CN104195122B - Yep非特异性核酸酶、基因、载体、工程菌及应用 - Google Patents

Yep非特异性核酸酶、基因、载体、工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Yep非特异性核酸酶、基因、载体、工程菌及应用，所述Yep非特异性核酸酶，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明所述的Yep非特异性核酸酶能降解各类PCR扩增产物，单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA，且具有广泛的适用性：耐酸碱、耐冷热、耐化学物质，为该核酸酶的工业化应用打下基础。

Description

Yep非特异性核酸酶、基因、载体、工程菌及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种核酸酶，特别涉及一种Yep非特异性核酸酶、编码基因、载体、工程菌及应用。
(二)背景技术
核酸酶是以核酸为底物，催化磷酸二酯键水解的一类酶。核酸酶可以分为DNA酶、RNA酶和非特异性核酸酶三类，其中非特异性核酸酶是一类高活性的水解酶，能非特异性地降解几乎所有形式的核酸，包括单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA，且对核酸的序列没有要求。非特异性核酸酶具有许多重要功能，主要体现在以下许多方面：首先，在遗传机制方面，例如避免突变、DNA修复、DNA复制和重组、为生长代谢清除核苷和磷酸、防御外源核酸侵入、参与细胞凋亡等；其次，在疾病的诊断和治疗上，非特异性核酸酶参与细胞成熟、细胞凋亡、抗炎治疗、血管血栓及宿主防御等过程，表现出重要的应用价值；另外，非特异性核酸酶在工业上主要用于生物制品中外源核酸的去除，减少过敏反应，提高安全性。与此同时，非特异性核酸酶还能应用于研制新型的环保生物消毒剂，其能作用于细菌和病毒的遗传物质，裂解DNA或RNA，从而达到杀灭细菌和病毒的目的，与化学消毒剂相比，在理论上对机体无任何毒副作用，不污染环境，是一种理想的潜在的绿色环保抗病毒制剂。
目前，国内外使用的非特异性核酸酶主要来源于Merck公司的Benzonaseendonuclease，Benzonase核酸酶是来自Serratia marcescens，经基因工程改进的核酸内切酶，在广泛条件范围下都能保持很高的活性：在pH 6-10及0-42℃保持较高的活性；在1.0mM PMSF、1.0mM EDTA及尿素中保持活性。但该重组蛋白具有信号肽，部分以包涵体形式存在，复性困难，导致其价格昂贵，使其大规模应用受到限制。为此非常有必要开展非特异性核酸酶的相关研究工作。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种Yep非特异性核酸酶、编码基因、载体、工程菌及应用，替代现有非特异性核酸酶，降低成本，扩大了使用范围。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocoliticasubsp.Palearctica)(简称为Y.e.p或Yep)的Y.e.p非特异性核酸酶(或者Yep非特异性核酸酶)，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO：2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明涉及一种编码所述核酸酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO：1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
本发明还涉及一种含所述编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为在质粒PET24a(+)的Nde I和Xho I酶切位点插入SEQ ID NO:1所示核苷酸序列得到的重组表达载体PET24a-nuc。
