CN104206382B - 油菜素内酯在提高青蒿素含量中的应用 - Google Patents
油菜素内酯在提高青蒿素含量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了油菜素内酯在提高青蒿素含量中的应用。本发明所提供的应用，为A1)、A2)或A3)的物质在提高黄花蒿中青蒿素含量中的应用；所述A1)的物质为油菜素内酯；所述A2)的物质为油菜素内酯类似物；所述A3)的物质为以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质。实验证明，对黄花蒿施用油菜素内酯可以提高黄花蒿中青蒿素的含量。该方法不需要基因工程方法所要求的较高的前期投入，可以有效降低青蒿素的生产成本并提高黄花蒿中青蒿素的产量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中油菜素内酯在提高青蒿素含量中的应用。
背景技术
黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)是一种传统的药用植物。黄花蒿又名香蒿、苦蒿、蒿枝。20世纪70年代，我国科学家首次从黄花蒿中分离到具有抗疟活性的无色针状晶体化合物，命名为青蒿素(artemisinin)，并最终确定其结构为一种具有内部过氧桥的倍半萜内酯。后来的研究表明，由于分子内部“过氧桥”的存在，青蒿素及其衍生物对脑型疟疾、抗氯喹恶性疟疾具有很好的疗效，被世界卫生组织认为是最有潜力的抗疟药物。在2002年非洲“疟疾日”上，世界卫生组织官员指出：基于青蒿素的综合治疗(Artemisinin-BasedCombinationTherapies,ACTs)能够降低疟疾发生的频率以及降低疟原虫抗性的产生和蔓延，是目前最有效和最值得推广的治疗方法，为了控制疟疾的蔓延，今后要推行“基于青蒿素的综合治疗”。越来越多的国家将ACTs作为疟疾治疗的首选策略，增加了青蒿素的市场需求量。此外，有研究表明，青蒿素对白血病、乳腺癌等一系列癌细胞具有很好的抑制作用。
目前世界上青蒿素类药物的生产主要是从黄花蒿中直接提取，而黄花蒿中青蒿素的含量一般较低(约占干重的0.01％-0.8％)，且提取环节多、费时费力，使青蒿素的生产成本高、产量低，难以满足市场需求，所以如何提高黄花蒿中青蒿素的含量成为提高青蒿素产量的关键。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何提高黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)中青蒿素的含量。
为解决上述技术问题，本发明提供了A1)、A2)或A3)的物质在提高黄花蒿中青蒿素含量中的应用；
所述A1)的物质为油菜素内酯；
所述A2)的物质为油菜素内酯类似物；
所述A3)的物质为以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质。
上述应用中，所述提高黄花蒿中青蒿素含量可为提高黄花蒿叶中青蒿素含量。
上述应用中，所述提高黄花蒿中青蒿素含量，包括对所述黄花蒿施用所述油菜素内酯的溶液、所述油菜素内酯类似物的溶液或所述以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质的溶液的步骤。
上述应用中，所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5μM-200μM，所述5μM-200μM具体可为10μM-100μM；所述10μM-100μM具体可为80μM。
上述应用中，施用所述油菜素内酯的溶液的时间是在采收前4-10天，如4天或10天。施用所述油菜素内酯的溶液的方法为每天施用1次，直至采收。
上述应用中，施用所述油菜素内酯的溶液的方式为叶面喷施、土壤浇灌和培养基中添加这三种中的任一种、任两种或三种。
本发明所要解决的另一个技术问题是如何获得青蒿素含量高的黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)叶。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产黄花蒿叶的方法。
本发明所提供的生产黄花蒿叶的方法，包括在采收黄花蒿叶前，对所述黄花蒿施用所述油菜素内酯的溶液、所述油菜素内酯类似物的溶液或所述以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质的溶液。
