寡聚化之后，Ire1的RNA切割活性提高，或者在测试化合物引起去寡聚化之后，其活性降低。
在一些实施方案中，在寡聚化Ire1对总体酶促速率有贡献的条件下，用RNA底物监测Ire1的酶活性(例如RNA酶或激酶)来进行寡聚化的检测。可根据协同活化特征的存在来确认总体酶促速率。例如，Hill系数n可以大于1、2、3、4、5、6、7、8、10或更高(见图1)。
例如，可通过化合物与单体、二聚体或更高级寡聚物状态的Ire1的结合实现抑制。可由于Ire1寡聚物或二聚体的破坏、Ire1构象的改变、或者抑制剂和RNA底物竞争结合Ire1来实现抑制。所述抑制剂可以竞争性、非竞争性、反竞争性或混合模式发挥作用。
可以通过在RNA切割测定中测量Ire1的酶活来检测Ire1的抑制或活化。RNA切割测定使用，例如放射性标记的RNA、荧光标记的RNA、未标记的RNA或通过其他方式标记的RNA。作为替代地，可采用Ire1激酶活性测定来测量抑制或活化。作为替代地，可采用检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用的生物物理方法如动态光散射、分析型超速离心、等温量热法等来测量Ire1的抑制或活化。还可使用任何合适的基于细胞的测定(其基于使化合物与细胞或动物相接触，监测Ire1的激酶活性，监测Ire1的RNA酶活性或监测Ire1活化的下游作用)来测量Ire1的抑制或活化。Ire1活化的下游作用包括产生剪接的Hac1或XBP1蛋白、或涉及这两种蛋白的转录靶标的变化、或Ire1的激酶活性诱导的下游变化。有效的调节剂将影响Ire1的RNA酶活性、Ire1的激酶活性或Ire1的寡聚化状态。
V.药物组合物
另一方面，本发明提供了包含本发明化合物(即Ire调节剂)与可药用载体的药物组合物。所述药物组合物包括本文公开的所述抑制剂的光学异构体、非对映异构体或可药用盐。包含在药物组合物中的化合物可共价连接载体部分，如上所述。作为替代地，包含在药物组合物中的化合物不共价连接载体部分。
本文使用的“药学适合的载体”是指药物赋形剂，例如，适于肠内或肠胃外施用的可药用或生理上可接受的有机或无机载体物质，其与化合物不发生有害反应。合适的可药用载体包括水、盐溶液(如林格氏液)、醇、油、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。此类制备物可以是无菌的，如果需要，和助剂进行混合，所述助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等，其与本发明的化合物不发生有害反应。
可以向患者单独施用或可以联合施用本发明的化合物。联合施用意在包括同时或相继施用单独或组合形式(多于一种化合物)的化合物。因此，需要时，制备物还可以和其他活性物质(如减少代谢降解)组合。
本发明的化合物可以以多种口服、肠胃外和局部剂型的形式制备和施用。因此，本发明的化合物可以通过注射(如静脉内、肌肉内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内)施用。并且，本文所述化合物可以通过吸入(例如鼻内)施用。此外，本发明的化合物可以透皮施用。还预想多种施用途径(如肌肉内、口服、透皮)可用于施用本发明的化合物。因此，本发明还提供包含可药用赋形剂以及一种或多种本发明化合物的药物组合物。
为从本发明化合物制备药物组合物，可药用载体可以是固体或液体的。固体形式的制备物包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和分散颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，其还可作为稀释剂、矫味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或胶囊材料。
在粉剂中，载体是和细粒状活性成分混合的细粒状固体。在片剂中，活性成分以合适的比例和具有必要粘合特性的载体混合，并以期望的形状和尺寸压制。
粉剂和片剂优选含有5％至7％的活性化合物。合适的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。
对于制备栓剂，首先融化低熔蜡，如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，通过搅拌将活性成分均匀分散于其中。然后将熔融的均匀混合物倾入尺寸适宜的模子，使其冷却，从而固化。
术语“制备物”意在包括具有囊封材料的活性化合物的制剂，囊封材料作为载体提供胶囊，其中有或没有其他载体的活性成分被载体所包围，从而与之结合。相似的，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适于口服施用的固体剂量形式。
液体形式的制备物包括溶液、混悬液和乳剂，例如水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，可在丙二醇水溶液中配制液体制备物溶液。
当需要或期望肠胃外施用时，尤其适于本发明化合物的混合物是可注射的无菌溶液，优选油或水溶液，以及混悬液、乳剂或植入物，包括栓剂。具体而言，用于肠胃外施用的载体包括葡聚糖水溶液、盐水、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油、聚氧乙烯嵌段共聚物等。安瓿是便利的单位剂量。本发明化合物还可以并入脂质体或通过透皮泵或贴剂施用。适用于本发明的药物混合物是本领域技术人员公知的并描述于，例如Pharmaceutical Sciences(17th Ed.，Mack Pub.Co.，Easton，PA)和WO 96/05309，其中的教导通过参考并入本文。
可通过将活性成分溶解于水中来制备适于口服的水溶液，根据需要添加合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂。通过将磨细的活性成分同粘性材料(如天然或合成胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其他公知的混悬剂)分散于水中可以制备适于口服使用的水性混悬液。
还包括固体形式的制备物，其预期在临用前转化为液体形式的制备物用于口服施用。此类液体形式包括溶液、混悬液和乳液。这些制备物除了活性成分外还可含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
药物制备物优选是单位剂型的形式。以这种形式，制备物再被分成含有适当量的活性成分的单位剂量。单位剂型可以是经包装的制备物，所述包装含有离散量的制备物，如经包装的片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉剂。另外，单位剂量形式自身可以是胶囊、片剂、扁囊剂、或锭剂，或可以是包装的形式中适当数量的任何这些。
根据具体的应用和活性成分的效力，活性成分在单元剂量制备物中的量可以不同或进行调节，从0.1mg至10000mg，更典型的1.0mg至1000mg，最典型的10mg至500mg。如果需要，组合物还可以含有其他相容的治疗剂。
一些化合物可能在水中溶解度有限，从而可能在组合物中需要表面活性剂或其他合适的共溶剂。此类共溶剂包括：聚山梨酯20、60和80；普罗尼克(Pluronic)F-68和F-84和P-103；环糊精；聚乙二醇35蓖麻油(polyoxyl35castor oil)；或其他本领域技术人员已知的试剂。此类共溶剂通常以介于约0.01％重量和约2％重量之间的水平使用。