本发明还提供一种由所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌命名为Escherichia coli BL21starTM(DE3)plysS-SL312，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2014年5月12日，保藏编号为CCTCC M 2014198，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明所述Y.e.p非特异性核酸酶编码基因在制备Y.e.p非特异性核酸酶中的应用，所述的应用为：构建含有所述Y.e.p非特异性核酸酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养(通常以IPTG为诱导剂)，培养液分离得到含有Y.e.p非特异性核酸酶的菌体细胞。
本发明涉及一种所述Y.e.p非特异性核酸酶在降解核酸中的应用，所述核酸为超螺旋DNA、线状双链DNA、线状单链DNA、环状单链DNA、或单链RNA的一种(见图1，图2)。
本发明所述Y.e.p非特异性核酸酶核苷酸序列的获取及高产菌株的构建，具体包括以下步骤：
(1)以Y.e.p基因组为模板，利用已知小肠肠炎耶尔森菌(Yersinia.enterocolitica subsp.Enterocolitica)(简称Y.e.e)非特异性核酸酶基因的保守序列设计简并引物，通过PCR技术扩增出包含Y.e.p非特异性核酸酶的基因片段，进行测序，得到Y.e.p非特异性核酸酶的核苷酸序列，如SEQID NO:1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(2)将Y.e.p非特异性核酸酶基因用Nde I和Xho I进行双酶切，并与同样双酶切的PET24a(+)连接，转化至大肠杆菌BL21starTM(DE3)plysS表达载体，构建基因工程菌，在培养基中加入IPTG诱导表达重组蛋白，即为本发明所述的含Y.e.p非特异性核酸酶的菌体细胞。
本发明所述Y.e.p非特异性核酸酶的酶学性质研究主要包括：用Ni-NTA resin亲和层析分离纯化Y.e.p非特异性核酸酶，以小牛胸腺DNA为底物，研究Y.e.p非特异性核酸酶的最适温度、最适pH和不同离子温度、pH、EDTA和SDS对其活性的影响。研究结果表明：Y.e.p非特异性核酸酶的最适温度为35-40℃；最适pH为7.0；对其酶活影响最大的离子为镁离子，其次为钡离子，钙离子、钠离子、铜离子，低浓度的铁离子、钾离子对其活性也有一定的影响；该酶耐热性较好，80℃处理5h后仍有25％左右的残余酶活；酶的酸碱稳定性较好，在酸性条件下，酶活基本不变，在pH 9.8的条件下处理5h后仍有83.3％的残余酶活；低浓度的EDTA和SDS对该酶的稳定性影响较小。
本发明提供了来源于Yersinia enterocolitica subsp.Palearctica(简称为Y.e.p)的非特异性核酸酶基因，并构建了Y.e.p非特异性核酸酶的高产菌株。Y.e.p非特异性核酸酶不仅具有非特异性，而且具有广泛的适用性，可以耐酸碱、耐冷热、耐化学物质，是一种理想的新型工业化核酸酶。
本发明所述的Y.e.p非特异性核酸酶能降解各类PCR扩增产物，单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA(参见实施例2-(2)底物特异性)，且具有广泛的适用性：耐酸碱(pH 3.8-9.8均有较高的酶活，在pH 3.8的缓冲液中保温5h后，酶活残留96％，在pH 9.8的缓冲溶液中保温5h后，酶活残留83％)、耐冷热(0-100℃均具有酶活，100℃保温5h仍有15％以上的残留酶活)、耐化学物质(120mM EDTA中放置5h残余酶活达87％，6M尿素中有酶活，100mM盐酸胍中保留5h酶活力残留95％)，为该核酸酶的工业化应用打下基础。
(四)附图说明
图1为Y.e.p非特异性核酸酶对含有不同金属离子的各种底物的凝胶电泳图，图中a-表示底物为双链线性DNA，b-表示底物为单链的线性DNA，c-表示底物为环状双链DNA，d-表示底物为RNA；字母a、b、c、d后的数字1-5分别表示：1表示金属离子为20mM MgCl2，2表示金属离子为20mM MnSO4，3表示金属离子为20mM CoCl2，4表示没有金属离子，5表示添加了2μl蒸馏水代替酶液。
图2为在Mg2+促进下Y.e.p非特异性核酸酶对各种底物的作用结果图，a-表示双链线性DNA，b-表示单链线性DNA，c-表示单链环状DNA，其中1表示加入酶液，2表示加入蒸馏水代替酶液。