上述生产黄花蒿叶的方法中，所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5μM-200μM，所述5μM-200μM具体可为10μM-100μM；所述10μM-100μM具体可为80μM。
上述生产黄花蒿叶的方法中，施用所述油菜素内酯的溶液的时间是在采收前4-10天，如4天或10天。施用所述油菜素内酯的溶液的方法为每天施用1次，直至采收。
上述生产黄花蒿叶的方法中，施用所述油菜素内酯的溶液的方式为叶面喷施、土壤浇灌和培养基中添加这三种中的任一种、任两种或三种。
上述生产黄花蒿叶的方法中，所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5μM-200μM，所述5μM-200μM具体可为10μM-100μM；所述10μM-100μM具体可为80μM。
本发明所要解决的再一个技术问题是如何降低制备青蒿素的成本。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备青蒿素的方法。
本发明所提供的制备青蒿素的方法，包括从上述生产黄花蒿叶的方法中生产的黄花蒿叶中提取青蒿素。
上述制备青蒿素的方法中，提取青蒿素的方法可采用现有的从黄花蒿叶中提取青蒿素的方法。
上述制备青蒿素的方法还包括纯化青蒿素的步骤；所述纯化青蒿素可按照现有的方法进行。
本申请的油菜素内酯处理黄花蒿后可以明显增加黄花蒿中青蒿素的含量：黄花蒿叶经2％(体积百分比)乙醇水溶液处理(CK)后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为1.29±0.10mg/g干燥叶，黄花蒿叶经5μM的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为2.43±0.38mg/g干燥叶，黄花蒿叶经10μM的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的平均为2.45±0.48mg/g干燥叶，黄花蒿叶经80μM的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为3.26±0.28mg/g干燥叶，黄花蒿叶经100μM的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为2.88±0.07mg/g干燥叶，黄花蒿叶经200μM的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为2.11±0.90mg/g干燥叶。其中，经80μM的油菜素内酯处理后黄花蒿中青蒿素的含量最高，为喷施2％(体积百分比)乙醇水溶液(CK)的黄花蒿中青蒿素含量的2.53倍。
本申请的实验证明，油菜素内酯在提高黄花蒿中青蒿素的含量作用显著，因此在田间生产过程中可以施用油菜素内酯来提高黄花蒿中青蒿素的含量。该方法工艺简单，可以有效降低青蒿素的生产成本并提高黄花蒿中青蒿素的含量，对青蒿素大规模生产具有重要意义。
附图说明
图1为不同浓度油菜素内酯处理黄花蒿叶片后黄花蒿叶片中青蒿素含量的变化。其中，DW表示叶片干重，CK表示2％(体积百分比)乙醇水溶液。
图2为青蒿素标准品和样品的HPLC图。其中a为青蒿素标准品的HPLC图，b为样品的HPLC图。
图3为80μM油菜素内酯处理黄花蒿叶片后第4天叶片中青蒿素的含量。其中，DW表示叶片干重，未处理表示未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片，处理表示经80μM油菜素内酯处理的黄花蒿叶片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的油菜素内酯为Inalco公司产品。
下述实施例中的各浓度的油菜素内酯溶液均是将油菜素内酯先用无水乙醇溶解，再用蒸馏水配制成所需要浓度的溶液。各浓度的油菜素内酯溶液中，乙醇的浓度均为2％。
下述实施例中的黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)均为黄花蒿株系001(HighefficiencyofgenetictransformationandregenerationofArtemisiaannuaL.viaAgrobacteriumtumefaciens-mediatedprocedure，Jun-liHan,HongWang,He-chunYe,YanLiu,Zhen-qiuLi,YiZhang,Yan-shengZhang,FangYan,Guo-fengLi，PlantScience,168(2005)73–80.)公众可从中国科学院大学(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、不同浓度油菜素内酯对黄花蒿中青蒿素合成的影响
