JP6412968B2 - Ire1、src、及びabl活性を調節するための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2008年9月15日出願の米国仮特許出願第61/097,173号(本明細書中、その全
体が参照として含まれる)に基づく優先権を主張する。
本発明は、国立衛生研究所のグラント(GM60641)及び国防総省グラント第W81XWH-06-1-0383号の援助を受けた。政府は本発明に一定の権利を有する。
入る。タンパク質折り畳みの品質は、誤って折り畳まれた(misfolded)タンパク質によっ
て活性化される、ER膜に内在するキナーゼ-リボヌクレアーゼIre1によってモニターされ
る。Ire1はmRNAをコードする転写因子の非スプライスソーム細胞質スプライシング反応を開始し、小胞体ストレス応答(unfolded protein response:UPR)と呼ばれるゲノムスケールの転写プログラムを開始する。スプライスされたmRNAの翻訳により、タンパク質合成に関与する遺伝子を活性化し、ER中で折り畳まれているタンパク質を修復する、酵母中ではHac1(Cox,J.S.ら、Cell 87巻:391-404頁(1996年))(非特許文献1)及び後生動物ではXbp1(Yoshida,H.ら、Cell 107巻:881-91(2001年))(非特許文献2)と呼ばれるUPR-特異的転写因子を産生する。このUPRは癌(Koong,A.C.ら、Cancer Biol Ther 5巻(2006年)(非特許文献3);Ma,Y.ら、Nat Rev Cancer 4巻:966-77頁(2004年)(非特許文献4))、アルツハイマー病(Kudo,T.ら、Ann N Y Acad Sci 977巻:349-55頁(2002年)(非
特許文献5))、種々の他の細胞異常(Zheng,Yら、J Microbiol 43巻:529-36頁(2005年)(非特許文献6);Naidoo,N.ら、J Nuerochem 92巻:1150-7(2005年)(非特許文献7)
;Doody,G.M.ら、Eur J Immunol 36巻:1572-82頁(2006年)(非特許文献8))で活性化し、このことは異常Ire1活性化と細胞機能障害との間の多くの可能性を示唆している。
センサーとして機能し、ER膜の面でIre1の側面自己会合(lateral self-association)を
促進する(図1A)。特に精製されたLDは、二つのはっきりした結晶境界面をもつオリゴマ
ーとして結晶化する。両方の境界面上のIre1表面残基はインビボでIre1活性化に寄与する(Credle,J.J.ら、Proc Natl Acad Sci USA、102巻:18773-84頁(2005年))(非特許文献9)。この知見は、UPRの間にIre1のオリゴマー化が早期に観察されることを説明しており(Shamu,C.E.ら、Embo J 15:3028-39頁(1996年))(非特許文献10)、ライフセルイメ
ージング(life-cell imaging)によって知見され得るUPR-誘導フォーカスにおけるIre1組織化(Ire1 organization)の最初の構造的考察を提供する(Kimata,Y.ら、J Cell Biol
179巻:75-86(1997年))(非特許文献11)。LDのオリゴマー化はER膜の細胞質側のIre1
のキナーゼ-RNaseドメインの局所濃度を増加して、二量体化により酵素ドメインを活性化することが提案されてきた(Credle,J.J.ら、Proc Natl Acad Sci USA、102巻:18773-84頁(2005年))(非特許文献12)。活性化のこのメカニズムは、多くのよく解明された
細胞表面シグナル伝達受容体のものと似ている。たとえば、上皮成長因子受容体(EGFR)のリガンド誘導二量体化(Zhang,X.ら、Cell 125巻:1137-49頁(2006年))(非特許文献1
3)は、キナーゼのN-及びC-ローブの開口と、よく保存されたαCへリックスと活性化ループの再配列とを含む構造変化を誘発することによってキナーゼドメインを活性化する(Zhang,Xら、Cell 125巻:1137-49頁(2006年))(非特許文献13)。自己会合に加えて、Ire1の活性化は、自己リン酸化及び補助因子としてADPの結合を包含する。これらの事象はい
ずれも、RNaseを活性化させる構造変化を促進するものと考えられている(Papa,F.R.ら
、Science 302巻:1533-7頁(2003年))(非特許文献14);Gonzalez,T.N.ら、Methods Mol Biol 160巻:25-36頁(2001年))(非特許文献15)。
:89-100頁(2008年))(非特許文献16)。この構造から、二つの独立した活性化部位をも
つRNase二量体にコンパクトに結合したキナーゼドメインの背合わせ配置(back-to-back arrangement)の2回対称二量体(two-fold symmetric dimer)が明らかになった。この構造は、活性化ループ、ループと続くキナーゼドメインのαDへリックス、及びRNaseドメインの機能的に重要で外見上動的ループを除いてよく整列している。二量体でのキナーゼの背合わせ配置は予想外のことであった。というのも、この背合わせ配置は、二量体中のつながっている分子の活性部位から活性化ループ中のリン酸化部位を43〜48Å離して位置づけているからである。この配置は、インビボ(Shamu,C.E.ら、Embo J 16巻:3028-39頁(1996年))(非特許文献17)及びインビトロ(Lee,L.P.ら、Cell 132巻:89-100頁(2008
年))(非特許文献16)で知見されるIre1のトランス-自己リン酸化に有効であるようには
みえない。RNaseドメインの二量体化は、HAC1/XBP1 mRNAにスプライス部位を含む保存タンデムステムループの認識を可能にすると提案された(Lee,L.P.ら、Cell 132巻:89-100頁(2008年))(非特許文献16)(図1B)。
ば嚢胞性線維症では、細胞表面に示されるより多くのクロライド・チャネルを産生するためにタンパク質折り畳み能力を増加させることが有効であろう。他方、糖尿病では、膵臓細胞はUPR誘導アポトーシスがもとで死に、UPRのIre1分岐は細胞保護的であることが判明した。神経変性病及び他のタンパク質折り畳み疾患、たとえば失明に至る網膜色素変性症では、細胞はUPR誘導アポトーシスで死ぬ。同じ概念は、UPRが関与する他の多くの疾患に当てはまる。
に調節する(たとえば様々な程度に増加または減少させる)ための予想外の手段を提供する。野生型Ire1を調節し得る最初の小分子及びその作用機序を提示する。さらにIre1モジュレータの作用機序と標的を検査するための着実且つ高効率アッセイと共に、新しいモジュレータを検査するための手段を提供する。
、Ablチロシンキナーゼ(たとえば細胞中)と本明細書に記載の有効量のモジュレータとを
接触させることを含む。
本明細書中で使用した略号は、化学及び生物学の分野の通常の意味をもつ。
とは、一般に8個以下の炭素原子をもつ短鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
フルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」なる用語は、N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を含むアリール基(または環)をさし、ここで窒素及び硫黄原子は任意
に酸化されていてもよく、(単数または複数の)窒素原子は任意に四級化されていてもよい。ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残余に結合することができる。アリール及びヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソキサゾリル、4-イソキサゾリル、5-イソキサ
ゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル及び6-キノリルが挙げられる。上記アリール及びヘテロアリール環系のそれぞれの置換基は、以下に記載の許容可能な置換基の群から選択される。「アリーレン」及び「ヘテロアリーレン」は、それぞれアリール及びヘテロアリールから誘導される二価基をさす。「融合環」は、少なくとも1つの結合と二つの原子を共通してもつ二つ以上の環の環系をさす。従って「融合環ア
リール」及び「融合環ヘテロアリール」は、別の環と共通して少なくとも1個の結合と2個の原子を共有する、それぞれ少なくとも1個のアリール及びヘテロアリールをもつ環系を
さす。
アリールチオキシ、アリールアルキル)に「アリール」なる用語は、上記定義のアリール
及びヘテロアリール環の両方を包含する。従って、「アリールアルキル」なる用語は、アリール基が、炭素原子(たとえばメチレン基)が酸素原子によって置換されたアルキル基(
たとえばフェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど)などのアルキル基(たとえばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど)に結合して
いる基を包含するものとする。
’は上記定義のアルキル基である}をもつ部分を意味する。R’は、指定数の炭素をもつ
ことができる(たとえば、「C1-C4アルキルスルホニル」)。