图3为Y.e.p非特异性核酸酶酶液的SDS-PAGE凝胶电泳分析图(0：Marker，1：对照/空载体，2：未破碎之前的湿菌体，3：破碎后的沉淀，4：破碎后的上清，5：镍柱吸附1h后吸附液，6：洗脱液C的流出液，7：洗脱液D的流出液，8：洗脱液E的流出液)。
图4为Y.e.p非特异性核酸酶在不同温度下的电泳图。
图5为Y.e.p非特异性核酸酶在不同pH条件下的活性曲线图。
图6为Y.e.p非特异性核酸酶温度耐受性曲线图，A为37、50、65、80℃下随时间的变化曲线，B为100℃随时间的活力变化曲线(灰色、黑色和白色柱体分别表述3次平行)。
图7为Y.e.p非特异性核酸酶酸碱稳定性曲线图。
图8为EDTA对Y.e.p非特异性核酸酶稳定性影响的曲线图。
图9为SDS对Y.e.p非特异性核酸酶稳定性影响的凝胶电泳图，其中1:2.0mM，2:4.0mM，3:6.0mM，4:8.0mM，5:10mM，6:20mM，7:50mM，8:100mM，9:250mM，10:350mM，11:500mM，对照a：加入未经SDS处理的核酸酶，对照b：不加核酸酶。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1Y.e.p非特异性核酸酶核苷酸序列的获取及高产菌株的构建
1、Y.e.p非特异性核酸酶核苷酸序列的获取
利用已知Y.e.e非特异性核酸酶基因(基因登录号为YP_001007112)的侧翼序列，做同源分析，蛋白质序列比对，找到保守序列，设计简并引物，YE2923nuc1(5’-GCTACACAATCGATGTAAGCG-3’)和YE2923nuc2(5’-CGGTTTTCGTTGTTCCATTG ACT-3’)，以Y.e.p全基因组为模板，进行PCR扩增(扩增体系及条件同2.(1)中Y.e.p非特异性核酸酶基因的扩增)，获得包含Y.e.p非特异性核酸酶的基因片段，通过与已知Y.e.e非特异性核酸酶的序列比对，找出起始密码子和终止密码子，确定Y.e.p非特异性核酸酶的核苷酸序列，结果如SEQID NO:1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2、Y.e.p非特异性核酸酶高产菌株的构建
(1)Y.e.p非特异性核酸酶基因的扩增
根据Y.e.p非特异性核酸酶基因及载体pET24a(+)的序列特征设计引物，上游引物NucF含Nde1位点和6个组氨酸标签序列(5’-TTAATTATTCATATGTCCGCGCCCAAAACC-3’)，不扩增原始信号肽(1-23个氨基酸切除，总长为783bp)，下游引物NucR含Xho1位点(5’-AATATACTCGAGATCGCATCCAATTGT-3’)，Y.e.p非特异性核酸酶基因(SEQ ID NO:1所示)为模板，进行PCR扩增。20μl PCR反应体系为：DNA模板1.0μL，上游引物NucF(10μM)1.0μL，下游引物NucR(10μM)1.0μL，2×Taq PCR StarMix 10μL，ddH2O 7.0μL。PCR循环程序：94℃预变性2.0min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸5.0min。
(2)Y.e.p非特异性核酸酶基因的克隆
采用GenStar的StarPrep Gel Extraction Kit回收步骤(1)PCR扩增产物，经Nde1和Xho1双酶切，回收目的基因片段，与同样双酶切、去磷酸化、回收的表达载体pET24a(购自Novagen)经T4DNA连接酶连接。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a(购自Novagen)，将转化菌株接种在含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，随机挑取单菌落，37℃振摇培养12h，用GenStar的StarPrep Plasmid Miniprep Kit提取质粒，送上海桑尼测序鉴定，表明SEQ ID NO:1所示核苷酸序列已经重组至表达载体pET24a中，获得含Y.e.p非特异性核酸酶基因的大肠杆菌DH5a。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a的方法为：向100μlDH5a感受态细胞中加入10μl连接液，于无菌的离心管中混匀，冰上放置30min。开始转化实验，42℃水浴60s后冰浴2min，每管加入800μl LB培养基，37℃摇床培养1h。最后稍加离心，去上清，取100μl转化液涂布至含终浓度50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，倒置平板，37℃培养12-16h出现单菌落。
