CN104208074A - 2α-羟基原人参二醇在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及2α-羟基原人参二醇在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是2α-羟基原人参二醇在制备抗肿瘤药物耐药逆转剂中的应用。2α-羟基原人参二醇是天然产物，具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用，可以作为肿瘤多药耐药的逆转剂；2α-羟基原人参二醇也具有增加肿瘤多药耐药细胞对抗肿瘤药物敏感性的作用，可以作为化疗增敏剂使用。本发明还提供了抗肿瘤药物和2α-羟基原人参二醇联合使用的药物组合物抑制肿瘤多药耐药细胞增殖的用药方法。本发明中的小分子化合物2α-羟基原人参二醇作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

Description

2α-羟基原人参二醇在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的用途

技术领域

本发明属于逆转肿瘤多药耐药和增敏抗肿瘤药物的医药学领域，具体涉及罗汉果皂苷元——2α-羟基原人参二醇的新用途，即2α-羟基原人参二醇在制备肿瘤多药逆转剂和抗肿瘤药物增敏剂中的应用。

背景技术

恶性肿瘤严重危害人类的生命健康，已成为当今疾病致死亡的主要原因之一。目前恶性肿瘤的主要治疗手段有手术治疗、放疗和化疗等。对于被诊断为晚期肿瘤的患者和已经发生转移的患者来说，化疗是一个较好的选择。临床医生通过调节用药剂量可以优化得到最大的疗效和最小的毒性，帮助患者延长生存时间和提高预后生活质量。然而，肿瘤细胞的耐药性的产生导致肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降，大大限制了化疗的治疗的效果[1]。肿瘤细胞对某种药物产生耐药性之后，会对从未接触过的、结构不同、作用机制各异的多种化疗药物产生交叉耐药，这种现象称为肿瘤的多药耐药性（Multiple Drug Resistance,MDR）。多药耐药的产生是当前肿瘤治疗的所面临的重大难题之一[2-4]。MDR一旦产生，通过加大药物剂量是无效的，会产生更强的毒性和进一步诱导耐药的产生[5-8]。多数与MDR有关的药物都是疏水性或者两亲性的天然产物，如紫杉烷类、蒽环类抗生素、长春花生物碱类等[7, 9-11]。MDR的产生具有多种机制，包括细胞对一些水溶性药物摄取的减少，细胞周期的改变，DNA修复功能的增强，抑制细胞的凋亡，药物在细胞内的代谢过程的改变，对疏水性药物和易于进入细胞的一些药物外排的增加等[12]。肿瘤MDR的形成过程复杂，这些耐药机制常同时存在，但以一种机制为主，不同机制之间互相影响，可能单独或联合起作用[13]。

为了克服肿瘤细胞对化疗药物的MDR特性，研究者们一直在寻找有效的ABC转运蛋白的抑制剂，这些化合物又被称为MDR的抑制剂、调节剂、逆转剂或者化疗增敏剂，它们通常能够调节多个ABC转运蛋白的功能[7, 8]。1981年，Tsuruo首次报道了钙通道阻滞剂异搏定（Verapamil）和钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪（TFP）在体外和体内实验中均能增强耐药小鼠白血病P388/VCR细胞对长春新碱（vincristine，VCR）的敏感性[14]。在随后30年的研究中，新的MDR逆转剂的不断被发现和研究，但较高的细胞毒性一直是困扰MDR抑制剂研究开发的一大问题。因此，开发毒性较小、逆转作用更强的MDR抑制剂或逆转剂仍然是肿瘤药物研究的热点之一。

在新一代MDR抑制剂的研究过程中，从天然产物中筛选高效低毒的MDR逆转剂日益被医学界所重视并逐渐成为研究的热点。多种天然产物被发现具有逆转肿瘤细胞MDR的作用。罗汉果（Siraitia grosvenorii Swingle）是葫芦科多年生草本植物，是我国特有的植物，主要产于广西永福、临桂和龙胜等地。罗汉果的果实可以食用，也可以入药，在广西民间的药用历史已有300多年。罗汉果性凉，味甘，有清热润肺，滑肠通便的功效[15]。罗汉果因其甜度高、热量低而被作为甜味剂广泛使用，常作为肥胖者和糖尿病患者的代用糖。罗汉果的主要化学成分之一是罗汉果皂苷，该类化学成分具有镇咳、祛痰、平喘、调节免疫、降低血糖、抗病毒和抑制肿瘤细胞增殖等药理作用[16]。