ロゲン、-OR’、-NR’R”、-SR’、-ハロゲン、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)=NR””、-NR-C(NR’R”)=NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN及び-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、フルオロ(C1-C4)アルコキシ、及びフルオロ(C1-C4)アルキルから選択され、ここでR’、R”、R”’及びR””は
好ましくはそれぞれ独立して、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール並びに置換若しくは非置換ヘテロアリール基から選択される。本発明の化合物が二つ以上のR基を含むとき、たとえばR基はそれぞれが独立してR’、R”、R”’及びR””基の二つ以上が存在するときにそれぞれR’、R”、R”’
及びR””基であるように選択される。
あり、qは0〜3の整数である}の環を形成していてもよい。あるいはアリールまたはヘテ
ロアリール環の隣接する原子上の置換基のうち二つは、任意に、式:-A-(CH2)r-B-{式中、A及びBは独立して-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-または一
重結合であり、rは1〜4の整数である}の置換基で置換されていてもよい。このようにし
て形成した新しい環の一重結合の一つは、任意に二重結合により置換されていてもよい。あるいはアリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうち二つは、任意に、式:-(CRR’)s-X’-(C”R”’)d-{式中、s及びdは独立して0〜3の整数であり、X’
は-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-または-S(O)2NR’-である}の置換基で置換されていてもよい。置換基R、R’、R”及びR”’は、好ましくは独立して水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、及び置換若しくは非置換ヘテロアリールから選択される。
(A)-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換へ
テロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、並びに
(B)以下のものから選択される少なくとも一つの置換基で置換された、アルキル、ヘテ
ロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール:
(i)オキソ、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、及び
(ii)以下のものから選択される少なくとも一つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール:
(a)オキソ、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、並びに
(b)オキソ、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、及び非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも一つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール。
たは「サイズが限定された置換基(size-limited substituent group)とは、「置換基」に関して先に記載された全ての置換基から選択される基を意味し、ここで各置換若しくは非置換アルキルは置換または非置換C1-C20-アルキルであり、各置換若しくは非置換へテ
ロアルキルは置換若しくは非置換2〜20員のヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置
換シクロアルキルは置換若しくは非置換C4-C8シクロアルキルであり、及び各置換若しく
は非置換ヘテロシクロアルキルは置換若しくは非置換の4〜8員のヘテロシクロアルキルである。
味し、ここで各置換若しくは非置換アルキルは置換または非置換C1-C8-アルキルであり、各置換若しくは非置換へテロアルキルは置換若しくは非置換2〜8員のヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは置換若しくは非置換C3-C7シクロアルキルで
あり、及び各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは置換若しくは非置換の3〜7員のヘテロシクロアルキルである。
。アルギン酸塩などのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる(たとえばBergeら、“Pharmaceutical Salts”、Journal of Pharmaceutical Science、1977年、66巻、1〜19頁参照)。本発明の特定の具体的な化合物は、
化合物が塩基または酸付加塩のいずれかに転換され得る塩基性及び酸性官能基のいずれをも含む。
で公知であるものを含まない。
となかろうと、本発明の化合物の全同位体変種は、本発明の範囲内に含まれる。
に本明細書中で使用される「ひとつの〜で置換された」なる用語は、指名された置換基の任意の一つ以上または全てで置換され得る特定の基を意味する。たとえば、アルキルまたはヘテロアリール基などの基が「非置換C1-C20アルキル、または非置換2〜20員のヘテロ
アルキル」で置換される場合、この基は一つ以上の非置換C1-C20アルキル、及び/または
一つ以上の非置換2〜20員のヘテロアルキルを含むことができる。
ラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも本定義に含まれる。遺伝子によりコードされていないアミノ酸も本発明で使用することができる。さらに、反応基を含むよう修飾したアミノ酸も本発明で使用できる。本発明で使用される全てのアミノ酸は、D-またはL-異性体のいずれかである。L-異性体が一般的に好ましい。さらに本発明では他のペプチド模倣薬も有用である。一般的な評論に関しては、Spatola,A.F.のCHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS,PEPTIDES AND PROTEINS、B.Weinstein編、Marcel Dekker、ニューヨーク、267頁(1983年)を参照されたい。従って、Ire1タンパク質(本明細書
中、簡単に「Ire1」とも称される)は、組み換えIre1タンパク質並びに同一Ire1タンパク
質のコピーまたは種々の供給源(たとえば、ヒトIre1、マウスIre1、酵母Ire1)由来のバージョンを包含する。Ire1タンパク質がオリゴマー化される場合には、オリゴマーを形成するIre1タンパク質は同一または異なる供給源由来であってもよい。
本明細書では、式:
くは非置換へテロアルキル、R26-置換若しくは非置換シクロアルキル、R26-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R26-置換若しくは非置換アリール、またはR26-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R26は独立して、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R27-置換若しくは非置換アルキル、R27-置換若しくは非置換へテロアルキル、R27-置換若しくは非置換シクロアルキル、R27-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R27-置換若しくは非置換アリール、またはR27-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。
びR7は結合してR28-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルまたはR28-置換若しくは非置換ヘテロアリールを形成する。R28は独立してハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2
、-COOH、R29-置換若しくは非置換アルキル、R29-置換若しくは非置換へテロアルキル、R29-置換若しくは非置換シクロアルキル、R29-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル
、R29-置換若しくは非置換アリール、またはR29-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。
非置換チアナフテニル、置換若しくは非置換カルバゾリル、置換若しくは非置換ベンズイミダゾリル、置換若しくは非置換ベンゾチエニル、置換若しくは非置換ベンゾフラニル、置換若しくは非置換インドリル、置換若しくは非置換キノリニル、置換若しくは非置換キナゾリニル、置換若しくは非置換ベンゾトリアゾリル、置換若しくは非置換ベンゾチアゾリル、置換若しくは非置換ベンゾオキサゾリル、置換若しくは非置換ベンズイミダゾリル、置換若しくは非置換イソキノリニル、置換若しくは非置換イソインドリル、置換若しくは非置換アクリジニル、置換若しくは非置換ベンゾイサゾリル、または置換若しくは非置換ジメチルヒダントインである。ある態様では、R5は5-員または6-員のR26-置換若しくは非置換の窒素含有ヘテロアリールである。ある態様では、R5はR26-置換若しくは非置換ピリミジル、またはR26-置換若しくは非置換キナゾリニルである。