(3)Y.e.p非特异性核酸酶表达载体的构建
将上述鉴定正确的质粒转化到表达载体大肠杆菌BL21StarTM(DE3)PlySs(购自Novagen)中，挑取20个单菌落，转接于含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃培养24h，挑取菌落再转接于LB液体培养基，37℃培养5h，获得培养液，取培养液过滤，收集湿菌体用GenStar的StarPrep Plasmid Miniprep Kit提取质粒，测序。LB液体培养基质量浓度组成：酵母粉0.5％，胰蛋白胨1％，氯化钠1％，溶剂为水，自然pH；LB琼脂平板是在LB液体培养基加质量终浓度2％琼脂粉配制而成，自然pH。
(4)Y.e.p非特异性核酸酶的诱导表达
将步骤(3)序列鉴定正确(即含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列)的菌体接种至LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600约为0.8-1.0时，加入终浓度1.0mM的IPTG，37℃继续振荡培养22h，离心(4℃，8000rpm，5min)，收集沉淀，获得含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列编码Y.e.p非特异性核酸酶的菌体细胞。
(5)Y.e.p非特异性核酸酶的分离纯化
用变性剂(终浓度100mM NaH2PO4，终浓度8M尿素，溶剂10mMTris-HCl(pH 8.0))溶解步骤(4)制备的沉淀(即湿菌体)，振荡溶解至溶液澄清后，10000rpm离心25min，获得上清液和沉淀，分离出上清液进行Ni-NTA resin亲和层析(1cmNi柱，购自QIAGEN)，分别用洗脱液C(即终浓度100mM NaH2PO4，终浓度8M尿素，溶剂10mM Tris-HCl(pH6.3)，洗脱液体积8ml)、洗脱液D(即终浓度100mM NaH2PO4，终浓度8M尿素，溶剂10mM Tris-HCl(pH5.9)，洗脱液体积2ml)、洗脱液E(即终浓度100mM NaH2PO4，终浓度8M尿素，溶剂10mM Tris-HCl(pH4.5)，洗脱液体积2ml)各洗涤4次后(见图3)，收集洗脱液E的流出液，并用20mM Tris-HCl(pH 7.0，含终浓度20mM MgCl2)溶液稀释10倍，超滤3h(再生醋酸纤维素膜，孔径10KDa，压力0.02MPa)，收集滤液，获得纯酶液，即Y.e.p非特异性核酸酶酶液，保存于-20℃，用于酶学性质研究。
取样进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，经镍柱吸附1h后流出的流出液(图3中泳道5所示)、洗脱液C洗脱后收集的流出液(图3中泳道6所示)、洗脱液D洗脱后收集的流出液(图3中泳道7所示)、洗脱液E洗脱后收集的流出液(见图3中泳道8)。
对照：同时以不含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的空载体转化到表达载体大肠杆菌BL21StarTM(DE3)PlySs获得的转化体同样条件下培养获得的湿菌体作为对照(图3中泳道1所示)，步骤(4)制备的未破碎湿菌体(见图3中泳道2)，用pH 8.0的变性剂溶解步骤(4)制备的湿菌体后的沉淀(见图3中泳道3)，用pH 8.0的变性剂溶解步骤(4)制备的湿菌体后的上清液(见图3中泳道4)。
结果表明：Ni-NTA resin亲和层析柱分离效果很好，洗脱液E洗脱后得到纯度达到90％以上的蛋白。
实施例2Y.e.p非特异性核酸酶的酶学性质研究
(1)Y.e.p非特异性核酸酶的底物特异性
底物溶液终浓度组成为：100ng/μL的底物，20mM金属盐，溶剂为20mM Tris-HCl(pH7.0)，底物为不同形式的DNA[(环状双链DNA(质粒，plasmid)、环状单链DNA(λ-DNA)、线状双链dsDNA和线状单链ssDNA]及RNA，金属盐为分别为MgCl2、MnSO4、CoCl2。
