CN104206376A - 楼来牛胚胎冷冻液、冷冻方法及解冻方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于楼来牛胚胎冷冻液、冷冻方法及解冻方法，属生物工程及胚胎遗传技术领域。楼来牛胚胎冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMSO。冷冻方法包括胚胎的获取、冷冻预处理、胚胎装管和胚胎冷冻。解冻方法是麦管在空气中停留5-10s后，放入35-38℃水浴10-15s，将胚胎检出移到WM1液滴中后，移入含相同溶液的另一孔液滴中，再分别移入WM2和含HM为800μl/孔的液滴中，每次停留时间均为5min；胚胎在培养液中洗涤三次后，在培养液中继续培养观察胚胎发育情况或者移植到已经同期发情处理的受体母牛。本发明冷冻液、冷冻方法及解冻方法具有冷冻效果好，可操作性强、操作方便、利于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程及胚胎遗传技术领域，特别涉及一种用于楼来牛胚胎冷冻液、冷冻方法及解冻方法。
背景技术
胚胎冷冻保存技术是胚胎移植技术进入产业化推广应用和发展阶段的关键环节。该技术可以使胚胎移植不受时间、地域限制，简化活畜运输和引种的费用，防止疫病传播等。利用这项技术还可以建立良种家畜和濒危动物胚胎库，有效地保存各种优良品种和濒危物种的遗传资源。目前在胚胎冷冻保存研究中主要是寻求毒性低的抗冻保护剂、有效合理、易于操作的方法以及胚胎对低温敏感的决定性因素等方面进行研究，并试图从动物基因型、胚胎细胞结构特点等方面寻求突破点，提高胚胎冷冻的效果。
在胚胎冷冻过程中，正确的操作方法、抗冻保护剂的选择和合理搭配、严格的解冻方法对减少由于冷冻给胚胎造成的损伤显得尤为重要。国内外对于操作的规范化、抗冻保护剂的合理搭配等方面都进行了研究，但如何合理的在保证正确的操作前提下，冷冻液中加入冷冻保护剂的种类与冷冻程序都密切关系到胚胎冷冻、解冻后的存活率与其随后的受胎率。胚胎冷冻过程中，常用的冷冻保护剂是甘油、乙二醇和蔗糖。用上述三种冷冻保护剂对牛体内胚胎进行冷冻，胚胎的冷冻效果不尽相同，解冻后的存活率及妊娠率受到不同程度影响，这成为了限制牛胚胎移植技术进一步发展的一大难题。
发明内容
本发明的目的是解决胚胎冷冻效果不同的难题，提供一种冷冻效果好，方法简便，解冻后复苏率高，易于楼来牛在生产应用推广，采用乙二醇、蔗糖、DMSO作为冷冻剂对楼来牛体内胚胎进行冷冻保存，为实现本发明目的所使用的技术方案是：
一种楼来牛胚胎冷冻液，冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMSO；所述的各组分重量份数为乙二醇90-100、蔗糖45-60和DMSO80-100；所述的冷冻液还包括TCM-HEPES；配制时，将蔗糖溶解于TCM-HEPES中。乙二醇、二甲亚砜是低分子中性物质，属渗透型抗冻剂，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，起到保护作用。而蔗糖属非渗透型抗冻剂，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态。
所述的乙二醇95-100、蔗糖50-55和DMSO85-95，所述的TCM-HEPES含20%FCS，所述的蔗糖浓度为25-30%。
所述的乙二醇90-95、蔗糖45-60和DMSO90-100，所述的蔗糖浓度为26-29%。
一种楼来牛胚胎冷冻方法，使用以上所述的乙二醇、蔗糖和DMSO冷冻，具体步骤如下：
（1）胚胎的获取，取第5～8天桑椹胚和囊胚；放入盛有保存液的培养皿中；筛选出优秀胚胎和优良胚胎；
（2）冷冻预处理，将筛选的胚胎在HM液洗涤2-5次后，移入至VS1液，停留1-3min后，再移入VS2液中，备用；所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES；所述的VS1是800μl HM 、100μl EG 和100μl DMSO；所述的VS2是600μl HM、200μl EG 和200μDMSO；