高于普通水溶液的粘度可能是理想的，以降低分散制剂的可变性，降低制剂混悬液或乳液之成分的物理分离，和/或以其他方式改善制剂。此类粘度构建试剂包括，例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、硫酸软骨素及其盐、透明质酸及其盐、上述组合以及本领域技术人员已知的其他试剂。此类试剂通常以约0.01％重量至约2％重量的水平使用。本领域技术人员可以轻易确定任何以上辅剂的可接受量。
本发明的组合物可另外包含用于提供持续释放和/或缓解的成分。此类成分包括高分子量的阴离子粘膜状(mucomimetic)聚合物、凝胶化多糖以及细粒状药物载体基质。在U.S.专利号4,911,920；5,403,841；5,212,162和4,861,760中更详细地讨论了这些成分。出于全部目的，这些专利的整个内容通过参考以整体并入本文。
本发明提供的药物组合物包括以治疗有效量含有所述活性成分的组合物，所述治疗有效量即有效实现预期目的的量。具体应用有效的实际量取决于，尤其是，待处理的情况。当在方法中施用以治疗疾病时，此类组合物将含有有效实现预期结果的活性成分的量，所述结果例如降低或提高Ire1活性和/或降低、消除或减慢疾病症状的进展。确定本发明化合物的治疗有效量在本领域技术人员的能力范围内，尤其是在本文详细公开的教导之下。
施用于哺乳动物的剂量和频次(单次或多剂量)根据多种因素而变化，例如哺乳动物是否患有其他疾病，其施用途径；接受者的体型、年龄、性别、健康、体重、体重指数以及饮食；待治疗的疾病(如阿尔茨海默氏病)的症状性质和程度、同时进行的治疗的种类、待治疗疾病的并发症或其他健康相关问题。其他治疗方案或试剂可以和申请人的发明方法和化合物联合使用。对已确立的给药(如频次和持续时间)的调整和操作在本领域技术人员的能力范围内。
对于此处所述的任何化合物，首先可以通过细胞培养测定来确定治疗有效量。靶浓度是能够实现本文所述方法的活性化合物浓度，如使用本文所述或本领域已知的方法所测量的。
如本领域公知的，用于人的治疗有效量也可以从动物模型来确定。例如，可以配制用于人类的剂量以实现已发现在动物中有效的浓度。如上所述，通过监测化合物有效性以及向上或向下调整剂量，可调节在人体中的剂量。基于上述方法和其他方法调整剂量从而在人体中获得最大效力完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
剂量可根据患者的需求和待使用的化合物而不同。在本发明背景下，向患者施用的剂量应足以在患者中随时间发挥有益的治疗反应。还可以通过任何不利副作用的存在、性质和程度确定剂量的多少。确定特定情况的合适剂量在专业人员的技能范围内。通常，以低于化合物最佳剂量的小剂量开始治疗。然后，以小的增量提高剂量直至达到环境下的最佳效果。在一个实施方案中，剂量范围是0.001％至10％w/v。在另一个实施方案中，剂量范围是0.1％至5％w/v。
可以单独调整给药的量和间隔来提供对所治疗的特定临床适应症有效的施用化合物水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相符的治疗方案。
采用本文提供的教导，可以设计有效的预防性或治疗性治疗方案，其不引起显著毒性，但能有效治疗特定患者表现的临床症状。这种设计应包括通过考虑各种因素(如化合物的效力、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的存在和严重程度、优选施用模式和所选试剂的毒性特征)来谨慎选择活性化合物。
具体化合物的毒性和治疗作用之间的比例是其治疗指数，其可由LD50(群体中50％致死的化合物的量)和ED50(群体中50％有效的化合物的量)的比值表示。优选表现出高治疗指数的化合物。从细胞培养测定和/或动物研究获得的治疗指数数据可用于制定人类使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于包含毒性较低或无毒性的ED50的血浆浓度范围内。所述剂量可根据所用剂量形式和所采用的施用途径在此范围内变化。参见例如Fingl等，In：THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS，Ch.1，p.1，1975。根据患者的情况和使用化合物的特定方法，各医师可以选择确切的制剂、施用途径和剂量。
I.实施例
如下实施例意图说明本发明的特定实施方案，而不对本文所述发明的范围进行限制。
常规方法。在大肠杆菌(E.coli)中表达蛋白，用GST-亲和纯化和体积排阻色谱进行纯化。通过PCR制备DNA寡核苷酸，购自IDT。从Dharmacon Inc.购买RNA寡核苷酸或通过T7RNA聚合酶体外转录进行制备。在30℃和中性pH下进行所有动力学测定和分析型超速离心。从冷藏保存的晶体在光束8.3.1(Advanced Light Source，BerkeleyNational Laboratories)下收集衍射数据。采用PDB坐标2rio作为PHASER中的检索模型通过分子置换来确定相。最终模型含有Ire1的氨基酸665-864、892-1115；N尾的一部分(641-664)以及过度磷酸化的环865-891(aF-aEF)是无序的。最终分辨率是R/Rfree是具有优良几何的0.264/0.298。在下文提供对实验过程的详细描述。
实施例1：通用化学合成
本发明特定化合物可使用如下方案进行合成，依据需要选择合适的试剂。
通用方案1
以上方案1中变量R1和R2分别与如上所述Ire1调节剂的描述中所定义的变量R1和R2相同。可根据公知的化学合成技术改变以上方案来获得本文所述化学物质的多种实施方案。
实施例2：用通用方案1合成APY24
步骤1：4-嘧啶基-氨基吡唑中间体的合成。将2，4-二氯嘧啶(3.2g，21.6mmol)以及5-环丙基-2H-吡唑基-3-基氨基(2.65g，21.5mmol)溶于1∶1的THF和H2O的混合物(140mL)中，用KOAc(30当量.，64g)处理，并在55℃下保存48h。分层，蒸发有机层，溶于CH2Cl2(30mL)，在-20℃下保存3h。通过过滤收集沉淀的嘧啶基-氨基吡唑的氯盐。蒸发过滤物，溶于CH2Cl2(25mL)，在-20℃下再保存3h并过滤。合并的固体溶于CHCl3∶CH3OH10∶1(25mL)并纯化(CHCl3∶CH3OH＝100∶0→90∶10)，获得嘧啶基-氨基吡唑中间体(46％的产率，2.32g)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.14(s，1H)，10.23(s，1H)，8.10(s，1H)，1.84(m，1H)，0.88(m，2H)，0.64(m，2H)。13C NMR(100MHz，DMSO)δ161.4、160.7、160.0、153.9、148.6、147.8、146.8、8.4、8.2。C10H10ClN5的MS计算(结果)为235.06(M+)，测得236.15(M+)。
步骤2：APY24的合成。一氯嘧啶基-氨基吡唑(0.2g，0.85mmol)和对氨基苄腈(0.112g，0.85mmol)溶于BuOH(8mL)，随后加入浓HCl(0.1mL)。最终的反应混合物在100℃下保存过夜。通过过滤收集固体沉淀物，用BuOH(8mL)清洗，在真空下干燥获得化合物APY24(0.23g，86％的产率)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ11.46(s，1H)、10.98(s，1H)、7.96(m，1H)、7.48(bs，2H)、7.37(d，2H，J＝8Hz)、6.49(bs，1H)，6.01(bs，1H)、4.03(s，2H)、1.82(m，1H)、0.89(m，2H)、0.52(bs，2H)。13C NMR(100MHz，DMSO)δ160.3、153.2、147.6、145.8、143.2、136.5、129.4、124.4、119.8、100.1、94.1、22.6、8.8、7.4。C18H17N7的MS计算(结果)331.15为(M+)，测得332.11.(M+)。