在38μL底物溶液中加入2.0μL核酸酶稀释液(实施例1制备的Y.e.p非特异性核酸酶酶液用含终浓度20mM金属盐的20mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液稀释500倍)构成反应体系40μL，将此体系置于40℃条件下反应5min，加入8.0μL 6×Loading buffer(购自上海生工)终止反应，以加2.0μL蒸馏水替代核酸酶酶液作为对照。反应结束后，分别取反应液，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳测定酶活。
结果如图1，图中a-表示底物为双链线性DNA，b-表示底物为单链的线性DNA，c-表示底物为环状双链DNA，d-表示底物为RNA；字母a、b、c、d后的数字1-5分别表示：1表示金属离子为20mM MgCl2，2表示金属离子为20mM MnSO4，3表示金属离子为20mM CoCl2，4表示没有金属离子，5表示添加了2μl蒸馏水代替酶液；例如a1表示底物为双链线性DNA，金属离子为20mM MgCl2，其中a2表示底物为双链线性DNA，金属离子为20mM MnSO4，其中a3表示底物为双链线性DNA，金属离子为20mM CoCl2，其中a4表示底物为双链线性DNA，没有金属离子，其中a5表示底物为双链线性DNA，但添加了2μl蒸馏水代替酶液。
图2(a-表示双链线性DNA，b-表示单链线性DNA，c-表示单链环状DNA，其中1表示加入酶液，2-表示加入蒸馏水代替酶液)所示。表明Y.e.p非特异性核酸酶的作用底物非常广泛，能降解各种形式的DNA及RNA，金属盐MgCl2、MnSO4、CoCl2的存在能提高酶活，没有金属盐的存在，Y.e.p非特异性核酸酶扔具有酶活。
(2)Y.e.p非特异性核酸酶的最适温度
底物溶液终浓度组成为：100ng/μL小牛胸腺DNA(购自Sigma)，20mM MgCl2，溶剂为20mM Tris-HCl(pH 7.0)。
在38μL底物溶液中加入2.0μL核酸酶稀释液(实施例1制备的Y.e.p非特异性核酸酶酶液用含终浓度20mM MgCl2的20mM Tris-HCl(pH 7.0)稀释500倍)构成反应体系40μL，将此体系分别置于温度为0、4、22、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100℃条件下反应5min，分别加入8.0μL 6×Loading buffer(购自上海生工)终止反应，以加2.0μL蒸馏水替代核酸酶酶液作为对照。反应结束后，分别取反应液，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳测定酶活。结果如图4所示。Y.e.p非特异性核酸酶的最适温度为35-40℃，低温对酶活影响不大，55℃后随着温度升高酶活逐渐降低，温度越高，酶活损失越大。该核酸酶的作用范围为0-100℃。
(3)Y.e.p非特异性核酸酶的最适pH
配制不同pH的1.0M Tris-HCl缓冲液，pH梯度为：3.8、4.8、5.8、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.8、9.8共12个梯度。再用不同pH的Tris-HCl与小牛胸腺DNA，MgCl2配制成不同pH的底物溶液(底物溶液的终浓度组成：100ng/μL小牛胸腺DNA，20mM MgCl2，溶剂为20mMTris-HCl(不同pH))，并将实施例1制备的Y.e.p非特异性核酸酶酶液用含终浓度20mMMgCl2的20mM Tris-HCl(pH 7.0)稀释500倍。分别取2μL核酸酶稀释液与38μL底物溶液构成40μL反应体系，反应体系在40℃反应5min，分别加入8.0μL 6×Loading buffer终止反应。以加2.0μL的蒸馏水代替Y.e.p非特异性核酸酶酶液为对照。反应结束后，取反应液采用1.0％凝胶电泳测定酶活。结果如图5所示。该酶的最适pH为7.0，过酸或过碱条件下酶活均有酶活，pH 3.8-9.8对其酶活影响不大，残余酶活均在50％以上。该酶能在pH3.8-9.8范围内作用。
(4)Y.e.p非特异性核酸酶的离子依附性