は、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R33-置換若しくは非置換アルキル
、R33-置換若しくは非置換へテロアルキル、R33-置換若しくは非置換シクロアルキル、R33-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R33-置換若しくは非置換アリール、またはR33-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。
またはC1-C4-置換チエニルである。
ル、R34-置換若しくは非置換へテロアルキル、R34-置換若しくは非置換シクロアルキル、R34-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R34-置換若しくは非置換アリール、またはR34-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R34は独立してハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R35-置換若しくは非置換アルキル、R35-置換若しくは非置換へテロアルキル、R35-置換若しくは非置換シクロアルキル、R35-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R35-置換若しくは非置換アリール、またはR35-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。
ル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。
、-SR13、-COR14、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、
置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。
ある。
ル、置換若しくは非置換C3-C8シクロアルキル、置換若しくは非置換3〜8員のヘテロシク
ロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリールでありえる。
ロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、-SH、-NO2、オキソ、-NHR4、R4-置換若しくは非置換アルキル、R4-置換若しくは非置換へテロアルキル、R4-置換若しくは非置換シクロアルキル、R4-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R4-置換若しくは非置換アリール、またはR4-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R4は、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、-SH、-NO2、オキソ、非置換アルキル、非置換へテロアル
キル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。
、置換若しくは非置換ベンズイミダゾリル、置換若しくは非置換ベンゾチエニル、置換若しくは非置換ベンゾフラニル、置換若しくは非置換インドリル、置換若しくは非置換キノリニル、置換若しくは非置換ベンゾトリアゾリル、置換若しくは非置換ベンゾチアゾリル、置換若しくは非置換ベンゾオキサゾリル、置換若しくは非置換ベンズイミダゾリル、置換若しくは非置換イソキノリニル、置換若しくは非置換イソインドリル、置換若しくは非置換アクリジニル、置換若しくは非置換ベンゾイサゾリル、または置換若しくは非置換ジ
メチルヒダントインである。R2は置換若しくは非置換フェニル、または置換若しくは非置換ベンズイミダゾリルであってもよい。別の態様では、R2は非置換フェニル、または非置換ベンズイミダゾリルであってもよい。ある態様では、R2は置換若しくは非置換の融合環アリール、または置換若しくは非置換の融合環ヘテロアリール、たとえば置換若しくは非置換ベンズイミダゾリルまたは置換若しくは非置換ベンゾチアゾリルであってもよい。
置換若しくは非置換へテロアルキル(たとえば2〜10員)、R25-置換若しくは非置換シクロ
アルキル、R25-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R25-置換若しくは非置換アリール、またはR25-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。
ある。
ロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。
、R25-置換若しくは非置換アルキルC1-C4アルキル、またはR25-置換若しくは非置換2〜4
員へテロアルキルである。ある態様では、R25は、-CN、-CF3、-OHまたはオキソである。
ある態様では、R21は-CH2-CNである。他の態様では、R21は-CH2CH2OHである。他の態様で
は、R21は-NH-CO-CH3である。
置換イミダゾリルを形成する。
、-COR14、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R9、R10、R11、R12、R13及びR14は、独立して式IIの記載において定義されたとおりである。ある態様では、R35は置換若しくは非置換C1-C10アルキルである。一態様において、R36は非置換C1-C4アルキル、たとえばメチルである。
ロアルキレン、-NH-C(O)-、または-NH-C(O)-NH-である。ある態様では、Lは結合、R38-置換若しくは非置換アルキレンまたはR38-置換若しくは非置換ヘテロアルキレンである。R38は、ハロゲン、オキソ、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、R39-置換若しくは非置換アルキル、R39-置換若しくは非置換へテロアルキル、R39-置換若しくは非置換シクロアルキル、R39-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R39-置換若しくは非置換アリール、またはR39-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R39は、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。ある態様では、LはR38-置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、ここでR38はオキソである。ある態様では、Lは-NH-C(O)-または-NH-C(O)-NH-である。
へテロアルキル、R40-置換若しくは非置換シクロアルキル、R40-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R40-置換若しくは非置換アリール、またはR40-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R40は、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。一態様において、R37は、置換若
しくは非置換C1-C4アルキルである。一態様において、R37は-CF3である。
るいは、これらの基の少なくとも一つまたは全てが少なくとも一つの低級の置換基(lower
substituent group)により置換されている。
若しくは非置換C3-C8シクロアルキルであり、及び各置換若しくは非置換ヘテロシクロア
ルキルは、置換若しくは非置換3〜8員のヘテロシクロアルキルである。
であり、各置換若しくは非置換へテロアルキレンは、置換若しくは非置換2〜8員のヘテロアルキレンであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは、置換若しくは非置換C3-C7(たとえばC5-C7)シクロアルキルであり、及び各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは、置換若しくは非置換3〜7(たとえば5〜7)員のヘテロシクロアルキルである。
を示す。別の態様では、本化合物は、たとえば化合物APY69、APY24、APY76、APY83、APY65、APY84及びAPY82はIre1の顕著なインビボ活性化を示す。さらに別の態様では、本化合
物は、たとえば化合物APY84、APY33、APY81、APY80、APY79及びAPY86はIre1の顕著な阻害を示す。
別の側面では、細胞でのIre1活性を調節する方法を提供する。本方法は、細胞と有効量の上記Ire1モジュレータ(たとえば式I〜VIIIの化合物)または有効量のスニチニブとを接
触させることを含む。ある態様では、細胞はヒト細胞などの哺乳細胞である。細胞はインビトロに単離されるか、インビトロ組織の一部を形成するか、または有機体の一部を形成してもよい。
接または間接的に影響を与えることを含む。言い換えれば、Ire1の機能または効果は、モジュレータが存在しない場合のIre1の機能または効果と比較して変更される。
療的有効量のスニチニブを被験者に投与することを含む。
胞増殖が過剰量となり、これにより病態を生じる。