实验重复三次，每次重复实验的方法如下：
1、用油菜素内酯处理黄花蒿植株
将黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)种子依次按照下述步骤进行消毒：①用70％(体积百分比)乙醇水溶液清洗2min；②5％(质量百分比)次氯酸钠水溶液消毒10-15min；③无菌水冲洗，得到无菌黄花蒿种子。将无菌黄花蒿种子播种在MS培养基中，于温度为25℃、光照强度为3000lx、光照周期为16h白天/8h黑夜的条件下进行培养，两周后得到黄花蒿幼苗。将黄花蒿幼苗转到含有草木灰和蛭石(草木灰和蛭石的体积比为1:1)的基质中，于温度为25℃、光照强度为3000lx、光照周期为16h白天/8h黑夜的条件下培养5周，得到生长状态均一的黄花蒿植株，该黄花蒿植株未出现花蕾。
用浓度分别为5μM、10μM、80μM、100μM、200μM的油菜素内酯溶液和2％(体积百分比)乙醇水溶液(作为对照，CK)分别对黄花蒿植株叶面进行喷施，每天喷施一次，每次喷施后于温度为25℃、光照强度为3000lx、光照周期为16h白天/8h黑夜的条件下培养，共培养10天，分别得到5μM黄花蒿植株、10μM黄花蒿植株、80μM黄花蒿植株、100μM黄花蒿植株、200μM黄花蒿植株、CK黄花蒿植株。每种溶液为一个处理，每个处理喷施六株黄花蒿植株。
2、青蒿素含量的检测
分别将5μM黄花蒿植株、10μM黄花蒿植株、80μM黄花蒿植株、100μM黄花蒿植株、200μM黄花蒿植株、CK黄花蒿植株的叶片于45℃烘箱中烘干至恒重，分别得到5μM干燥叶片、10μM干燥叶片、80μM干燥叶片、100μM干燥叶片、200μM干燥叶片、CK干燥叶片。将5μM干燥叶片、10μM干燥叶片、80μM干燥叶片、100μM干燥叶片、200μM干燥叶片、CK干燥叶片分别研成粉末，分别得到六种干燥叶片的粉末。分别称取上述六种干燥叶片的粉末各100mg，各加入40mL石油醚(沸点30-60℃)并于室温下浸提过夜，分别得到5μM粗提液、10μM粗提液、80μM粗提液、100μM粗提液、200μM粗提液、CK粗提液。将上述六种粗提液于室温下超声处理2-4min，并于旋转蒸发仪中蒸干石油醚，分别得到5μM提取物、10μM提取物、80μM提取物、100μM提取物、200μM提取物、CK提取物。分别用10mL甲醇溶解上述六种提取物，并于12000rpm离心5min，弃沉淀，分别得到5μM精提液、10μM精提液、80μM精提液、100μM精提液、200μM精提液、CK精提液。
分别向上述六种精提液中各加入4mL0.2％(质量百分比)的NaOH，分别混匀后并分别于50℃下水浴30min，并将其分别冷却至室温后，分别加入5mL0.05M醋酸水溶液，将其分别混匀后，经0.45μm的NC膜过滤，分别得到5μM待测液、10μM待测液、80μM待测液、100μM待测液、200μM待测液、CK待测液。将上述六种待测液分别上柱进行HPLC分析。
HPLC(Agilent1260Infinity液相色谱仪)检测条件为：3.9×150mmC18反相柱，流动相为溶液A(溶液A由0.01MpH7.0磷酸钠缓冲液与甲醇按照50：50的体积比混合而成)，流速为1mL/min，UV检测波长为260nm,上柱体积为20μL。
HPLC分析中，使用AgilentMasshunter对色谱峰进行积分，以青蒿素(纯度为98％，购自sigma公司，货号为361953)为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析上述六种待测液的青蒿素含量。上述六种待测液的青蒿素含量见图1。标准品和样品的HPLC分别如图2中a和b所示，标准品青蒿素在该色谱条件下的保留时间为4分钟；样品在该色谱条件下含有保留时间为4分钟的青蒿素的层析峰。
结果显示，黄花蒿植株叶经5μM的油菜素内酯溶液处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为2.43±0.38mg/g干燥叶，黄花蒿植株叶经10μM的油菜素内酯溶液处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为2.45±0.48mg/g干燥叶，黄花蒿植株叶经80μM的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为3.26±0.28mg/g干燥叶，黄花蒿植株叶经100μM的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为2.88±0.07mg/g干燥叶，黄花蒿植株叶经200μM的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为2.11±0.90mg/g干燥叶，黄花蒿植株叶经2％(体积百分比)乙醇水溶液(CK)处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为1.29±0.10mg/g干燥叶。