2α-羟基原人参二醇为罗汉果皂苷IA1、IE1、IIE、III、IV、IVE、V和赛门苷I等的苷元，英文名为2α-羟基原人参二醇，其化学结构如下所示：

目前关于罗汉果皂苷2α-羟基原人参二醇对肿瘤细胞耐药性的调节尚未见报道。

参考文献

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发明内容

本发明的目的是提供一种小分子化合物2α-羟基原人参二醇，即2α-羟基原人参二醇在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的新用途。

本发明的另一目的在于提供包含2α-羟基原人参二醇和VCR及ADR等抗肿瘤药物的抗肿瘤药物组合物在制备治疗多药耐药肿瘤的药物中的应用。

2α-羟基原人参二醇的细胞毒作用较小，对多种肿瘤细胞的IC₅₀均大于40 μM，具有良好的安全性。本发明通过随机筛选，发现该天然产物具有逆转MDR的作用。鉴于其低毒高效的特点，具有良好的应用前景。实验表明，2α-羟基原人参二醇 能够增强化疗药物对肿瘤多药耐药细胞株增殖的抑制效果，逆转多药耐药的作用。例如实施例中显示的，2α-羟基原人参二醇能够逆转KB/VCR细胞对VCR的耐药作用，增强KB/VCR细胞对化疗药物VCR的敏感性，促进VCR对KB/VCR细胞的凋亡的诱导作用。2α-羟基原人参二醇能够显著克服多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR的耐药性，逆转肿瘤细胞的多药耐药特性，增强化疗药物对肿瘤多药耐药肿瘤细胞的治疗效果。

本发明提供了2α-羟基原人参二醇在制备肿瘤多药耐药逆转剂（Reversal agent）中的应用。

所述的肿瘤可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌或胰腺癌等各种肿瘤。所述的肿瘤细胞可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌或者宫颈癌的肿瘤细胞。例如，实施例中所采用的多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR。2α-羟基原人参二醇对于由于药物外排增加导致的耐药性有显著效果。

所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌药物、抗口腔癌药物或者抗肺腺癌药物，可以是细胞周期特异性药物(CCSA) ，如长春新碱、紫杉醇等，也可以是柔红霉素、5-氟尿嘧啶等细胞周期非特异性药物(CCNSA)。

所述的抗肿瘤药物耐药逆转剂可以被制成任何一种药学上可接受的剂型，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等。

本发明还提供了2α-羟基原人参二醇在制备抗肿瘤药物的增敏剂（sensitizer）中的应用。

2α-羟基原人参二醇能够克服肿瘤多药耐药细胞的耐药特性，增加肿瘤耐药细胞对药物的敏感性，增强VCR对KB/VCR细胞的促凋亡作用和ADR所引起的多药耐药细胞的G2/M期阻滞。

本发明中所述的抗肿瘤药物的耐药逆转剂或增敏剂的活性成分是2α-羟基原人参二醇。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，该组合物包括2α-羟基原人参二醇和抗肿瘤药物。所述的抗肿瘤药物可以是长春新碱、紫杉醇等细胞周期特异性药物(CCSA)，也可以是柔红霉素、5-氟尿嘧啶等细胞周期非特异性药物(CCNSA)。2α-羟基原人参二醇也可以与外科手术联合使用，与一种或多种西药联合使用，与中草药联合使用，与放射性治疗联合使用。

本发明的一个实施例中，2α-羟基原人参二醇能够增强VCR对KB/VCR细胞的促凋亡作用,能够逆转KB/VCR细胞对VCR的耐药作用，使VCR重新发挥促凋亡作用。由于VCR本身是一个微管抑制剂，可以引起微管的解聚，引起细胞发生凋亡，使处于sub-G1期的细胞增多。因此，2α-羟基原人参二醇可以显著促进VCR对肿瘤多药耐药细胞KB/VCR的凋亡诱导作用，这种作用随着2α-羟基原人参二醇浓度的增加而增强。在对KB细胞的试验中，未发现相似的现象。