（3）胚胎装管，麦管先吸入2μlVS1液后，吸入空气泡，然后吸入步骤（2）中含有胚胎的VS2液后，继续吸入空气泡，最后以VS1液封存；
（4）胚胎冷冻，将步骤（3）装管的胚胎进行冷冻，在液氮面停留30-50s后浸入到液氮中冷冻。
所述的胚胎取自第6-8天桑椹胚和囊胚，所述的保存液是VS1和VS2，所述的培养皿直径为35mm。
所述的胚胎在HM液中洗涤2-3次，移入VS1液，停留时间1-2min。
一种楼来牛胚胎解冻方法，将以上冷冻的胚胎进行解冻，将麦管从液氮中取出，在空气中停留5-10s后，放入35-38℃水浴10-15s，将胚胎检出移到WM1液滴中后，移入含相同溶液的另一孔液滴中，再分别移入WM2和含HM为800μl /孔的液滴中， 每次停留时间均为5min；胚胎在培养液中洗涤三次后，在培养液中继续培养观察胚胎发育情况或者移植到已经同期发情处理的受体母牛；所述的WM1是HM800μl和SM400μl；所述的WM2是HM800μl+SM200μl；所述的SM液是含28.5%蔗糖(W/V)TCM-HEPES。
所述的培养液是WM1、WM2和HM，在空气中停留5-8s，放入35-36℃水浴10-12s。
本发明的有益效果在于：冷冻效果比常用甘油、乙二醇和蔗糖提高10-20%，使用该试剂解冻后解冻后可获得90%以上复苏率及85%以上的孵化率，胚胎移植妊娠率达到55%以上。使用该方法操作简便，易于在生产中应用推广的胚胎冷冻保存方法，可操作性强、操作方便、利于推广应用。
具体实施方式
一种楼来牛胚胎冷冻液，冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMSO；所述的各组分重量份数为乙二醇90-100、蔗糖45-60和DMSO80-100；所述的冷冻液还包括TCM-HEPES；配制时，将蔗糖溶解于TCM-HEPES中。
所述的乙二醇95-100、蔗糖50-55和DMSO85-95，所述的TCM-HEPES含20%FCS，所述的蔗糖浓度为25-30%。
所述的乙二醇90-95、蔗糖45-60和DMSO90-100，所述的蔗糖浓度为26-29%。
一种楼来牛胚胎冷冻方法，使用以上所述的乙二醇、蔗糖和DMSO冷冻，具体步骤如下：
（1）胚胎的获取，取第5～8天桑椹胚和囊胚；放入盛有保存液的培养皿中；筛选出优秀胚胎和优良胚胎；
（2）冷冻预处理，将筛选的胚胎在HM液洗涤2-5次后，移入至VS1液，停留1-3min后，再移入VS2液中，备用；所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES；所述的VS1是800μl HM 、100μl EG 和100μl DMSO；所述的VS2是600μl HM、200μl EG 和200μDMSO；
（3）胚胎装管，麦管先吸入2μlVS1液后，吸入空气泡，然后吸入步骤（2）中含有胚胎的VS2液后，继续吸入空气泡，最后以VS1液封存；
（4）胚胎冷冻，将步骤（3）装管的胚胎进行冷冻，在液氮面停留30-50s后浸入到液氮中冷冻。
所述的胚胎取自第6-8天桑椹胚和囊胚，所述的保存液是VS1和VS2，所述的培养皿直径为35mm。
所述的胚胎在HM液中洗涤2-3次，移入VS1液，停留时间1-2min。
一种楼来牛胚胎解冻方法，将以上冷冻的胚胎进行解冻，将麦管从液氮中取出，在空气中停留5-10s后，放入35-38℃水浴10-15s，将胚胎检出移到WM1液滴中后，移入含相同溶液的另一孔液滴中，再分别移入WM2和含HM为800μl /孔的液滴中， 每次停留时间均为5min；胚胎在培养液中洗涤三次后，在培养液中继续培养观察胚胎发育情况或者移植到已经同期发情处理的受体母牛；所述的WM1是HM800μl和SM400μl；所述的WM2是HM800μl+SM200μl；所述的SM液是含28.5%蔗糖(W/V)TCM-HEPES。
所述的培养液是WM1、WM2和HM，在空气中停留5-8s，放入35-36℃水浴10-12s。
实施例1
1、胚胎的获取
用非手术法对经超数排卵处理的供体牛进行冲胚，首先将供体牛固定在保定架内，在供体牛荐尾结合部硬鞘膜外腔内注射5%盐酸利多卡因（按牛的体重合理注射）麻醉后，进行冲胚（从子宫采集6～8天的桑椹胚或早期囊胚）。把盛有冲卵回收液的集卵杯放在体视显微镜下，由低倍到高倍，仔细观察，检出胚胎放入盛有保存液的φ35毫米培养皿中。