实施例3：AD74的合成
AD74的合成：N-(4-(4-(3-环丙基-1H-吡唑基-5-基氨基)嘧啶基-2-基氨基)苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺。将CH2Cl2(10mL)中的N2-(4-氨基苯基)-N4-(3-环丙基-1H-吡唑基-5-基)嘧啶基-2，4-二胺(0.011g，0.035mmol；Shokat Lab：A.Statsyuk)溶液在冰水浴中冷却。向其中逐滴加入稀释于CH2Cl2(5mL)的3-(三氟甲基)苯酰氯(0.005mL，0.036mmol)。使反应升温并搅拌1小时。反应一直进行到通过TLC和LC-MS判断反应完成。在真空中浓缩反应混合物，重悬于50∶50H2O-CH3CN中，在CH3CN/H2O/0.1％TFA(1-100％梯度)中，在C18柱上纯化来获得AD74。ESI-MS m/z[M+H]+显示为480.5，测得480.2。
实施例4：AD75的合成
AD75的合成：1-(4-(4-(3-环丙基-1H-吡唑基-5-基氨基)嘧啶基-2-基氨基)苯基)-3-(3-(三氟甲基)苯基)尿素。将CH2Cl2(10mL)中的N2-(4-氨基苯基)-N4-(3-环丙基-1H-吡唑基-5-基)嘧啶基-2，4-二胺(0.022g，0.07mmol)溶液在冰水浴中冷却。向其中逐滴加入稀释于CH2Cl2(5mL)中的3-(三氟甲基)苯基异氰酸酯(0.030mL，0.2mmol)。使反应升至室温，并搅拌1小时。反应一直进行到通过TLC和LC-MS判断反应完成。在真空中浓缩反应混合物，重悬于50∶50H2O-CH3CN中，在CH3CN/H2O/0.1％TFA(1-100％梯度)中，在C18柱上纯化来获得AD75。ESI-MS m/z[M+H]+发现为495.5，测得495.2。
实施例5：AD76的合成
AD76的合成：N-(3-(4-(3-环丙基-1H-吡唑基-5-基氨基)嘧啶基-2-基氨基)苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺。将溶于CH2Cl2(10mL)中的N2-(3-氨基苯基)-N4-(3-环丙基-1H-吡唑基-5-基)嘧啶基-2，4-二胺(0.014g，0.046mmol；Shokat Lab：A.Statsyuk)在冰水浴中冷却。向其中逐滴加入稀释于CH2Cl2(5mL)中的3-(三氟甲基)苯甲酰氯(0.007mL，0.046mmol)。使反应升温并搅拌1小时。反应一直进行到通过TLC和LC-MS判断反应完成。在真空中浓缩反应混合物，重悬于50∶50H2O-CH3CN中，在CH3CN/H2O/0.1％TFA(1-100％梯度)中，在C18柱上纯化来获得AD76。ESI-MS m/z[M+H]+显示为480.4，测得480.2。
实施例6：AD77的合成
AD77的合成：1-(3-(4-(3-环丙基-1H-吡唑基-5-基氨基)嘧啶基-2-基氨基)苯基)-3-(3-(三氟甲基)苯基)尿素。将CH2Cl2(10mL)中的N2-(3-氨基苯基)-N4-(3-环丙基-1H-吡唑基-5-基)嘧啶基-2，4-二胺(0.014g，0.046mmol)在冰水浴中冷却。向其中逐滴加入稀释于CH2Cl2(5mL)中的3-(三氟甲基)苯基异氰酸酯(0.006mL，0.046mmol)。使反应升至室温并搅拌12小时。反应一直进行到通过TLC和LC-MS判断反应完成。在真空中浓缩反应混合物，重悬于50∶50H2O-CH3CN中，在CH3CN/H2O/0.1％TFA(1-100％梯度)中，在C18柱上纯化来获得AD77。ESI-MS m/z[M+H]+测得495.4，计算为495.2。
实施例7：分析方法
Ire1构建物的表达和纯化。用Pfu聚合酶和编码Ire1胞质结构域的pGEX-6P-2载体通过PCR制备用于Ire1表达的质粒(Sidrauski，C.等Cell90：1031-9(1997))。使用Biochem Lab Solutions3.5设计用于诱变的DNA引物，购自IDT。在BL21CodonPlus(RIPL)大肠杆菌细胞(Stratagene)中表达蛋白。如先前所述进行表达和纯化(Nock，S.等，Methods Enzymol342：3-10(2001))。我们注意到，细菌在22℃下生长，裂解物和FPLC缓冲液含有至少300mM NaCl来防止Ire1的聚集。使用280nm下的吸收峰通过UV谱确定蛋白浓度并计算消光系数(Biochem Lab Solutions3.5)。通过考马斯亮蓝染色和定量FPLC痕量级(trace)判断，纯化的Ire1变体浓度为10-70mg/ml，纯度大于99％。
RNA底物的制备。HP2121-mer和HAC128-mer购自DharmaconInc。从编码HAC1和XBP1mRNA的限制性酶切的质粒或从PCR扩增的产物制备其他RNA底物。使用MegashortScript试剂盒(Ambion)制备制备量的长RNA。使用前，通过变性(8M尿素)5-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，交联29∶1(National diagnostics)，TE缓冲液洗脱以及乙醇沉淀来纯化寡聚核苷酸。用T4PNK(NEB)和g-32pATP(NEN)制备5′-末端32p-标记的底物。在a-32pUTP(NEN)存在时，用T7RNA聚合酶(Promega)进行转录来制备32p-标记的底物。通过变性5-20％PAGE，TE洗脱和乙醇沉淀来纯化32p-标记的底物。
RNA酶切割分析。在30℃下，在含有20mM HEPES(pH7.5)、70mM NaCl、2mM ADP(pH7.0)、2mM Mg(OAc)2、5mM DTT、5％甘油，低于1nM的32p-标记RNA底物和3nM至20μM Ire1的缓冲液中进行RNA切割反应。使用Biochem Lab Solutions3.5设计反应溶液和缓冲液。准备反应，使得1μl RNA加入到9μl含有除RNA以外的所有成分的预热反应混合物中。通常，从5秒作为第一个时间点开始，记录3-10分钟时间段。每间隔一段时间，从各反应中提取1μl溶液，并和6μl含有10M尿素、0.1％SDS、0.1mM EDTA、0.05％氯代二甲苯和0.05％溴酚蓝的终止液混合。通过变性10％PAGE分离样本，在磷屏上曝光。在Storm或Typhoon设备上对屏进行扫描，用ImageQuant5.0或GelQuant.NET1.4程序定量。对数据作图，用SigmaPlot6.0拟合。
RNA切割可用于评价yIre1的活化，如图20和下表(3μM ylrel，茎环RNA，15μM效应子)所示：
对照 0.000504
APY29 0.07509
APY69 0.06355
APY24 0.04667
APY76 0.03994
APY83 0.02693
APY77 0.006479
APY67 0.006034
APY65 0.005304
APY84 0.004672
APY85 0.003287
APY33 0.00232
APY82 0.002172
APY78 0.002028
APY81 0.001872
APY75 0.00175
APY34 0.0014
APY80 0.001022
APY36 0.000897
APY79 0.000626
APY87 0.000358
APY86 0.000324
如图21A所示，另外用示例性化合物进行RNA切割抑制分析(1.5μM ylrel、茎环RNA、100μM ADP-2mM Mg、30μM效应子)。