另一方面，本发明提供了一种增加体外培养的多药耐药肿瘤细胞对化疗药物敏感性的方法，即在多药耐药肿瘤细胞的培养基中加入2α-羟基原人参二醇。

所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌或胰腺癌。所述的肿瘤细胞可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌或胰腺癌等各种肿瘤细胞。例如，实施例中所采用的多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR。

对肿瘤细胞加药后，培养基中2α-羟基原人参二醇的浓度可以大于20 μM，甚至大于50 μM。但是，即使培养基中2α-羟基原人参二醇的浓度较低，例如5-20 μM，甚至接近于但不包含0 μM的时候，2α-羟基原人参二醇依然能够起到肿瘤多药耐药逆转剂或者化疗增敏剂的作用。

本发明的小分子化合物2α-羟基原人参二醇可以采用各种常规的制备方法制备。例如，可从植物（例如，罗汉果）中分离纯化或者人工化学合成的方法。

利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与2α-羟基原人参二醇发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：肌内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。

以本发明的2α-羟基原人参二醇为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的2α-羟基原人参二醇可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的2α-羟基原人参二醇还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的2α-羟基原人参二醇被用作药物时，可将治疗有效剂量的2α-羟基原人参二醇施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地剂量是约10微克/千克体重~1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了2α-羟基原人参二醇在制备抗肿瘤药物中的应用。2α-羟基原人参二醇是天然产物，在高剂量时能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。实验表明，2α-羟基原人参二醇能够明显克服多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR的耐药性，逆转肿瘤多药耐药细胞的耐药特性，增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的治疗效果。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

实施1： CCK-8试剂盒检测耐药细胞株对2α-羟基原人参二醇的耐药倍数

实验材料：

2α-羟基原人参二醇提取自植物罗汉果（有生产厂商及其货号吗），纯度不低于95%。人口腔癌细胞株KB及其耐药细胞株KB/VCR由中科院药物所提供，人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR及其耐药细胞株MCF-7/ADR，人结肠癌HCT-8及其耐药细胞株HCT-8/VCR均购自南京凯基生物公司。维拉帕米（VPL）、长春新碱(VCR)和阿霉素(ADR)购自罗氏化学公司，纯度都大于99%。CCK-8试剂盒购自同仁公司。

实验方法：

细胞复苏

1) 从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2) 从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3) 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。

细胞传代培养

人口腔癌细胞株KB及其耐药细胞株KB/VCR培养于含有10%胎牛血清和1mM丙酮酸钠的α-MEM培养基中，人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR及其耐药细胞株MCF-7/ADR培养于含10%胎牛血清的1640培养基中。

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中生长至约90%汇合度（贴壁细胞）时，按照1:3到1:5的比例传代，约每隔2~4天传代一次。方法如下：

1) 用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。

2) 加入1~2 ml 0.25% 胰蛋白酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3) 用含10%Gibco胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

细胞冻存

1) 取培养至对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2) 弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10% DMSO，40% DMEM和50% Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5- 1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1 -1.5ml。

3) 将冻存管放入冻存盒中置于-80℃，5小时后移入液氮罐中保存。

CCK-8实验 

KB和KB/VCR细胞以及MCF-7和MCF-7/ADR细胞都按照3500/孔的密度接种到96孔板中，24 h后不同浓度的ADR，VCR，2α-羟基原人参二醇以及VCR和2α-羟基原人参二醇一起用含10%胎牛血清的α-MEM配好后被加到各个孔中。培养48 h后，弃去培养液，每孔加入90 μL 不含血清的培养基和10 μL CCK-8试剂。37℃反应2 h后，酶标仪读取450 nm波长的吸光值（OD450）。通过计算得到用药组相对于对照组的细胞增殖比率。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为加入与药物同体积的DMSO，细胞存活率=（实验组OD450-空白组OD450）/（对照组OD450-空白组OD450）。通过IC₅₀值再计算耐药倍数（Resistance Fold，RF）。