底物溶液终浓度组成：100ng/μL小牛胸腺DNA，0.010～100mMMgCl2，溶剂为20mMTris-HCl(pH7.0)，MgCl2的终浓度分别为0.010、0.10、1.0、3.0、10、20、30、50、100mM。
分别用ZnCl2、BaCl2、CaCl2、NaCl、CuSO4、ZnSO4、MnSO4、NiSO4、CoCl2、KCl、FeCl2替代MgCl2制备不同的底物溶液。
将实施例1制备的Y.e.p非特异性核酸酶用含终浓度20mM MgCl2的20mM Tris-HCl(pH 7.0)稀释500倍，取2μL核酸酶稀释液与38μL上述不同底物溶液构成40μL反应体系，在40℃反应5min，向反应液中加入8.0μL 6×Loading buffer终止反应。以不加金属离子的底物溶液(即终浓度组成：100ng/μL小牛胸腺DNA，溶剂为20mM Tris-HCl(pH7.0))为对照。反应结束后，取反应液采用1.0％凝胶电泳测定酶活。结果如表1所示。MgCl2对核酸酶酶活有明显的激活作用，最佳浓度为10-50mM，BaCl210-20mM，CaCl2≤10mM，NaCl＜10mM，CuSO4≤3mM，MnSO40.1mM，NiSO4≤0.1mM，CoCl2≤0.1mM，KCl≤1mM，FeCl30.01mM对酶活均有激活作用，但KCl浓度大于1mM时，NaCl浓度大于20mM时就能完全抑制核酸酶的酶活。
表1Y.e.p非特异性核酸酶的离子依耐性
注：表1中+++表示DNA完全被降解了，++表示DNA被降解了一半，+表示DNA被降解了1/3-1/5，±表示DNA被降解了低于1/5，-+表示DNA被降解了低于1/10，-表示无降解现象，/表示加入离子后DNA变性了或是形成沉淀了。
实施例4Y.e.p非特异性核酸酶耐受性
(1)Y.e.p非特异性核酸酶的温度耐受性
将实施例1制备的Y.e.p非特异性核酸酶酶液10μL，分别置于温度37、50、65、80、100℃条件下，加热时间分别为10min、20min、30min、1h、2h、3h、5h，处理后核酸酶酶液稀释20倍(用含终浓度20mM MgCl2的20mM Tris-HCl(pH 7.0)稀释)。以小牛胸腺DNA为底物(底物以底物溶液的形式加入，38μL底物溶液终浓度组成：100ng/μL的小牛胸腺DNA，20mMMgCl2，100ng/μLDNA，溶剂为20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0))，加入2μL的核酸酶稀释液，构成反应体系40μL，在40℃反应5min，向反应液中加入8.0μL 6×Loading buffer终止反应。以加2.0μL的蒸馏水替代核酸酶稀释液为对照。反应结束后，取反应液用1.0％琼脂糖凝胶电泳测定酶活。结果如图6中A所示。该酶在37℃下很稳定，随着温度升高稳定性逐渐降低，50℃保温5h，酶活仍残留70％左右，80℃保温2h，酶活残留60％，保温5h酶活残留20％以上，100℃保温5h仍有15％以上的残留酶活(如图6中B所示)。
(2)Y.e.p非特异性核酸酶的酸碱稳定性
将实施例1制备的Y.e.p非特异性核酸酶酶液分别用浓度为40mM的不同pH的Tris-HCl缓冲液(3.8、6.4、6.8、7.0、7.2、7.6、7.8、9.8)稀释2倍制成核酸酶稀释液。置于37℃保温不同时间，时间梯度为：30min、1h、2h、3h、4h、5h，获得保温处理后的核酸酶稀释液。将保温后的核酸酶稀释液再稀释250倍(用含终浓度20mM MgCl2的20mMTris-HCl(pH 7.0)稀释)制成核酸酶溶液，取2.0μL核酸酶溶液与38μL底物溶液(底物溶液终浓度组成：20mM MgCl2，100ng/μLDNA，溶剂为20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0))构成40μL的反应体系，将反应体系在40℃下反应5min，加入8.0μL 6×Loading buffer终止反应。以加2.0μL的蒸馏水为对照。反应结束后，取反应液用1.0％琼脂糖凝胶电泳测定酶活。结果如图7所示。在pH 3.8-9.8范围内稳定性较好，pH 7.0稳定性最好，保温5h，酶活残留100％，pH 3.8保温5h后，酶活残留96％，在pH9.8保温5h后，酶活残留83％；以上说明该酶的热稳定性及酸碱稳定性相当好。Y.e.p非特异性核酸酶耐酸碱范围为(3.8-9.8)。