结果表明，与喷施2％(体积百分比)乙醇水溶液(CK)的黄花蒿相比，黄花蒿植株经不同浓度的油菜素内酯处理后黄花蒿中青蒿素的含量均增加，其中，经80μM的油菜素内酯处理后黄花蒿中青蒿素的含量最高，为喷施2％(体积百分比)乙醇水溶液(CK)的黄花蒿中青蒿素含量的2.53倍。油菜素内酯处理黄花蒿可以明显增加黄花蒿中青蒿素的含量，其中80μM的油菜素内酯溶液中油菜素内酯的浓度为80μM时为处理黄花蒿的最佳浓度。
实施例2、油菜素内酯处理时间对黄花蒿中青蒿素合成的影响
实验重复三次，每次重复实验的方法如下：
用浓度为80μM的油菜素内酯(Inalco公司产品)溶液对实施例1中步骤1中的黄花蒿植株的叶面进行喷施，每天喷施一次，每次喷施后于温度为25℃、光照强度为3000lx、光照周期为16h白天/8h黑夜的条件下培养，以喷施2％(体积百分比)乙醇水溶液(CK)的黄花蒿植株作为未经油菜素内酯处理的对照。培养期间，在第4天采集经过80μM油菜素内酯处理和未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片，分别得到经过油菜素内酯处理的黄花蒿叶片和未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片。
按照实施例1中步骤2的方法，将5μM黄花蒿植株、10μM黄花蒿植株、80μM黄花蒿植株、100μM黄花蒿植株、200μM黄花蒿植株、CK黄花蒿植株的叶片替换为上述经过油菜素内酯处理的黄花蒿叶片和未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片，其余步骤不变，测定经过80μM油菜素内酯处理4天的黄花蒿叶片和未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片中青蒿素的含量，结果见图3。
结果表明，经80μM油菜素内酯处理后第4天的黄花蒿叶片中青蒿素的含量为3.82±0.32mg/g干燥叶，未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片中青蒿素的含量为1.68±0.30mg/g干燥叶，与未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片中青蒿素的含量相比，经80μM油菜素内酯处理后第4天的黄花蒿叶片中青蒿素的含量提高了1.27倍。
Claims (10)
1.油菜素内酯或以所述油菜素内酯为活性成分的物质在提高黄花蒿中青蒿素含量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征于：所述提高黄花蒿中青蒿素含量，包括对所述黄花蒿施用所述油菜素内酯的溶液或以所述油菜素内酯为活性成分的物质的溶液的步骤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5μM-200μM。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为10μM-100μM。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为80μM。
6.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于：施用所述油菜素内酯的溶液的时间是在采收前4-10天。
7.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于：施用所述油菜素内酯的溶液的方式为叶面喷施、土壤浇灌和培养基中添加这三种中的任一种、任两种或三种。
8.生产黄花蒿叶的方法，包括在采收黄花蒿叶前，对所述黄花蒿施用油菜素内酯的溶液或以所述油菜素内酯为活性成分的物质的溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5μM-200μM。
10.制备青蒿素的方法，包括按照权利要求8或9所述方法生产黄花蒿叶，再从该黄花蒿叶中提取青蒿素。
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