シェーグレン・バッテン病としても公知)、ウシ海綿状脳症(BSE)、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、HIVに
伴う認知症、ケネディ病、クラッベ病、レヴィー小体認知症、マシャド・ジョセフ病(脊
髄小脳失調タイプ3)、多発性硬化症、多系統萎縮症、ナルコプシー、神経ボレリア症、
パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性脊髄連合変性症、統合失調症、脊髄小脳失調(種々の特徴をもつ複数の型)、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルスゼフスキー病、または脊髄癆が挙げられる。
甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病及び関節リウマチが挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、疾患はXBP1-連鎖クローン病である。
ことができる。従って、Srcチロシンキナーゼの活性を調節する方法を提供する。本方法
は、Srcチロシンキナーゼと、有効量の上記モジュレータ(たとえば式I〜VIIIの化合物)とを接触させることを含む。
調節することができる。従って、Ablチロシンキナーゼの活性を調節する方法を提供する
。本方法は、Ablチロシンキナーゼと、有効量の上記モジュレータ(たとえば式I〜VIIIの
化合物)とを接触させることを含む。
Ire1活性の調節は、溶液中で試験化合物とIre1タンパク質とを接触させることにより特定することができる。
パク質)とは、二つ以上のIre1タンパク質が一緒に非共有結合することをさす。ある態様
では、オリゴマー化は2を超えるIre1タンパク質が一緒に非共有結合することをさす。ある態様では、オリゴマー化は、約3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100個のIre1タンパク質または少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10、20
、30、40、50、60、70、80、90若しくは100個のIre1タンパク質が一緒に非共有結合する
ことである。他の態様では、オリゴマー化は多数のIre1タンパク質が一緒に非共有結合することである。Ire1タンパク質のオリゴマー化は、以下の実施例区分に詳細が記載される。非オリゴマー化Ire1タンパク質は、オリゴマー化していない複数のIre1タンパク質をさす。
散乱の増加)を検出することにより実施される。あるいは、複数のIre1タンパク質の第一
の部分をドナー蛍光色素団(fluorophore)でラベルし、前記複数のIre1タンパク質の第二
の部分をアクセプタ蛍光色素団(たとえば消光剤)でラベルする。オリゴマー化検出は、蛍光シグナルにおける変化を検出することにより実施する。同一方法を使用して、複数の非オリゴマー化Ire1タンパク質を形成する複数のオリゴマー化Ire1タンパク質の分離を検出することができる。オリゴマー化は、放射能でラベル化された、または蛍光ラベルされたRNAを使用するIre1 RNaseの酵素活性を測定することによっても検出することができる。Ire1のRNA切断活性は、試験化合物によって生じたオリゴマー化時に上昇するか、または
脱重合(de-oligomerization)時に減少する。
に寄与する条件下で、Ire1の酵素活性(たとえばRNaseまたはキナーゼ)を、RNA基質を使用してモニターすることにより検出する。全酵素速度は、共同活性化プロフィール(cooperation activation profile)の存在により検証することができる。たとえば、Hill係数nは、1、2、3、4、5、6、7、8、10以上を超えることができる(図1を参照されたい)。
的に(non-competitively)、非競争的に(uncompetitively)または混合モードで作用することができる。
により検出できる。RNA切断アッセイでは、たとえば放射能でラベルされたRNA、蛍光ラベルされたRNA、ラベル化されていないRNA、または他の手段によりラベル化されたRNAを使
用する。あるいは阻害または活性化は、Ire1キナーゼ活性アッセイを使用して測定できる。あるいはIre1の阻害または活性化は、タンパク質-タンパク質またはタンパク質-リガンド相互作用を検出する動的光散乱、分析超遠心、等温熱量計などの生物物理学的方法を使用して測定できる。Ire1の阻害または活性化は、化合物と細胞若しくは動物とを接触させることに基づく任意の好適な細胞ベースアッセイを使用し、そしてIre1のキナーゼ活性をモニター、Ire1のRNase活性をモニター、またはIre1活性化の下流効果をモニターするこ
とによって測定することもできる。Ire1活性化の下流効果としては、スプライスされたHac1若しくはXBP1タンパク質の産生、またはこれらの二種のタンパク質の転写標的などの変化、またはIre1のキナーゼ活性により誘導された下流変化が挙げられる。良好なモジュレータは、Ire1のRNase活性、Ire1のキナーゼ活性、またはIre1のオリゴマー状態に作用す
る。
別の側面では、本発明は医薬的に許容可能なキャリヤと組み合わせた本発明の化合物(
即ちIre1モジュレータ)を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書中に開示
された阻害剤の光学異性体、ジアステレオマー、または医薬的に許容可能な塩を含む。医薬組成物に含まれる化合物は、上記のようにキャリヤ部分に共有結合していてもよい。あるいは、医薬組成物に含まれる化合物は、キャリヤ部分に共有結合していない。
とができる。
腸内または腹腔内に)投与することができる。また本明細書に記載の化合物は、鼻腔内な
ど吸入により投与することができる。さらに本発明の化合物は、経皮投与することができる。本発明の化合物を投与するために、複数の投与経路(たとえば筋肉内、経口、経皮)を使用することも想定される。従って、本発明は医薬的に許容可能な賦形剤と一種以上の本発明の化合物とを含む医薬組成物も提供する。
グネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、スターチ、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバターなどである。
リヤにより取り囲み、これによってキャリヤと結合するカプセルを提供するキャリヤとして封入材料との活性成分との配合物(formulation)を包含するものとする。同様にカシェ
及びトローチ剤も含まれる。錠剤、粉末、カプセル、ピル、カシェ及びトローチ剤は、経口投与に適した固体剤形として使用することができる。
ングリコール溶液が挙げられる。注射剤(parenteral injection)に関しては、液体製剤
は、ポリエチレングリコール水溶液の溶液中で製造することができる。
アンプルは慣用の剤形である。本発明の化合物はリポソームに配合または、経皮ポンプ若しくはパッチを介して投与することもできる。本発明で使用するのに好適な医薬混合物は当業者に公知であり、本明細書中そのいずれの教示も参照として含まれる、Pharmaceutical Sciences(第17版、Mack Pub.Co.、Easton、PA)及びPCT国際特許出願国際公開第WO96/05309号に記載されている。
、60及び80;Pluronic F-68、F-84及びP-103;シクロデキストリン;ポリオキシル35ひ
まし油;または当業者に公知の他の物質が挙げられる。かかる共溶媒は通常、約0.01重量%〜約2重量%のレベルで使用される。
水溶液よりも粘度が高いほうが望ましいかもしれない。かかる増粘剤(viscosity building agent)としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸及びその塩、ヒアルロン酸及びその塩、上記のものの組み合わせ並びに当業者に公知の他の物質が挙げられる。かかる物質は通常、約0.01重量%〜約2重量%のレベルで使用される。上記アジュバン
トのいずれかの許容量の決定は、当業者によって容易に確定される。
。かかる成分としては、高分子量のアニオン性粘液擬態ポリマー、ゲル化多糖類及び微粉化薬物キャリヤ基質が挙げられる。これらの成分は、米国特許第4,911,920号;同第5,403,841号;同第5,212,162号;及び同第4,861,760号にその詳細が検討されている。これらの特許の全ての内容は、その全ての目的に関して本明細書中、参照として含まれる。
るなどの所望の結果を達成するのに有効量の活性成分を含む。本発明の化合物の治療的有効量の決定は、当業界、特に本明細書中の詳細な開示を考慮すると当業者の能力の範囲内である。
とえばアルツハイマー病)、併用療法の種類、治療される疾患による合併症または他の健
康に関連する問題に依存して変動し得る。他の治療計画または治療薬は本出願人の発明の方法及び化合物と併せて使用することができる。確立された用量の調節及び操作(たとえ
ば頻度及び期間)は当業者の技量の範囲内である。
。
致命的な化合物量)及びED50(母集団の50%で有効な化合物量)との比で表すことができる
。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイ及び/または動物研究から得