(3)EDTA对Y.e.p非特异性核酸酶稳定性的影响
在20mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，分别添加EDTA，其终浓度为2，4，6，8，10，20，40，60，80，100，120mM，制成不同浓度的EDTA缓冲液。分别用EDTA缓冲液将实施例1制备的Y.e.p非特异性核酸酶酶液稀释2倍制成核酸酶稀释液，以未添加EDTA的20mMTris-HCl(pH7.0)缓冲液为对照，将各个浓度下的核酸酶稀释液在37℃分别放置1、2、3、4、5h，获得预处理后的核酸酶稀释液，再用20mMTris-HCl(pH 7.0)将预处理后的核酸酶稀释液稀释100倍制成核酸酶溶液，取2.0μL核酸酶溶液与38μL底物溶液(底物溶液终浓度组成为：20mMMgCl2，100ng/μLDNA，溶剂为20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0))构成40μL反应体系，将反应体系在40℃反应5min，加入8.0μL 6×Loading buffer终止反应。以加2.0μL的蒸馏水为对照。反应结束后，取反应液用1.0％琼脂糖凝胶电泳测定酶活。结果如图8所示。该酶在低浓度EDTA中稳定性较好，在120mM的EDTA溶液中保温5h后，残余酶活约为85％。
(4)SDS对Y.e.p非特异性核酸酶稳定性的影响
在20mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，分别添加SDS，其终浓度为2，4，6，8，10，20，50，100，250，350，500mM，制成SDS缓冲液。用SDS缓冲液将实施例1制备的Y.e.p非特异性核酸酶酶液稀释2倍制成核酸酶稀释液，以未添加SDS的20mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液为对照，将核酸酶稀释液及对照在37℃放置1h进行预处理，再用20mMTris-HCl(pH 7.0)将预处理后的核酸酶稀释液稀释100倍，制成核酸酶溶液。取2.0μL核酸酶溶液与38μL底物溶液(底物溶液终浓度组成为：20mMMgCl2，100ng/μLDNA，溶剂为20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0))构成40μL的反应体系，将反应体系在40℃反应5min，加入8.0μL 6×Loading buffer终止反应。以加2.0μL的蒸馏水为对照。反应结束后，取反应液用1.0％琼脂糖凝胶电泳测定酶活。结果如图9所示。2-8mM浓度内的SDS对该酶的稳定性影响不大，而随着浓度的增加，其稳定性逐渐降低，SDS浓度高于20mM后，酶稳定性明显下降，500mM以上时，SDS甚至可以完全抑制该酶的酶活。

Claims (8)

1.一种Yep非特异性核酸酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种编码权利要求1所述核酸酶的基因。
3.如权利要求2所述编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种含权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
5.如权利要求4所述重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在质粒PET24a(+)的Nde I和Xho I酶切位点插入SEQ ID NO:1所示核苷酸序列得到的重组表达载体PET24a-nuc。
6.一种由权利要求4所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2014年5月12日，保藏编号为CCTCC NO：M2014198，保藏地址为中国武汉武汉大学。
7.一种权利要求1所述Yep非特异性核酸酶在降解核酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述核酸为超螺旋DNA、线状双链DNA、线状单链DNA、环状单链DNA或单链RNA的一种。
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