RF =耐药细胞株的 IC₅₀ 值/亲本细胞株的 IC₅₀ 值。 每个浓度设 3个重复孔，实验重复 3 次。

表1  2α-羟基原人参二醇能够克服耐药细胞株的耐药性

所有耐药细胞系在生长抑制实验之前在无药物培养基中生长3天。每个数值是3个独立实验结果，IC₅₀以“均值±标准差”形式表示。VCR，长春新碱；ADR，柔红霉素；RF，耐药倍数。

实验结果：

KB/VCR和MCF-7/ADR是两种常用的多药耐药细胞株，在本实施例中，这两种细胞也表现出多药耐药的特性。如表1所示，KB/VCR细胞相对于KB细胞对VCR和ADR的耐药倍数分别为81.9倍和94.4倍，而MCF-7/ADR细胞跟MCF-7细胞相比对VCR和ADR的耐药倍数分别是38.1倍和20.9倍，显示实验所用耐药细胞具有多药耐药性，且MDR活性类似于文献报道的结果。

2α-羟基原人参二醇对亲本细胞株KB和MCF-7的半数抑制浓度IC₅₀分别为66.3 μΜ和92.4 μΜ，对耐药细胞株KB/VCR和MCF-7/ADR的IC₅₀分别为78.5 μΜ和92.5 μΜ，两者之间无显著性差别，多药耐药细胞株KB/VCR和MCF-7/ADR没有表现出对化合物2α-羟基原人参二醇的交叉耐药，说明2α-羟基原人参二醇可以逃脱耐药细胞的多药耐药性。2α-羟基原人参二醇在40 μΜ 以下的浓度下，对细胞生长无明显的抑制，高于50 μΜ的浓度下会抑制细胞的增殖。

结论：2α-羟基原人参二醇能够克服耐药细胞株的耐药性，耐药细胞株对2α-羟基原人参二醇的敏感性基本相同。

实施例2：CCK-8方法检测2α-羟基原人参二醇对肿瘤细胞多药耐药活性的逆转作用

实验材料：同实施例1。

实验方法：

2α-羟基原人参二醇增敏实验： KB/VCR, MCF-7/ADR和HCT-8/VCR细胞按照3500/孔的密度接种到96孔板中， 24 h后不同浓度的VCR，以及不同浓度的VCR和2Α-羟基原人参二醇一起用含10%胎牛血清的α-MEM配好后被加到各个孔中。培养48 h后，弃去培养液，同实施实例1中方法，用CCK-8试剂盒测耐药细胞株及其亲本细胞对VCR和VCR+2α-羟基原人参二醇的活性，绘成曲线。每个浓度设 3个重复孔，实验重复 3 次。

实验结果：

KB/VCR细胞对VCR的耐药倍数为81.9倍，当加入10 μM的2Α-羟基原人参二醇后，使KB/VCR细胞对VCR的敏感性增加了2.3倍，而ADR对耐药细胞MCF-7/ADR的IC₅₀下降了7.1倍, VCR对HCT-8/VCR的IC₅₀ HCT-8下较降了2.2倍。2α-羟基原人参二醇能够逆转肿瘤多药耐药细胞对化疗药物的耐药性。而这种效应在亲本细胞中表现并不明显。

结论：

2α-羟基原人参二醇可以逆转肿瘤多药耐药细胞KB/VCR和HCT-8/VCR的耐药性。

2α-羟基原人参二醇是天然产物，具有一定的临床使用价值。随着人们对此类化合物的化学和生物学研究的深入, 其分子作用机制将逐步明确, 这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究, 并有助于提高此类化合物的药用价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.2α-羟基原人参二醇在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的应用是2α-羟基原人参二醇在制备抗肿瘤药物的耐药逆转剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，2α-羟基原人参二醇是肿瘤多药耐药逆转剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌、结肠癌或胰腺癌。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是长春新碱、柔红霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，2α-羟基原人参二醇是抗肿瘤药物的增敏剂。

6.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物组合物的有效成分是抗肿瘤药物和2α-羟基原人参二醇。

7.如权利要求6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是细胞周期特异性药物或者细胞周期非特异性药物。

8.如权利要求6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是长春新碱、柔红霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。

9.一种促使体外耐药肿瘤细胞增敏的方法，其特征在于，在耐药肿瘤细胞的培养基中加入2α-羟基原人参二醇。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌或者胰腺癌。