られた治療指数データをヒトで使用するための用量範囲の考案に使用することができる。かかる化合物の用量は好ましくは、殆どまたは全く毒性を持たないED50を含む血漿濃度範囲内にある。用量は、使用する剤形及び使用する投与経路に依存してこの範囲内を変動し得る。たとえばFinglらのIn:THE PHARMACOLOGIAL BASIS OF THERAPEUTICS,第1章、1ページ、1975年を参照されたい。正確な配合、投与経路及び用量は、化合物を使用する
特定の方法及び患者の症状を考慮して個々の医師により選択することができる。
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するためのものであり、本明細書に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
タンパク質は大腸菌で発現させ、GST-アフィニティ精製及びサイズ除外クロマトグラフィーを使用して精製した。DNAオリゴヌクレオチドはPCRで製造し、IDTから購入した。RNAオリゴヌクレオチドは、Dharmacon Inc.より購入するか、T7 RNAポリメラーゼでイン
ビトロ転写により製造した。全ての動態アッセイ及び分析超遠心は、30℃及び中性pHで実施した。回折データはビームライン8.3.1(Advanced Lignt Source,Berkeley National Laboratories)で冷凍保存された結晶から集めた。相は、PHASERでのサーチモデルとしてPDB座標2rioを使用して分子置換より決定した。最終モデルはIre1のアミノ酸665-864、892-1115を含み;N-末端の一部(641-664)及び高リン酸化ループ865-891(aF-aEF)が不規則になっている。最終解像度は3.9Åであり、R/Rfreeは良い形状で0.264/0.298であった。
実験手順の詳細な記載を以下に示す。
本発明の特定の化合物は、以下に記載のスキームを使用して合成し、必要により好適な試薬選択を実施することができる。
2,4-ジクロロピリミジン(3.2g,21.6mmol)及び5-シクロプロピル-2H-ピラゾール-3-イ
ルアミン(2.65g,21.5mmol)をTHFとH2Oの1:1混合物(140mL)中に溶解し、KOAc(30当量
,64g)で処理し、55℃で48時間保持した。層を分離し、有機層を蒸発させ、CH2Cl2(30mL)に溶解し、−20℃で3時間保持した。沈殿したピリミジノ-アミノピラゾール塩化物塩を
濾過により集めた。濾液を蒸発させ、CH2Cl2(25mL)に溶解し、−20℃でさらに3時間保持し、濾過した。合わせた固体をCHCl3:CH3OHが10:1(25mL)に溶解し、精製(CHCl3:CH3OH=100:0〜90:10)すると、ピリミジノ-アミノピラゾール中間体が得られた(収率46%,2.32g)。
ピリミジノ-アミノピラゾール一塩化物(0.2g,0.85mmol)及びp-アミノベンゾニトリル(
0.112g,0.85mmol)をBuOH(8mL)に溶解し、続いて濃HCl(0.1mL)を添加した。得られた混合物を一晩100℃に保持した。固体沈殿物を濾過により集め、BuOH(8mL)で洗浄し、真空下で乾燥すると化合物APY24が得られた(0.23g,収率86%)。
N2-(4-アミノフェニル)-N4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イル)ピリミジン-2,4-ジアミン(0.011g,0.035mmol;Shokat Lab:A.Statsyuk)のCH2Cl2(10mL)中の溶液を氷水浴中で冷却した。これに、CH2Cl2(10mL)中に希釈した3-(トリフルオロメチル)ベンゾイルクロリド(0.005mL,0.036mmol)を滴下添加した。反応物を放置して温め1時間攪拌したままにした。TLC及びLC-MSで反応が完了したことを判断するまで、反応を進行させた。反応混合物を真空下で濃縮し、50:50のH2O-CH3CN中に再び懸濁させ、CH3CN/H2O/0.1%TFA(1〜100%勾配液)中のC18カラムで精製すると、AD74が得られた。ESI-MS m/z [M+H]+、実測値480.5,計算値480.2。
N2-(4-アミノフェニル)-N4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イル)ピリミジン-2,4-ジアミン(0.022g,0.07mmol)のCH2Cl2(10mL)中の溶液を氷水浴中で冷却した。これにCH2Cl2(5mL)中に希釈した3-(トリフルオロメチル)フェニルイソシアネート(0.030mL,0.2mmol)を滴下添加した。反応物を放置して室温に温め、1時間攪拌したままにした。TLC及びLC-MSで反応が完了したことを判断するまで、反応を進行させた。反応混合物を真空下で濃縮し、50:50のH2O-CH3CN中に再び懸濁させ、CH3CN/H2O/0.1%TFA(1〜100%勾配液)中のC18カラムで精製すると、AD75が得られた。ESI-MS m/z [M+H]+、実測値495.5,計算値495.2。
N2-(3-アミノフェニル)-N4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イル)ピリミジン-2,4-ジアミン(0.014g,0.046mmol;Shokat Lat:A.Stasyuk)のCH2Cl2(10mL)中の溶液を氷
水浴中で冷却した。これにCH2Cl2(5mL)中に希釈した3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル
クロリド(0.007mL,0.046mmol)を滴下添加した。反応物を放置して室温に温め、1時間攪拌したままにした。TLC及びLC-MSで反応が完了したことを判断するまで、反応を進行させた。反応混合物を真空下で濃縮し、50:50のH2O-CH3CN中に再び懸濁させ、CH3CN/H2O/0.1%TFA(1〜100%勾配液)中のC18カラムで精製すると、AD76が得られた。ESI-MS m/z [M+H]+、実測値480.4,計算値480.2。
N2-(3-アミノフェニル)-N4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イル)ピリミジン-2,4-ジアミン(0.014g,0.046mmol)のCH2Cl2(10mL)中の溶液を氷水浴中で冷却した。これにCH2Cl2(5mL)中に希釈した3-(トリフルオロメチル)フェニルイソシアネート(0.006mL,0.046mmol)を滴下添加した。反応物を放置して室温に温め、12時間攪拌したままにした。TLC及びLC-MSで反応が完了したことを判断するまで、反応を進行させた。反応混合物を真空下
で濃縮し、50:50のH2O-CH3CN中に再び懸濁させ、CH3CN/H2O/0.1%TFA(1〜100%勾配液)中のC18カラムで精製すると、AD77が得られた。ESI-MS m/z [M+H]+、実測値495.4,計算
値495.2。
Ire1構築物の発現及び精製
Ire1発現用プラスミドは、Pfuポリメラーゼ及びIre1の細胞質ドメインをコードするpGEX-6P-2ベクターでPCRを使用して調製した(Sidrauski,C.ら、Cell 90巻:1031-9頁(1997年))。突然変異変性用のDNAプライマーは、Biochem Lab Solutions 3.5を使用して設計し、IDTより購入した。タンパク質はBL21 CodonPlus(RIPL)大腸菌細胞(Stratagene)上で発現させた。発現及び精製は先に記載のように実施した(Nock,S.ら、Methods Enzymol 342巻:3〜10頁(2001年))。バクテリアは22℃で成長させ、溶解及びEPLC緩衝液はIre1凝集を防ぐために少なくとも300mMのNaClを含んでいた。タンパク質濃度は、280nmでの
吸収ピークを使用してUVスペクトルから測定し、吸光係数(Biochem Lab Solutions 3.
5)を計算した。精製Ire1変異体は濃度10〜70mg/mlであり、クーマシーブルー染色及びFPLCトレースの定量により判断して純度99%を超えていた。
HP21 21-mer及びHAC1 28-merはDhrmacon Inc.より購入した。他のRNA基質はHAC1及
びXBP1 mRNAをコードする制限(酵素)消化プラスミドから、またはPCR-増幅産生物から調製した。長鎖RNAの予備量(preparative amount)はMegashortScript kit(Ambion)を使用して調製した。使用前に、オリゴヌクレオチドは、変性(8M変性)5〜20%ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(PAGE)で精製し、29:1架橋させ(National diagnostics)、TE緩衝液
中で溶離し、エタノール沈殿させた。5’-末端基質で32p-ラベルしたものは、NENによりT4 PNK(NEB)及びg-32pATPを使用して調製した。32p-ボデー-ラベル化基質は、a-32pUTP(NEN)の存在下、T7 RNAポリメラーゼ(Promega)で転写により調製した。32p-ラベル化基質
は、変性5〜20%PAGEにより精製し、TE中で溶離し、エタノール沈殿させた。
RNA切断反応は、20mM HEPES(pH7.5)、70mM NaCl、2mM ADP(pH7.0)、2mM Mg(OAc)2
、5mM DTT、5%グリセロール、1nM未満32p-ラベルRNA基質、及び3nM〜20μM Ire1を含
む緩衝液中、30℃で実施した。反応溶液及び緩衝液は、Biochem Lab Solutions 3.5を使用して設計した。反応は、RNA以外の全ての成分を含む予め温めておいた反応混合物9μlにRNA 1μlを添加するように調製した。通常、最初の時間点に関して5秒から開始して