分析型超速离心。将Ire1样本(10μM)加样至用于RNA酶切割分析的400μl缓冲液中的细胞。在Beckmann XL-A分析型超速离心机上以55,000rpm和30℃进行离心。以每2分钟一次扫描的频率收集总共60个扫描。在UltraScan6.0中，用平均轴比(axial ratio)为3∶2的C(s)分布分析痕量沉淀。
质谱。用100％甲醇和水清洗用金包被的板。溶液A(0.7ml乙腈中的10mg4-HCCA，0.1％三氟乙酸)快速涂成一层，并使其干燥。用纸巾轻轻除去残留物。然后，将0.5μl含有1μl Ire1样本(0.1-1mg/ml)和5μl溶液B(300μl甲酸、100μl H2O、200μl异丙醇和10mg4-HCCA)的混合物点样至干燥的表面，并使其干燥。用2μl0.1％三氟乙酸清洗样本两次，用于在Voyager质谱仪上进行MALDI分析。用MoverZ进行谱图分析。
结晶。首先，通过蒸气扩散法将Ire1KR32(10mg/ml)以与ADP(2mM)的复合物的形式从1.0M柠檬酸钠中结晶。这些共结晶物在一个方向上是无序的，使得其无法用于衍射研究。通过用激酶抑制剂APY29取代ADP来获得一种不同的结晶形式。通过蒸气扩散法，在悬滴中获得Ire1KR32·APY29晶体。通过将储存缓冲液(20mM HEPES pH7.0(20℃)、300mM NaCl、2mM DTT和5％甘油)中的1μl Ire1KR32(12mg/ml)和APY29(1.2mM)与1μl含有0.27M Na2SO4、8％PEG-3350、10mM EDTA和2mM TCEP的溶液混合来制备液滴。孔(Well)溶液含有200μl0.085M Na2SO4、2.33％3350和5％叔戊醇。单晶在室温下持续3到4天生长至0.1x0.4x0.2mm的最大尺寸。我们发现TCEP可以用10mM L-半胱氨酸代替。对于冷冻保护，将晶体在含有0.085MNa2SO4、3％tAm、5％PEG-3350和30％乙二醇的溶液中速冻。
数据收集和分析。在伯克利国家实验室，在Advanced LightSource上记录光束8.3.1的X-射线衍射数据。对于用的X-射线波长和1度的振荡角获得的数据集，用XDS数据包进行索引、整合和按比例绘制(Kabsch，W.J Appl Cryst26：795-800(1993))(图14)。5％的反射标记为测试组(test-set)(R自由组)反射来监测细化(refinement)的进程。通过使用PHASER来寻找分子置换溶液(McCoy，A.J.J ApplCryst40：658-674(2007))。将来自近期的Ire1二聚体的X-射线结构的单体A的14个拷贝(Lee，K.P.等，Cell132：89-100(2008))用作细化的起始模型。用14倍NCS进行CNS中模拟退火(Simulated annealing)和分群(grouped)B-因子细化(Brunger，A.T.等.Acta Crystallogr D BiolCrystallogr54：905-21(1998))，以及在最终阶段进行PHENIX(Adams，P.D.等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr58：1948-54(2002))。傅立叶SA-加权的(Read，R.J.Acta Cryst A42：140-149(1986))F观察-F计算差异图用于解释从起始结构中缺少的部分模型。用ChemSketch10.0(ACDlabs)产生配体的模型。在Coot(Emsley，P.等，Acta Crystallogr D BiolCrystallogr60：2126-32(2004))、Pymol(W.DeLano)和RSRef(Korostelev，A.等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr58：761-7(2002))中进行模型的构建和局部真实空间的细化。最终的模型具有很好的立体化学参数(图14)和低晶体学R/R自由0.264/0.298，表明和衍射数据的一致性好。
细胞测定。使用HEK293细胞作为模型系统，在哺乳动物细胞中测试衣霉素、SU11248、DJM2005、APY24和APY29对Ire1活性的作用。根据Lin JH等，Science318：944(2007)中描述的方法处理细胞。用相应的试剂处理指定的时间后，通过RT-PCR确定Xbp-1mRNA的剪接。指明未剪接的(u)和剪接的(s)Xbp1-mRNA产物，并作为通过Ire1的UPR活化的测量。结果如图17中所述。
分析示例性化合物对UPR的作用。结果在图18-19和下表中描述。
在AD系列的Ire1调节剂存在下，人Ire1对32P-茎环RNA的体外切割得到如下结果：
空白 8.8310e-3
AD74 0.0877
AD75 0.2317
AD76 0.0139
AD77 0.0239
还进行了与Src和Abl的交叉反应性分析。纯化的c-Src或Abl在激酶反应缓冲液(10mM HEPES(pH7.2)、10mM MgCl2、0.2mMDTT)中稀释成大约10nM的浓度，用1mg/mL BSA、2.5％(v/v)DMSO、133μM肽(对于Abl序列为EAIYAAPFKKK，对于c-Src序列为EIYGEFKKK)和不同浓度的抑制剂进行预孵育。通过加入补充有5mCiγ32p ATP的100mM冷ATP起始激酶反应，使其在室温(RT)下进行。10分钟时，将1mL反应物点样至磷酸纤维素板(P81，Whatman)，随后浸入清洗缓冲液(1.0％(v/v)磷酸)中。在缓冲液中清洗5次板，干燥，使用TyphoonTM扫描仪(Molecular Dynamics)通过磷成像测量转移的放射性。使用ImageQuant软件对放射性计数进行定量，使用软件包将滴定数据拟合为S形剂量应答来产生IC50值。剂量应答基于12点抑制剂滴定，从100mM开始采用1/3稀释。
体外筛选方法。为了鉴定Ire1的活化剂和抑制剂，进行特定的体外测定。
1)溶液透明度测定：
为了鉴定活化剂，该测定使用任何适于在溶液中检测蛋白聚集的方法。最原始的形式，对含有～300mM NaCl和5-100mg/ml Ire1的中性缓冲液中Ire1溶液进行简单的目测检查。活化剂的加入会导致出现浑浊(图2A)。这种筛选迅速，高通量并适于简单的自动化。作为替代地，可以采用动态光散射(DLS)或静态光散射(SLS)方法测量溶液的光散射。选择筛选条件，使得向溶液中添加ADP或已知的活化剂(APY29)引起重物质(heavy species)现象，正如通过n DLS或SLS方法所检测到的。有效的活化剂会导致形成寡聚物。本领域技术人员公知的检测蛋白聚集的其他方法同样有效。
通过反向进行相同的筛选来发现抑制剂，即在ADP或合成活化剂存在下将测试化合物加入预先形成的Ire1聚集物中。监测相反的变化(聚集物的溶解)。有效的抑制剂能够溶解聚集物。
2)荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET) 测定
这种测定的优势在于对活化分子的灵敏度高以及在很稀的Ire1浓度下进行测量的能力，其中更易于从大量较弱相互作用的活化剂和抑制剂中选出紧密结合的活化剂和抑制剂。用于这种测定的Ire1是供体荧光团标记的Ire1(Ire1-FRET-D)和受体荧光团(或淬灭染料)标记的Ire1(Ire1-FRET-A|Q)的混合物。
用半胱氨酸化学或任何其他标记蛋白的技术手段将荧光团与Ire1共价连接。谨慎选择荧光团的位置，使其接触溶剂但不位于任何蛋白-蛋白界面；不阻断激酶和RNA酶的活性位点；不引起或阻断可能的蛋白重排，即标记对蛋白而言应该是中性的。重要的是，标记应当位于这样一种距离，即在来自Ire1-FRET-D和Ire1-FRET-A|Q混合物的组装成复合寡聚物后，可能发生标记之间的FRET。除了在低得多的Ire1浓度(加入测试化合物如ADP或APY29时仍产生有用的信号变化)下以外，如上述进行对活化和抑制混合物的筛选。采用供体和/或受体染料的荧光进行信号检测。