体视显微镜下进行质量鉴定，严格按照胚胎质量鉴定标准进行鉴定。将优秀、良好级胚胎进行冷冻。
2、胚胎预处理
将胚胎在HM液洗涤2次后，移入至VS1液中，停留1min后再移入VS2液中，所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES；所述的VS1是800μl HM 、100μl EG 和100μl DMSO；所述的VS2是600μl SM 、200μl EG 和200μDMSO；所述的SM液是含28.5%蔗糖(W/V)TCM-HEPES；。
3、胚胎装管，
麦管先吸入1-5μlVS1液后，吸入空气泡，然后吸入步骤2中含有胚胎的VS2液后，继续吸入空气泡，最后以VS1液封存。
4、胚胎冷冻
胚胎装管结束，立即浸入到液氮中冷冻，胚胎冻前停留在VS2液中的时间控制在30sec内。
5、胚胎的解冻
胚胎解冻时，将麦管从液氮中取出，在空气中停留5sec，然后放入35℃水浴10sec，随即将胚胎放入培养液中，胚胎在培养液中洗涤三次后，在培养液中继续培养观察胚胎发育情况或者移植到已经同期发情处理的受体母牛。
Claims (8)
1.一种楼来牛胚胎冷冻液，其特征在于，冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMSO；所述的各组分重量份数为乙二醇90-100、蔗糖45-60和DMSO80-100；所述的冷冻液还包括TCM-HEPES；配制时，将蔗糖溶解于TCM-HEPES中。
2.根据权利要求1所述的楼来牛胚胎冷冻液，其特征在于，所述的乙二醇95-100、蔗糖50-55和DMSO85-95，所述的TCM-HEPES含20%FCS，所述的蔗糖浓度为25-30%。
3.根据权利要求1所述的楼来牛胚胎冷冻液，其特征在于，所述的乙二醇90-95、蔗糖45-60和DMSO90-100，所述的蔗糖浓度为26-29%。
4.一种楼来牛胚胎冷冻方法，其特征在于，使用权利要求1所述的乙二醇、蔗糖和DMSO冷冻，具体步骤如下：
（1）胚胎的获取，取第5～8天桑椹胚和囊胚；放入盛有保存液的培养皿中；筛选出优秀胚胎和优良胚胎；
（2）冷冻预处理，将筛选的胚胎在HM液洗涤2-5次后，移入至VS1液，停留1-3min后，再移入VS2液中，备用；所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES；所述的VS1是800μl HM 、100μl EG 和100μl DMSO；所述的VS2是600μl HM、200μl EG 和200μDMSO；
（3）胚胎装管，麦管先吸入2μlVS1液后，吸入空气泡，然后吸入步骤（2）中含有胚胎的VS2液后，继续吸入空气泡，最后以VS1液封存；
（4）胚胎冷冻，将步骤（3）装管的胚胎进行冷冻，在液氮面停留30-50s后浸入到液氮中冷冻。
5.根据权利要求3所述的楼来牛胚胎冷冻方法，其特征在于，所述的胚胎取自第6-8天桑椹胚和囊胚，所述的保存液是VS1和VS2，所述的培养皿直径为35mm。
6.根据权利要求3所述的楼来牛胚胎冷冻方法，其特征在于，所述的胚胎在HM液中洗涤2-3次，移入VS1液，停留时间1-2min。
7.一种楼来牛胚胎解冻方法，其特征在于，将权利要求4冷冻的胚胎进行解冻，将麦管从液氮中取出，在空气中停留5-10s后，放入35-38℃水浴10-15s，将胚胎检出移到WM1液滴中后，移入含相同溶液的另一孔液滴中，再分别移入WM2和含HM为800μl /孔的液滴中， 每次停留时间均为5min；胚胎在培养液中洗涤三次后，在培养液中继续培养观察胚胎发育情况或者移植到已经同期发情处理的受体母牛；所述的WM1是HM800μl和SM400μl；所述的WM2是HM800μl+SM200μl；所述的SM液是含28.5%蔗糖(W/V)TCM-HEPES。
8.根据权利要求7所述的楼来牛胚胎解冻方法，其特征在于，所述的培养液是WM1、WM2和HM，在空气中停留5-8s，放入35-36℃水浴10-12s。
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