、3〜10分の時間的経過を集めた。時間間隔で溶液1μlをそれぞれの反応物から取り出し
、10M尿素、0.1%SDS、0.1mM EDTA、0.05%キシレンシアノール、及び0.05%ブロモフェノールブルーを含む6μl停止溶液と混合した。サンプルは、変性10%PAGEで分離し、ホスファーストレージスクリーン(phosphor strage screen)上に暴露した。スクリーンをStormまたはTyphoon装置上でスキャンし、ImageQuant 5.0またはGelQuant.NET 1.4プログ
ラムを使用して定量した。データをプロットし、SigmaPlot 6.0で作成した。
タ)により示されるように、yIre1活性化を評価することができる。
Ire1サンプル(10μM)を、RNase切断活性用で使用する緩衝液中、400μl細胞に充填した。55,000rpm及び30℃でBeckmann XL-A分析超遠心分離機で遠心分離を実施した。1スキ
ャン/2分の頻度で全部で60スキャンを集めた。沈殿した痕跡量を、平均軸比(average axial ratio)3:2のC(s)分布を使用してUltraScan 6.0で分析した。
金メッキプレートを100%メタノール及び水で洗浄した。溶液A(アセトニトリル0.7mL中10mg 4-HCCA、0.1%トリフルオロ酢酸)を迅速に層に塗布し、放置して乾燥した。残渣を
ティッシュでそっと除去した。次に1μl Ire1サンプル(0.1〜1mg/ml)及び5μl溶液B(300μl蟻酸、100μl H2O、200μlイソプロパノール及び10mg4-HCCA)を含む混合物0.5μlを
乾燥表面上にスポットし、放置して乾燥した。サンプルを0.1%トリフルオロ酢酸2μlで2回洗浄し、Voyager質量分析計上でMALDI分析に使用した。スペクトルはMoverZで分析した。
最初に、Ire1KR32(10mg/ml)を1.0Mクエン酸ナトリウムからADP(2mM)との複合体(complex)として蒸気拡散により結晶化した。これらの共結晶は一方向で乱れており、回折実験での使用は中止した。別の結晶形は、ADPをキナーゼ阻害剤APY29で置換することによって得た。Ire1KR32・APY29結晶は、液滴をつるす際に蒸気拡散により得た。液滴は、貯蔵緩衝
液(20mM HEPES pH7.0(20℃)、300mM NaCl、2mM DTT、及び5%グリセロール)中のIre1KR32(12mg/ml)とAPY29(1.2mM)1μlを、0.27M Na2SO4、8%PEG-3350、10mM EDTA及び2mM
TCEPを含む溶液1μlとを混合することにより調製した。ウエル溶液は200μlの0.085M Na2SO4、2.33%3350、及び5%tert-アミルアルコールを含んでいた。単結晶は、室温で3
〜4日間の間に最大サイズ0.1×0.4×0.2mmに成長した。本出願人は、TCEPが10mM L-システインで置換できたことを知見した。低温保護(cryo-protection)のために、結晶は、0.085M Na2SO4、3%tAm、5%PEG-3350及び30%エチレングリコールを含む溶液中でフラッシュ凍結した。
X-線回折データは、Berkeley National LaboratoryのAdvanced Light Source、ビ
ームラインBL8.3.1で記録した。X-線波長1.11587Å及び1度の振動角で得られたデータセットは、XDSパッケージを使用してインデックスをつけ、積分し、目盛りを付けた(Kabsch,W.J.、J.Appl.Cryst.26巻:795-800頁(1993年))(図14)。精密化(refinment)の進行
度をモニターするために5%の反射をテスト-セット(Rfree-set)反射としてマークした。分子置換溶液はPHASER(McCoy,A.J.、J Appl Cryst 40巻:658-674頁(2007年))を使用して見つけた。Ire1二量体の最近のX線構造由来のモノマーA14コピー(Lee,K.P.ら、Cell 132巻:89-100頁(2008年))を精密化用の出発モデルとして使用した。CNS(Brunger
,A.T.ら、Acta Cystallogr D Biol Crystallogr 54巻:905-21頁(1998年))にお
けるシミュレーテッド-アニーリング及びグループ化B因子精密化ならびに最終段階では、PHENIX(Adams,P.D.ら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58巻:1948-54頁(2002年))を14-回(14-fold)NCSを使用して実施した。フーリエSA-秤量(Read,R.J.、Acta Cryst A42巻:140-149頁(1986年))Fobs-Fcalc差マップは、出発構造から見当たらないモデルの部分を説明するために使用した。リガンドモデルは、ChemSketch10.0(ACD labs)
を使用して作成した。モデル構築及び実空間精密化はCoot(Emsley,P.ら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60巻:2126-32頁(2004年))、Pymol(W.DeLano)及びRSRef(Korostelev.A.ら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58巻:761-7頁(2002
年))で実施した。得られたモデルは優れた立体化学パラメータ(図14)をもち、0.264/0.298という低い結晶学的R/Rfreeは、回折データとよく一致していることを示している。
Ire1活性におけるツニカマイシン、SU11248、DJM2005、APY24及びAPY29の効果は、モデルシステムとしてHEK293細胞を使用する哺乳類細胞で試験した。細胞は、Lin JHらのScience 318巻:944頁(2007年)に記載の方法に従って処理した。表示時間の間、対応する薬剤で処理した後、Xbp-1 mRNAスプライシングはRT-PCRにより測定した。スプライスされ
ていない(unspliced:u)及びスプライスされた(spiliced:s)Xbp1-mRNA産生物は、Ire1を介するUPR活性化の尺度として表示され機能する。結果を図17に示す。
下に記載の表に示す。
ンビトロ切断から以下の結果が得られた。
応は5mCiγ32P ATPを補った100mM 冷ATPを添加して開始し、室温(RT)で進行させた。10分で反応物1mLをホスホセルロースシート(P81、Whatman)上にスポットし、続いて洗浄緩
衝液(1.0%(v/v)リン酸)中に浸漬した。シートは緩衝液中で5回洗浄し、乾燥し、転移した放射線はTyhoon(商標)スキャナ(Molecular Dynamics)を使用してホスホイメージング
により測定した。放射能カウント(radioactive count)はImageQuantソフトウエアを使用して定量し、滴定データはPrism(登録商標)ソフトウエアパッケージを使用してIC50値を
導き出すためにS字状(sigmoidal)用量反応に適合した。用量反応は100mMから出発して1/3希釈を用いて12点阻害剤滴定をベースとした。
Ire1の活性化剤及び阻害剤を同定するために、具体的なインビトロアッセイを実施する。
活性化剤の同定のために、本アッセイでは溶液中でタンパク質凝集を検出するのに適した方法のいずれかを使用する。最も原始的な形態では、約300mM NaCl及び5〜100mg/ml Ire1を含む中性緩衝液中のIre1溶液を簡単に目視チェックする。活性化剤を添加すると、曇ってくる(図2A)。このスクリーニング(screen)は迅速で、処理能力が高く、且つ簡単な自動化に適している。あるいは溶液による光散乱は、動的光散乱(dynamic light scattering:DLS)または静的光散乱(static light scattering:SLS)アプローチを使用して
測定することができる。スクリーニング条件は、ADPまたは公知活性化剤(APY29)を溶液に添加すると、DLSまたはSLSアプローチにより検出されるように重質種が発生するように選択する。うまくできた活性化剤ならばオリゴマーが形成する。当業者に公知のタンパク質凝集を検出する他の方法も同様に効果的である。
。
イ
このアッセイの好都合な点は、非常に希薄なIre1濃度の分子の活性化及び測定を実施する能力に対して高感度であるということであり、ここでしっかりと結合している活性化剤及び阻害剤は、大量の弱く相互作用している活性化剤及び阻害剤からずっと容易に選択される。本アッセイで使用されるIre1は、ドナー蛍光色素団分子でラベルしたIre1(Ire1-FRET-D)と、アクセプター蛍光色素団(または消光性染料)でラベルしたIre1(Ire1-FRET-A/Q)との混合物である。
なシグナル変化を出すずっと低いIre1濃度であった以外には、上記のように実施する。シグナル検出は、ドナーまたは/及びアクセプター染料の蛍光を使用して実施する。
動的アッセイは、Lin JHら、Science 318巻:944頁(2007年)に記載の通りである。Ire1により切断される放射性標識または蛍光標識RNAオリゴヌクレオチドを基質として使用
する。RNA切断反応のスクリーニングは、試験化合物(ADP及びAPY29)に対して最大活性応
答を産生するIre1濃度で実施する。活性化剤及び阻害剤スクリーニングは、上記説明のように関連している。
キナーゼ及びRNaseドメイン(Ire1KR)及びN-末端に向かって24個または32個のアミノ酸