对示例性化合物进行测定，结果如下表中所述。
3)动力学分析：
动力学分析如Lin JH等，Science318：944(2007)中所描述。被Ire1切割的放射性标记或荧光标记的RNA寡核苷酸用作底物。在对测试化合物(ADP和APY29)产生最强活性应答的Ire1浓度下进行筛选RNA切割反应。活化剂和抑制剂筛选如上述。
结果
制备含有激酶和RNA酶结构域(Ire1KR)以及向N端延伸24个(Ire1KR24)或32个(Ire1KR32)氨基酸的Ire1KR的Ire1胞质部分的变体(图1A、图1C、图7)。这些额外的氨基酸延伸是一个约100个氨基酸长的连接结构域的一部分，其将激酶/RNA酶结构域限制于跨膜结构域。所有三个构建物均位点特异性地切割来自XBP1mRNA的5′-32p-标记的茎环寡聚核苷酸14(图1B、图8)。切割21-mer茎环HP21的观察速率常数表现出对酶浓度的非米氏(Michaelis)依赖性，以及其与Ire1KR和Ire1KR24的Hill系数n＝2协同提高，令人惊奇的是，Ire1KR32的Hill系数n＝3.5-8(图1D)。这一结果说明Ire1的RNA酶活性产生于自缔合，Ire1KR和Ire1KR24主要形成二聚体，而Ire1KR32形成寡聚物。RNA酶的协同活化不需要ADP·Mg辅因子。然而，辅因子将特异性RNA酶活性平均提高两个数量级，表明其刺激活化转化(见Mechanistic implications)。
蛋白浓度高于10μM时，与Ire1KR32的反应呈现为浑浊、不均匀的混悬液，这表明Ire1KR32的高级寡聚化(图1D、图2A)。样本的分析型超速离心后明显存在多种寡聚化种类的Ire1KR32(图2B)。通过向溶液中加入盐使得寡聚化轻易逆转并抑制RNA酶活性(图2A、图2C)。相反，Ire1KR和Ire1KR24的溶液在所有蛋白浓度下保持清澈，没有呈现蛋白寡聚化的物理征兆，正如根据图1D中其活化特征图的较低协同性所预期的。
Ire1KR32表现出相比于Ire1KR和Ire1KR24对HP21高102倍的特异性RNA酶活性(图2D，左图)。在1μM酶浓度时比较观测速率常数，其中反应以相同的动力学形式发生，所述形式特征为观测速率常数的log-线性浓度应答。Ire1KR32的催化优势对较长的底物XBP1443-mer来说更显著，该底物是更接近Ire1天然mRNA底物的模拟物(图2D，右图)。在所示的条件下，Ire1KR32相比于Ire1KR24和Ire1KR以快约104-105倍的速率切割该底物。这些结果显示构成Ire1KR32和Ire1KR24之间差异的N-端连接结构域中8个碱性氨基酸(图7)导致了Ire1胞质结构域的自缔合特性和特异性RNA酶活性。包含此延长N-端的Ire1结构域的用途对于获得寡聚化状态Ire1的结晶结构来说是重要的(如下文)。
野生型Ire1活化。将Ire1KR32与设计用于靶向CDK2和EGFR激酶的抑制剂共结晶。某些激酶抑制剂完全活化Ire1的RNA酶功能(图3A)。这是野生型Ire1被合成化合物活化的第一个实例。
用抑制剂APY29获得的结晶使得能够以分辨率对Ire1KR32-APY29复合物进行结构测定。数据统计总结于图15中。分辨率良好的抑制剂分子密度见于Ire1激酶结构域的ATP结合穴中(图3B)。APY29与E746、L747和C748所形成的蛋白质骨架形成广泛的氢键网络(图3C)。氢键也可能在活化位点N751和D828的两条侧链形成。抑制剂结构的比较显示所有测试化合物可以与蛋白质骨架形成氢键(图3D)。此外，强效的活化剂(如APY29和APY24)可以与侧链N751形成氢键，在ADP糖-磷酸酯部分的位置插入庞大的芳香环。由激酶抑制剂复合物(如PDB IDs2G9X和2F4J)的已知结构指导的舒尼替尼手工拟合预测所述化合物填充核苷碱基位点，但不填充糖和磷酸酯的亚位点。这种部分占据同舒尼替尼和Ire1的较好结合一致，其伴有酶的仅仅部分活化(图3A)。由于立体冲突，AIN54不能轻易的和ATP穴契合，这一部分是由于β链β1的位置异常所引起的，β链β1覆盖了Ire1激酶的核苷酸-结合穴。
除了抑制剂不采用二价金属离子用于停靠(dock)以外，APY29与核苷酸-结合穴的相互作用近似模拟了天然辅因子ADP(图3E)。这种结构差异提供了很好的工具来测试镁在Ire1的RNA酶活性中的作用。因此，检验了EDTA对Ire1KR32RNA酶活性的作用。对于由ADP活化的反应，RNA酶活性的降低超过一个数量级，而对于由APY29活化的反应，RNA酶活性不变(图3F)。因此，Ire1的RNA酶活性不需要二价金属离子，证明镁看来仅通过将ADP的负电荷磷酸酯部分和D828的羧基相连来用于ADP结合。
总之，这些结果显示ADP和抑制剂通过填充ATP穴来活化Ire1的RNA酶。对于最高的活性，应当占据核苷碱基和糖的位置来稳定激酶的活性开放构象，所述构象有助于Ire1的自缔合。由于金属离子和ADP磷酸酯基团的协作导致的静电相互作用不发挥特异性作用，因此可以被中性空间填充基团所替换。
与缺少诱导寡聚化的N-端区段以及以二聚体结晶的Ire1的晶体结构(图1、图2、图7)不同，Ire1KR32结晶为对称的高级组装体(图4A)。14个Ire1KR32分子构成晶格中的非对称单元。寡聚物的形成可以描述为，对称的Ire1二聚体同时以每个二聚体51.4°的顺时针转角添加至生长中的纤维的一侧，每14个分子形成一个完整360°的转角。这种逐步寡聚化机制看来发生在溶液中，Ire1KR32的分析型超速离心显示单体、二聚体、四聚体和六聚体，但缺少三聚体和五聚体(图2B)。
和Ire1-ADP二聚体的晶体堆积相比(图4A，插页)，Ire1KR32在寡聚物中的紧密堆积需要多种Ire1的必要元件，其仅可以构建成本模型。这些新的结构元件在图4C-E中标出。这些新元件均不属于先前确定的结构中所规定的(图4C)两重对称背靠背Ire1二聚体(由单体A和B、C和D等构成的，图4B)形成的IF1界面。随着这些Ire1二聚体在螺旋杆中堆积，形成两个新的界面。界面IF2也是两重对称的，由单体A和D、C和F等的RNA酶结构域之间的接触而形成。其包括α3′螺旋以及连接α3′和α4螺旋的α3′-α4环。界面IF3由单体通过线性并排排列成纤维而形成(...-＞A-＞C-＞E-＞...以及相反的极性...-＞F-＞D-＞B-＞...)。IF3由激酶结构域之间的接触而形成，其包括两个新的元件、αD′螺旋和活化环(图4E)。Ire1的两个区域(N端延长(641-664位残基)和αEF-αF环(865-892位残基))在寡聚物中是无序的，其结构有待确定。结构上，寡聚物组装成DNA双螺旋(图4B、图9)，其中界面IF1平行于相反链的核苷碱基之间的相互作用，界面IF3平行于相同链的核苷碱基之间的磷酸二酯键。
Ire1单体在界面IF3上的排列(图4E、图5A)与一个激酶的磷酸化环和相邻分子的活性侧相邻，以进行反式自(in-trans)磷酸化。对于常规的激酶，反式自磷酸化复合物是二聚体，其中激酶和其参与的伴侣交换活化环。在Ire1寡聚物中，实现不同的活化环交换排列，使得各激酶将其活化环提供给新的伴侣，从而延长了线性纤维形寡聚化组装。
用于动力学分析和结晶的Ire1KR32含有17个磷酸化的残基(图10)。除了4个磷酸之外，其余所有磷酸均可以通过磷脂酶混合物处理被除去。表达激酶活性位点(D828A)突变的Ire1后，没有观察到磷酸化，表明Ire1的所有磷酸来自其自身的激酶活性，如同大肠杆菌中所表达的该蛋白。胰酶消化之后进行质谱分析将磷酸化位点定位于活化环和αEF-αF环(图11)，此两者均面向界面IF3。总之，寡聚物结构和MALDI分析支持这样的模型，其中IF3用于反式自(in-trans)磷酸酯的转移。界面IF3的存在解决了下述困难，即如何解释在IF1-样二聚体中立体上不利的激酶背靠背排列情况下，Ire1的反式自磷酸化。
紧密堆积的寡聚物使得除了Ire1之外的激酶不太可能接近磷酸基受体位点，这表明磷酸基转移反应是高度特异的。这种特性解释了Ire1中的特异性磷酸化位点既不是任何可识别共有基序的一部分，也明显不存在于已知磷酸化Ire1的其他激酶。
寡聚物结构中Ire1KR32分子之间三个不同界面的存在(图4、图5A)引发他们对Ire1RNA酶活化的相对贡献的问题。本研究中所开发的具有大动态范围的定量切割测定(图1、图2)用来表征具有各个通过突变选择性破坏的界面的Ire1变体。对于IF1，用E988Q突变制备Ire1，其在测试的RNA酶IF1突变中具有对RNA酶活性最强的破坏作用。对于IF2和IF3，鉴定了先前未表征的接触，对其进行突变从而使得相应界面应当变得不稳定(图5B)。
在标准切割测定(3μM Ire1，HP21底物)中，所有测试的突变表现出明显的不利作用(图5C)。和IF1的E988Q突变相比，IF2和IF3的突变图谱表现出对RNA酶活性同样或更强的作用。对Ire1RNA酶结构域形成的新界面IF2进行进一步研究。破坏激酶-RNA酶界面(R947A)处的盐桥导致RNA酶活性降低十倍以上。位于新RNA酶-RNA酶界面处的精氨酸突变(R1087Q)具有更强的作用。正如对盐桥所预期的，电荷逆转(R1087D)对RNA酶活性的损害强于电中性突变(R1087Q)。R1087(D1030R)伴侣的突变也抑制RNA酶活性，但是程度较小。D1030R突变产生较小影响的原因尚不清楚。可能是由于D1030R引起局部接触的重新分布，其部分补偿了静电接触的破坏。所有三个Ire1界面对RNA酶活性的重要性显示IF1、IF2和IF3在组装活化的Ire1KR32寡聚物方面的联合作用。
已表明二聚化通过提供串联排列的活性位点来活化Ire1的RNA酶，所述活性位点与HAC1/XBP1mRNA中串联的剪接位点互补。原理上，这种机制可以解释为什么和HAC1/XBP1mRNA相比，茎环的切割缓慢(图2D)。然而，多种证据不支持所提出的模型。尽管Ire1KR32相比茎环表现出对HAC1/XBP1mRNA切割的更大优势，然而Ire1KR和Ire1KR24没有显示出差异(比较图2D中HP21和XBP1数据)。因此，对XBP1mRNA的识别和Ire1形成寡聚物的能力有关。此外，仅含有单茎环切割位点的底物可以以HAC1和XBP1mRNA反应的速率与Ire1KR32反应(图6A、图6B，比较XBP-1和XBP1-Pst1)，含有两个茎环的底物可以以HP21寡聚核苷酸的速率反应(图6C，比较XBP-1，58nt.和HP21)。这些发现表明Ire1的自缔合通过不同于立体互补底物mRNA中双剪接位点的机制来活化RNA酶结构域。
为了更好理解Ire1活化的机制，研究了寡聚物中RNA酶结构域的排列。在寡聚物结构中，RNA酶结构域通过两个界面IF1和IF2连接成为连续的带。各界面的形成掩盖的总表面积(图14)。IF2包括相邻RNA酶单体α3′螺旋间倒侧向面接触(图6D)。α3′α-螺旋以及连接至α3′螺旋的α3′-α4环(图6D和图14中所示)在二聚体结构中是无序的，表明IF2的形成稳定了α3′、α3′-α4螺旋-环元件(称为helix-loop element，HLE)。HLE中的点突变强烈抑制了Ire115的RNA酶活性。HLE的功能重要性及其靠近二聚化界面的位置可能提供了控制Ire1的RNA酶活性的动态转换。实际上，α3′螺旋形成所提出的活性位点的一部分，并产生专门针对酶底物结合穴的腔。没有HLE时，先前提出的活性位点残基位于平的溶剂接触表面上(PDB ID2rio)。
非对称单元中14个Ire1单体的所有部分通过定义Ire1KR32寡聚物的非晶体学对称相关联，但是HLE的α3′-α4环的独特性在于其在寡聚物中采取两种构象(图6D)。对于非对称单元中的大部分Ire1KR32单体来说，观察到了HLE的环的“开放”构象(图6D，上图)。对于一些单体，晶格中螺旋杆彼此间的堆积不能容纳开放构象。对于这些单体，建立了替代的“封闭”构象模型(图6D，下图)。只有在HLE环的开放状态，RNA底物才能够接触Ire1RNA酶的推定活性位点残基。在“封闭”构象中，阻止底物接近活性位点，尤其是Y1043(图6D)。这些结果表明界面IF2通过定位HLE和组装活性位点而在活化RNA酶上发挥重要作用。
寡聚化对RNA酶活化的独立贡献来自于寡聚物中各RNA酶活性位点周围产生的大分子表面(图4A)。这种排列为底物mRNA形成广泛的相互作用表面，这对于单体或二聚体是不可能的。这解释了下述发现，仅有形成寡聚物的Ire1KR32可以比茎环HP21更快地切割XBP1mRNA(图2D，图6C)。形成二聚体的构建物(Ire1KR和Ire1KR24)在XBP1mRNA和HP21之间没有区别(图2D)。因此，寡聚化和XBP1/HAC1mRNA识别有关，Ire1寡聚物和mRNA之间的延长的接触在Ire1功能中作用突出。
Ire1活化在其发现之后很快就显现出关键特征，包括受体的自缔合、反式自磷酸化和作为RNA酶活化的重要辅因子结合ADP(图1A)。此处出现的寡聚化结构表明这些事件的机械性作用。活化Ire1RNA酶的主要事件是错误折叠蛋白与LD结合所诱导的胞浆结构域自组装成螺旋纳米杆结构(图6E)。分离的Ire1胞浆片段独立地自缔合，表明腔内结构域的作用是调节构建成激酶-RNA酶模块的自缔合平衡。反式自磷酸化和辅因子结合通过将平衡向自组装移动来辅助Ire1活化，但这两个事件对于自组装和RNA酶活化来说都不是必要的。本文的研究显示Ire1KR32在没有辅因子(图1D)或磷酸化(图10、图13A、图13B)时可以寡聚化并活化。
现在清楚了反式自磷酸化和ADP结合的作用以及时间上的分离。未磷酸化的Ire1的寡聚化使激酶处于反式自磷酸化的位置并通过界面IF3稳定开放构象中的活化环(图9C)。ATP结合至开放的激酶，活化环被磷酸化并以开放状态稳定于界面IF3。这为寡聚物的组装提供了正反馈(图6E)。辅因子的结合仅发生于Ire1激酶的开放状态，即在寡聚物中而非单体中。辅因子与开放状态的优先结合使得平衡进一步向寡聚化移动，并为活化转变提供额外的独立的正调节水平(图6E)。
出现了一个值得注意的UPR诱导的Ire1病灶1的结构模型。LD和胞质结构域以一定角度形成的寡聚物的排列(图14A)在ER膜两侧都给出相似的单体周期性。所得交联网在二维水平上为超分子Ire1病灶的形成和不受限的生长提供了平台。将LD和激酶-RNA酶结构域连接至跨膜区的接头的长度足以容纳这种排列。对于这种组装可以预期对输入信号和惯性(开启和关闭UPR的时间延长)的非线性应答，并可能具有有待探索的生物作用。
本发明还涉及以下实施方案。
1.具有下式的化合物：
其中，R1、R21和R22独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地是氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
X是NH或S；并且
x和z独立地是0至5的整数。
2.具有下式的化合物：
其中，R1、R21和R36独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地是氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
y是0至4的整数；以及
z是0至5的整数。
3.实施方案2的化合物，其中R36是取代或未取代的C1-C10烃基。
4.实施方案3的化合物，其中R36是甲基。
5.实施方案2的化合物，其中两个相邻的R36取代基共同形成取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
6.实施方案5的化合物，其具有下式：