で伸張したIre1KR(Ire1KR24またはIreKR32)を含むIre1の細胞質部分の変異体を調製した(図1A、図1C、図7)。これらの追加のアミノ酸伸張部分は、膜貫通領域にキナーゼ/RNaseドメインをつなぐ約100個のアミノ酸の長いリンカードメインの一部である。これら三つの
構築物は、XBP1 mRNAから誘導された部位特異的5’-32p-標識化ステムループオリゴリボヌクレオチド14を切断した(図1B、図8)。21-merステムループHP21の切断に関して観察さ
れた速度定数は、酵素濃度において非ミカエリス依存性を示し、IreKR及びIre1KR24に関
してHill係数n=2、そして意外にもIre1KR32に関してHill係数n=3.5-8と共同的に増加した(図1D)。この知見は、Ire1のRNase活性がIre1KR及びIre1KR24に関しては主に二量体、
並びにIre1KR32に関してはオリゴマーの形成と共に自己会合から生じることを示唆する。ADP・Mg補因子はRNaseの共同的活性化に全く必要ではなかった。しかしながら、補因子は、特異的RNase活性を平均で二桁増加させ、このことは補因子が活性化遷移を刺激するこ
とを示している(機構的関係を参照されたい)。
見え、このことはIre1KR32の高次オリゴマー化を示している(図1D、図2A)。Ire1KR32の幾つかのオリゴマー種が存在することは、サンプルの分析的超遠心時で明らかである(図2B)。オリゴマー化は直ちに逆転されえ、RNase活性は、溶液に塩を添加することにより抑制
できた(図2A、図2C)。対照的に、Ire1KR及びIreKR24の溶液は全てのタンパク質濃度で透
明のままであり、図1Dのその活性化プロフィールの低い共同性(cooperativity)から予想
されるように、タンパク質オリゴマー化の理学的兆候を示さなかった。
用することは、Ire1のオリゴマー状態の結晶構造を得るのに重要である(以下)。
Ire1KR32は、CDK2及びEGFRキナーゼを標的にするように設計された阻害剤と共に共結晶化した。特定のキナーゼ阻害剤は、Ire1のRNase機能を十分に活性化した(図3A)。これは
、合成化合物による野生型Ire1活性化の最初の例である。
オチド-結合ポケットを覆うベータ鎖β1の異常な位置により、構造的な衝突が一部生じるため、ATPポケットには容易には適合できなかった。
の構造的な差異から、Ire1のRNase活性におけるマグネシウムの役割を試験するために優
れたツールが提供される。従って、Ire1KR32のRNase活性におけるEDTAの作用を試験した
。ADPにより刺激された反応に関しては、RNase活性は大きさが一桁を超えて減少したが、APY29により刺激された反応に関しては、RNase活性は変化しなかった(図3F)。従って、Ire1のRNase活性は二価の金属イオンを必要としないので、マグネシウムはADPの負に帯電したホスフェート部分とD828のカルボキシル基とを結合することにより明らかにADP結合だ
けに役立つことが示される。
RNaseを活性化することを示す。最大活性のためには、核酸塩基及び糖部分は、Ire1の
自己会合を助けるキナーゼの活性なオープンコンフォメーションを安定化させるために占められるべきである。金属イオンとADPのホスフェート基との配位のため静電相互作用は
特別な役割を果たさないので、中性の空間充填基と置き換えることができる。
構造(図1、図2、図7)と対照的に、Ire1KR32は対照的な高次アセンブリとして結晶化す
る(図4A)。IreKR32の14個の分子は結晶格子中で非対称ユニットを構築する。オリゴマーの形成は、成長するフィラメントの側面への対称Ire1二量体の増加加算として記載することができ、二量体に対して同時に51.4°時計回り、14分子ごとに完全360°回転である。Ire1KR32の分析超遠心が単量体、二量体、四量体及び六量体を示すが、三量体及び五量体
がないことを示しているように、そのような段階的なオリゴマーメカニズムは明らかに溶液中で起きている(図2B)。
メントのいずれもが、既に決定された構造(図4C)で定義された2回対称性背合わせIre1二量体(モノマーA及びB、C及びDなどから作られる;図4B)によって形成される境界面IF1に
属さない。二つの新しい境界面は、これらのIre1二量体がらせん形ロッド(helical rod)に積みあがるように形成する。境界面IF2もまた2回対称性であり、モノマーA及びD、C及びFなどのRNaseドメイン間の接触により形成する。これは、α3’及びα4へリックスを結合するα3’へリックス及びα3’-α4ループを包含する。境界面IF3は、モノマーを側-側配置(side-to-side arrangement)してフィラメント(...−>A−>C−>E−>...
及び異極性では、…−>F−>D−>B−>...)にすることにより形成される。IF3は、
キナーゼドメイン間の接触により形成され、二つの新しいエレメント、αD’へリックス
及び活性化ループを包含する(図4E)。Ire1の二つの領域、N-末端伸張(残基641-664)及び
αEF-αFループ(残基865-892)は、オリゴマーでは秩序が乱れており、その構造はまだわ
かっていない。構造上は、オリゴマーはDNAの二重らせんに似ている(図4B、図9)が、境界面IF1は向かい合ったストランドの核酸塩基間の相互作用に平行であり、境界面IF3は同一ストランドの核酸塩基間のリン酸ジエステル結合に平行である。
見されず、このことはタンパク質が大腸菌内で発現されるようにIre1の全てのホスフェートが自らのキナーゼ活性から誘導されることを示している。トリプシン消化、続く質量分光分析から、リン酸化部位が、いずれも境界面IF3に面する活性化ループとαEF-αFルー
プ(図11)に限局されることを突き止めた。同時に、オリゴマー構造及びMALDI分析は、IF3がホスフェートの転移がイン-トランスで役立つモデルを支持する。境界面IF3の存在は、IF1-様二量体におけるキナーゼの構造的に好ましくない背合わせ配置に基づくIre1のトランス-自己リン酸化を説明する際の問題を解決する。
入りできにくくしており、このことはホスホリル転移反応が非常に特異的であることを示唆している。この特徴は、任意の認識可能なコンセンサス・モチーフの一部でないIre1の部位の特異的なリン酸化と、Ire1をリン酸化することが公知の他のキナーゼが見かけ上存在しないことのいずれをも説明する。
開発した大規模動的範囲で定量的切断アッセイ(図1、図2)を使用して、変異体により選択的に減じられた境界面のそれぞれをもつIre1変異体を特性決定した。IF1に関しては、Ire1は、RNase活性において試験したRNase IF1変異体の中で最大の悪影響を持つE988Q変異
体で調製した。IF2及びIF3に関しては、個々の境界面が不安定化されるように変異された、従来特性決定されていない接触を同定した(図5B)。
活性において同程度に強いか、それよりもより強い効果を示した。Ire1のRNaseドメイン
により形成した新しい境界面IF2について詳細な研究を実施した。キナーゼ-RNase境界面
における塩橋の崩壊(R947A)により、RNase活性が10倍を超えて減少した。新しいRNase-RNase境界面に位置するアルギニンの変異体(R1087Q)はさらに強い影響を及ぼした。塩橋に
関して予想されたように、電荷反転(R1087D)は電荷-中性変異体(R1087Q)よりも強くRNase活性を弱めた。R1087のパートナーの変異体(D1030R)も、RNase活性を阻害したが、わずかであった。D1030R変異体の影響が小さかった理由は不明である。D1030Rは、静電接触の妨害を部分的に相殺する局所的接触の再分配を引き起こすのかもしれない。RNase活性に関
する三つ全てのIre1境界面の重要性は、Ire1KR32の活性化オリゴマーの組み立ての際にIF1、IF2及びIF3の共同効果を示す。
デム配置を提供することによりIre1のRNaseを活性化することが示唆れてきた。原理上は
このメカニズムは、HAC1/XBP1 mRNAと比較してステム-ループがゆっくりと切断することを説明できた(図2D)。しかしながら、幾つかの証拠は、提案されたモデルを支持しない。Ire1KR32はステム-ループよりもHAC1/XBP1 mRNAの切断の有利な点を示すが、Ire1KR及びIre1KR24はまったく差別を示さない(図2DにおいてHP21とXBP1データを比較せよ)。従って、XBP1 mRNAの認識はIre1のオリゴマーを形成する能力と関連している。さらにたった一つのステムループ切断部位を含む基質は、HAC1及びXBP1 mRNAの速度でIre1KR32と反応することができ(図6A、図6B、XBP-1とXBP1-Pst1比較せよ)、二つのステム-ループを含む基
質は、HP21オリゴヌクレオチドの速度で反応することができる(図6C、XBP-1、58ntとHP21とを比較せよ)。これらの知見は、Ire1の自己会合が、基質mRNAの二重スプライス部位へ
の構造的相補性とは異なるメカニズムでRNaseドメインを活性化することを示唆している
。
ー内で研究した。オリゴマー構造物中では、RNaseドメインは二つの境界面、IF1及びIF2
により連続リボンに結合される。どちらの境界面の形成も全表面積約500Å2を覆う(図14)。IF2は、隣接するRNaseモノマーからα3’へリックスの間に相互側-側接触(reciprocal
side-to-side contact)を包含する(図6D)。α3’アルファ-へリックス並びにα3’へ
リックスに結合したα3’-α4ループ(図6D及び図14に示されている)は、二量体構造中で
は乱れており、このことはIF2が形成すると、α3’、α3’-α4へリックス-ループエレメント(helix-loop element:HLEと示される)を安定化することを示唆している。HLE内の
点変異はIre115のRNase活性を強く阻害する。HLEの機能的重要性及び二量体化境界面近くでのその位置により、Ire1のRNase活性を制御する動的スイッチングを提供することがで
きる。実際、α3’へリックスは提案された活性部位の一部を形成し、酵素の基質結合ポ
ケットに特徴的な空隙(cavity)を作り出す。HLEが存在しない場合には、先に提案された
活性部位残基は平坦な溶媒-暴露表面上にある(PDB ID 2rio)。
る非-結晶学的対称性と関連しているが、HLEのα3’-α4ループは、これがオリゴマー内
で二つのコンフォメーションをとるという点で特徴的である(図6D)。非対称ユニットにおけるIre1KR32の大部分に関しては、HLEのループの「オープン」コンフォメーションが観
察される(図6D、上部パネル)。幾つかのモノマーに関しては、結晶格子中で互いにらせん形ロッド(helical rod)が固まり(packing)になると、オープンコンフォメーションに適
合できない。これらのモノマーに関しては、別の「クローズド」コンフォメーションが作られた(図6D、下部パネル)。HLEループのオープン状態でのみ、RNA基質はIre1 RNaseの
推測上の活性部位残基と接触することができる。「クローズド」コンフォメーションでは、活性部位、特にY1043への基質アクセスが塞がれる(図6D)。これらの観察結果は、境界面IF2がHLEを配置し、且つ活性部位を構築することによってRNaseの活性化に大きな役割
を果たしていることを示唆する。
ことの知見を説明する(図2D、図6C)。二量体形成構築物、Ire1KR及びIre1KR24は、XBP1 mRNAとHP21とを区別しない(図2D)。従って、オリゴマー化はXBP1/HAC1 mRNAの認識に関
連し、Ire1オリゴマーとmRNAの間の連続接触(extended contact)は、Ire1機能に顕著に
表れる。
し、このことは、ルーメンドメインの役割はキナーゼ-RNaseモジュール内につくられた自己会合平衡(self-association equilibrium)の調節であることを示している。トランス-自己リン酸化及び補因子結合はいずれも自己組織化へ平衡をシフトさせることによってIre1活性化を助けるが、どの事象もRNaseの活性化及び自己組織化に不可欠ではない。本研
究は、Ire1KR32がオリゴマー化可能であり、且つ補因子(図1D)もリン酸化(図10、図13A、図13B)もなく活性化できることを示す。
位置づけし、境界面IF3を介してオープンコンフォメーション中に活性化ループを安定化
する(図9C)。ATPはオープン状態のキナーゼに結合し、活性化ループはリン酸化され、境
界面IF3でオープン状態で安定化される。これにより、オリゴマーアセンブリの正のフィ
ードバックが提供される(図6E)。補因子の結合は、Ire1キナーゼのオープン状態でのみ、即ちオリゴマー中で起こりえるが、モノマーでは起こりえない。補因子のオープン状態への優先的な結合は、平衡をさらにオリゴマー化にシフトさせ、遷移を活性化するための付加的且つ独立レベルの正のモジュレーションを提供する(図6E)。
マーの似たような周期性を与える。得られたクロスリンク・メッシュは、二次元で超分子Ire1フォーカスの無制限成長及び形成用のプラットフォームを与える。膜貫通領域にキナーゼ-RNaseドメインとLDを結合するリンカーの長さは、そのような配置を提供するのに十分である。入力シグナル及び不活発(inertia)に対する非線形応答(UPRをマウント(mount)
する及びアンマウントする(unmount)ための長い時間)は、かかるアセンブリに関して予測でき、且つ探究される必要のある生物学的役割を有しているかもしれない。
Claims (26)
- 式:
R1は非置換C 3 −C 6 シクロアルキルであり;
Lは−NH−C(O)−であり;
Aはアリールまたはヘテロアリールであり;
R37 はハロゲン、ハロゲン−置換若しくは非置換C 1 −C 8 アルキル、非置換へテロアルキルであり、ヘテロアルキルは、少なくとも1つの炭素原子と、O、N、P、SiおよびSからなる群から選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含み、炭素原子とヘテロ原子の総数は2〜8であり;及び
wは0〜5の整数である}をもつ化合物。 - R1がシクロプロピルである、請求項1に記載の化合物。
- Aがアリールである、請求項1または2に記載の化合物。
- Aがフェニルである、請求項3に記載の化合物。
- wが0または1である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
- R37が置換若しくは非置換C1−C4アルキルである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
- R37が−CF3である、請求項6に記載の化合物。
- 以下の式:
- 式:
R 1 は、独立して非置換C 1 −C 3 アルキル、または置換若しくは非置換5〜6員ヘテロアリールであり;
R 21 は、独立してR 25 −置換もしくは非置換C 1 −C 4 アルキル、またはR 25 −置換2〜4員ヘテロアルキルであり;
R 25 は、−CN、−CF 3 、−OH、またはオキソであり;かつ
zは、独立して0〜5の整数である}
を有する化合物。 - 式:
R 1 は、独立して非置換C 3 −C 6 シクロアルキルまたは非置換C 1 −C 4 アルキルであり;
Xは、NHまたはSであり;
R 22 は、独立してハロゲン、−CN、−NO、−NO 2 、−OH、−COOH、−SH、−C(O)H、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル;および
xは、独立して0〜5の整数である}
を有する化合物。 - 式:
R 1 は、置換または非置換5〜6員ヘテロアリールであり;
R 21 は、独立して置換もしくは非置換C 1 −C 4 アルキル、または置換もしくは非置換2〜4員ヘテロアルキルであり;および
zは、0〜5の整数である}
を有する化合物。 - R 1 は、置換または非置換チエニルである、請求項11に記載の化合物。
- R 21 は、R 25 −置換もしくは非置換C 1 −C 4 アルキル、またはR 25 −置換もしくは非置換2〜4員ヘテロアルキルであり、かつ、R 25 は、−CN、−CF 3 、−OHまたはオキソである、請求項9または12に記載の化合物。
- R 21 は、−CH 2 −CN、−CH 2 CH 2 OH、または−NH−CO−CH 3 である、請求項13に記載の化合物。
- 式:
R 1 は、独立して非置換C 4 −C 6 シクロアルキルであり;
隣り合う2つのR 21 置換基は、一緒になって置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成し;および
zは2である}
を有する化合物。 - 隣り合う2つのR 21 置換基は、一緒になって置換もしくは非置換チアゾリル、または置換もしくは非置換イミダゾリルを形成している、請求項15に記載の化合物。
- 式:
- 式:
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の化合物と医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 細胞においてIre1活性を調節することに用いるための、請求項1〜18のいずれか一項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
- 細胞においてIre1活性を活性化させることに用いるための、請求項1〜10および17のいずれか一項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
- 細胞においてIre1活性を阻害することに用いるための、請求項15,16および18のいずれか一項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
- 異常Ire1活性により生じる疾患の治療の必要な患者における異常Ire1活性により生じる疾患を治療することに用いるための医薬組成物であって、異常Ire1活性は、Ire1活性の正常レベルと比較して減少した量のIre1活性であり、かつ、請求項1〜10および17のいずれか一項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
- 異常Ire1活性により生じる疾患の治療の必要な患者における異常Ire1活性により生じる疾患を治療することに用いるための医薬組成物であって、異常Ire1活性は、Ire1活性の正常レベルと比較して増加した量のIre1活性であり、かつ、請求項15、16および18のいずれか一項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
- 前記疾患が、嚢胞性線維症、網膜色素変性病、糖尿病または神経変性病である、請求項23に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が癌、炎症性疾患、または自己免疫疾患である、請求項24に記載の医薬組成物。
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