7.实施方案1-6中任一项的化合物，其中R1是取代或未取代的C1-C10烃基、取代或未取代的2至10元杂烃基、取代或未取代的C3-C8环烃基、取代或未取代的3至8元杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。
8.实施方案7的化合物，其中R1是取代或未取代的C1-C5烃基、取代或未取代的2至5元杂烃基、取代或未取代的C3-C6环烃基、取代或未取代的5或6元杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。
9.实施方案8的化合物，其中R1是未取代的C3-C6环烃基。
10.实施方案9的化合物，其中R1是环丙基。
11.实施方案8的化合物，其中R1是取代或未取代的噻吩基。
12.实施方案1-11中任一项的化合物，其中R21是以R25取代或未取代的C1-C10烃基或者以R25取代或未取代的杂烃基，R25是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、-NO、-SH、-NO2、氧代、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、或者未取代的杂芳基。
13.实施方案12的化合物，其中R21是以R25取代或未取代的C1-C4烃基或者以R25取代或未取代的2-4元杂烃基，R25是-CN、-CF3、-OH或氧代。
14.实施方案13的化合物，其中R21是-CH2-CN、-CH2CH2OH或-NH-CO-CH3。
15.具有下式的化合物：
其中，R1是氢、氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
L是键、取代或未取代的亚烃基、取代或未取代的杂亚烃基、-NH-C(O)-或者-NH-C(O)-NH-；
A是芳基或杂芳基；
R37是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；和
w是0至5的整数。
16.实施方案15的化合物，其中R1是取代或未取代的C1-C5烃基、取代或未取代的2至5元杂烃基、取代或未取代的C3-C6环烃基、取代或未取代的5或6元杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。
17.实施方案16的化合物，其中R1是环丙基。
18.实施方案15-17中任一项的化合物，其中L是取代或未取代的亚烃基或者取代或未取代的杂亚烃基。
19.实施方案15-17中任一项的化合物，其中L是-NH-C(O)-或-NH-C(O)-NH-。
20.实施方案15-19中任一项的化合物，其中A是芳基。
21.实施方案20的化合物，其中A是苯基。
22.实施方案15-21中任一项的化合物，其中w是0或1。
23.实施方案15-22中任一项的化合物，其中R37是取代或未取代的C1-C4烃基。
24.实施方案23的所述化合物，其中R37是-CF3。
25.实施方案1、2和15中任一项的化合物，其具有下式之一：
26.实施方案25的化合物，其具有下式：
27.实施方案1-26中任一项的化合物，其中所述化合物活化Ire1的活性。
28.实施方案1-26中任一项的化合物，其中所述化合物抑制Ire1的活性。
29.一种药物组合物，其包含实施方案1-26中任一项的化合物和可药用赋形剂。
30.调节细胞中Ire1活性的方法，其包括使有效量的实施方案1-26中任一项的化合物与所述细胞相接触。
31.在有此治疗需要的对象中治疗由异常Ire1活性引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的实施方案1-26中任一项的化合物。
32.实施方案31的方法，其中所述异常Ire1活性是与Ire1活性的正常水平相比Ire1活性的量提高。
33.实施方案32的方法，其中所述疾病是癌症、炎性疾病或自身免疫病。
34.实施方案31的方法，其中所述异常Ire1活性是与Ire1活性的正常水平相比Ire1活性的量下降。
35.实施方案34的方法，其中所述疾病是囊性纤维化、视网膜色素变性、糖尿病或神经退行性疾病。
36.调节细胞中Ire1活性的方法，包括使有效量的下式化合物与所述细胞相接触：
其中，R5、R6、R7和R8独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR15R16、-OR17、-COOR18、-SR19、-COR20、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基，其中R6和R7任选地相结合形成取代或未取代的杂环烃基或者取代或未取代的杂芳基；以及
R15、R16、R17、R18、R19和R20独立地是取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
37.实施方案36的方法，其中所述化合物具有如下式：
其中，R1是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地是氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R5是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR15R16、-OR17、-COOR18、-SR19、-COR20、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；以及
R15、R16、R17、R18、R19和R20独立地是取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
38.实施方案36或37之一的方法，其中R5是取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
39.实施方案38的方法，其中R5是取代或未取代的杂芳基。
40.实施方案38的方法，其中R5是取代或未取代的吡唑基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的咪唑基、取代或未取代的异噁唑基、取代或未取代的噁二唑基、取代或未取代的噁唑基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的哒嗪基、取代或未取代的噻唑基、取代或未取代的三唑基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的二氢噻吩并吡唑基、取代或未取代的硫茚基、取代或未取代的咔唑基、取代或未取代的苯并咪唑基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的苯并呋喃基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的喹唑啉基、取代或未取代的苯并三唑基、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的苯并噁唑基、取代或未取代的苯并咪唑基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的异吲哚基、取代或未取代的吖啶基、取代或未取代的苯并异噁唑基、或者取代或未取代的二甲基乙内酰脲。
41.实施方案40的方法，其中R5是取代或未取代的嘧啶基、或者取代或未取代的喹唑啉基。
42.实施方案36-41中任一项的方法，其中调节Ire1活性包括在有此治疗需要的对象中治疗由异常Ire1活性引起的疾病。
43.实施方案42的方法，其中所述异常Ire1活性是与Ire1活性的正常水平相比Ire1活性的量提高。
44.实施方案42的方法，其中所述异常Ire1活性是与Ire1活性的正常水平相比Ire1活性的量降低。
45.实施方案42的方法，其中所述疾病是囊性纤维化、视网膜色素变性、糖尿病或神经退行性疾病。
46.实施方案42的方法，其中所述疾病是癌症。
47.实施方案42的方法，其中所述疾病是选自下列的神经退行性疾病：亚历山大病、阿尔珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、共济失调毛细血管扩张症、巴廷病(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳范病、科克因综合征、皮质基底节变性、克-雅氏病、亨廷顿病、HIV相关痴呆症、肯尼迪病、克拉伯病、路易体痴呆、神经系统亚速尔病(3型脊髓小脑共济失调)、多发性硬化症、多系统萎缩、嗜睡病、神经疏螺旋体病、帕金森病、佩-梅病、匹克氏病、原发性侧索硬化症、朊病毒病、雷夫叙姆病、桑德霍夫病、希尔德病、恶性贫血继发的脊髓亚急性联合变性、精神分裂症、脊髓小脑共济失调(具有不同特征的多种类型)、脊髓性肌萎缩、斯-理-奥病、或脊髓痨。
48.检测测试化合物的Ire1调节活性的方法，所述方法包括：
(i)使测试化合物与溶液中多个非寡聚化Ire1蛋白相接触；
(ii)检测所述非寡聚化Ire1蛋白的寡聚化，从而鉴定所述测试化合物的Ire1调节活性。
49.实施方案48的方法，其中通过检测所述溶液中透明度的降低实现所述寡聚化检测。
50.实施方案48的方法，其中用供体荧光团标记所述多个Ire1蛋白的第一部分，用受体荧光团标记所述多个Ire1蛋白的第二部分，其中通过检测荧光信号的变化实现所述寡聚化检测。
51.在细胞中提高Ire1活性的方法，包括使有效量的舒尼替尼与所述细胞相接触。
52.在有此治疗需要的对象中治疗Ire1活性缺乏引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的舒尼替尼。
53.实施方案52的方法，其中所述疾病是囊性纤维化、糖尿病或神经退行性疾病。
54.实施方案52的所述方法，其中所述疾病是选自如下的神经退行性疾病：亚历山大病、阿尔珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、共济失调毛细血管扩张症、巴廷病(也作Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳范病、科克因综合征、皮质基底节变性、克-雅氏病、亨廷顿病、HIV相关痴呆症、肯尼迪病、克拉伯病、路易体痴呆、神经系统亚速尔病(3型脊髓小脑共济失调)、多发性硬化症、多系统萎缩、嗜睡病、神经疏螺旋体病、帕金森病、佩-梅病、匹克氏病、原发性侧索硬化症、朊病毒病、雷夫叙姆病、桑德霍夫病、希尔德病、恶性贫血继发的脊髓亚急性联合变性、精神分裂症、脊髓小脑共济失调(具有不同特征的多种类型)、脊髓性肌萎缩、斯-理-奥病、或脊髓痨。

Claims (16)

1.具有下式的化合物：
其中，R1、R21和R22独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地是氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
X是NH或S；并且
x和z独立地是0至5的整数。
2.具有下式的化合物：
其中，R1、R21和R36独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地是氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
y是0至4的整数；以及
z是0至5的整数。
3.权利要求2的化合物，其中两个相邻的R36取代基共同形成取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
4.具有下式的化合物：
其中，R1是氢、氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
L是键、取代或未取代的亚烃基、取代或未取代的杂亚烃基、-NH-C(O)-或者-NH-C(O)-NH-；
A是芳基或杂芳基；
R37是卤素、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；和
w是0至5的整数。
5.权利要求1、2和4中任一项的化合物，其具有下式之一：
6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中所述化合物活化Ire1的活性。
7.权利要求1-5中任一项的化合物，其中所述化合物抑制Ire1的活性。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的化合物和可药用赋形剂。
9.调节细胞中Ire1活性的方法，其包括使有效量的权利要求1-5中任一项的化合物与所述细胞相接触。
10.在有此治疗需要的对象中治疗由异常Ire1活性引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1-5中任一项的化合物。
11.调节细胞中Ire1活性的方法，包括使有效量的下式化合物与所述细胞相接触：
其中，R5、R6、R7和R8独立地是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR15R16、-OR17、-COOR18、-SR19、-COR20、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基，其中R6和R7任选地相结合形成取代或未取代的杂环烃基或者取代或未取代的杂芳基；以及
R15、R16、R17、R18、R19和R20独立地是取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
12.权利要求11的方法，其中所述化合物具有如下式：
其中，R1是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR9R10、-OR11、-COOR12、-SR13、-COR14、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R9、R10、R11、R12、R13和R14独立地是氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R5是氢、卤素、-CN、-NO、-NO2、-NR15R16、-OR17、-COOR18、-SR19、-COR20、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；以及
R15、R16、R17、R18、R19和R20独立地是取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
13.权利要求11-12中任一项的方法，其中调节Ire1活性包括在有此治疗需要的对象中治疗由异常Ire1活性引起的疾病。
14.检测测试化合物的Ire1调节活性的方法，所述方法包括：
(i)使测试化合物与溶液中多个非寡聚化Ire1蛋白相接触；
(ii)检测所述非寡聚化Ire1蛋白的寡聚化，从而鉴定所述测试化合物的Ire1调节活性。
15.在细胞中提高Ire1活性的方法，包括使有效量的舒尼替尼与所述细胞相接触。
16.在有此治疗需要的对象中治疗Ire1活性缺乏引起的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的舒尼替尼。
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