CN102301009A - 使用酶在dna中产生随机双链断裂 - Google Patents
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Abstract
描述了包括单位比率小于1∶200的非特异性核酸酶和T7 EndoI突变体的酶制剂。这种酶制剂可用于大小具有适合DNA测序的双链DNA片段。所述片段的末端可以根据需要容易地被修饰,以将连接物或者单独的核苷酸与双链DAN片段的一条链连接。
Description
背景技术
将基因组DNA断裂成较小的不同大小的片段是在许多测序技术中重要的步骤。目前机械断裂方法,例如超声处理、自适应-聚焦声法(adaptive-focused acoustics)或者雾化,没有碱基切割偏好地产生DNA片段。但是这些方法,具有在非磷酸二酯键的地方破坏DNA的可能性,且与酶方法相比具有较低的DNA回收效率。另一方面,酶方法,例如依靠具有特定识别序列的限制性内切核酸酶的那些,产生固定的特定大小的片段,其依赖于识别序列出现的频率是可大或可小的。迄今为止,对于非特异性核酸酶的研究已经显示尽管识别和切割不需要非特异性序列,但是这些酶显示出对于在切割位点的某些碱基的偏好(Anderson Nucleic Acids Res.9(13):3015-27(1981);Herrera和ChairesJ.Mol.Biol.236(2):405-11(1994))。
发明简述
在本发明的一种实施方式中,提供了包括小于1∶200单位比率的非特异性核酸酶和T7Endo I突变体的制剂。在一种实施例中,非特异性核酸酶是一种嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus)(Vvn)核酸酶,其在Q69具有突变。
在本发明的另一种实施方式中,提供了从大的DNA产生适合测序的片段的方法,其包括将感兴趣的DNA与包含小于1∶200单位比率的非特异性核酸酶和T7 Endo I突变体的制剂混合。大DNA被切割成大小适合测序的片段。正如上所述,在方法中使用的非特异性核酸酶的例子是Vvn核酸酶,更具体地是具有增强比活的Vvn核酸酶突变体,如在Q69的突变。大DNA的片段可包含一个或者两个平端并可以被进一步修饰以与测序DNA使用类型的连接物(adapter)连接。
附图简述
图1显示使用麦芽糖-结合蛋白(MBP)-T7 Endo I突变体和MBP-Vvn组合的DNA断裂。CB4是2体积MBP-T7 Endo I突变体(PA/A)(0.13单位/μl)和1体积MBP-Vvn(0.14单位/μl)的混合物。每条泳道代表30μl反应,其中5μg基因组DNA(如在泳道的上方所指示)与3μl CB4在37℃下温育。每个反应在30分钟、60分钟和90分钟时间间隔后用15mM EDTA停止。DNA片段被乙醇沉淀和接着风干。DNA沉淀物在50μl 1×凝胶加样染料——橙色(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs,Inc.),(NEB),Ipswich,MA,NEB#B7022)中再悬浮并加样在2%琼脂糖凝胶上。框指示大约100-200bps的片段。
图1A显示来自海拉(宫颈腺癌)细胞、大肠杆菌(E.coli)和CpG海拉细胞(NEB#4007)的基因组DNA的断裂。
图1B显示来自鲱鱼(Herring)精子、λ噬菌体和Jurkat(人急性T-细胞白血病)细胞基因组DNA的断裂。
图2显示与两个DNA梯序列M1——2-对数DNA梯序列(NEB#N3200,Ipswich,MA)和M2——NEB PCR标记物(NEB #N3234,Ipswich,MA)比较,用CB4混合物产生的DNA片段。建立7种反应并包含3μl CB4混合物和5μg DNA梯序列(NEB#N3231)的每50μl反应物在37℃下温育不同时间,随后用15mM EDTA以0、5、10、20、40、80和160分钟时间间隔终止。片段加样在1%琼脂糖凝胶上。
图3A-3B显示从30μl反应物中的1μg λDNA,在37℃下、30分钟使用核酸酶:MBP-Vvn核酸酶(野生型(WT))或者MBP-Vvn核酸酶(Q69S)的连续稀释产生DNA片段。
图3A:泳道M是NEB(Ipswich,MA)PCR标记物(#N3234);泳道1-9是在泳道1中的2μg MBP-Vvn核酸酶(野生型)起始的连续2倍稀释(稀释缓冲液:20mM Tris-HCl(pH7.5)、50mM NaCl、0.15%TritonX-100和0.1μg/ml BSA)。泳道3中使用的酶的量定义为一个凝胶单位,其中90%DNA片段小于150bp。
图3B:泳道M是NEB(Ipswich,MA)PCR标记物(#3234);泳道1-9是在泳道1中的1.5μg MBP-Vvn酶(突变体)起始的连续2倍稀释(稀释缓冲液如上)。泳道6中使用的酶的量定义为一个凝胶单位。
图4显示对与由MBP-T7 Endo I突变体和MBP-Vvn核酸酶(Q69S)(CB4v2)组成的混合物使用不同温育时间产生的DNA片段。CB4v2是2体积MBP-T7 EndoI突变体(0.16单位/μl)和1体积MBP-Vvn核酸酶(Q69S)(0.048TCA单位/μl)的混合物。
每个泳道代表在37℃下与相同量的3μl CB4v2混合物一起温育的具有5μg不同基因组DNA(如在泳道上方所指示)的50μl反应物。每个反应在30分钟、60分钟和90分钟时间间隔后用15mM EDTA停止。DNA片段被乙醇沉淀和接着风干。DNA沉淀物在50μl 1×凝胶加样染料——橙色(NEB#B7022,Ipswich,MA)中再悬浮并加样在2%琼脂糖凝胶上。框指示大约150bp片段。
图5显示Vvn核酸酶(Q69S)突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。氨基酸序列从19位开始,由于信号肽(1-18)没有克隆在MBP-Vvn核酸内切酶(Q69S)构建物中。“*”指示Q突变成S的69位。
图6A和6B显示在分开的反应容器中使用许多不同核酸内切酶、然后断裂产物合并(图6A)和在相同反应容器中一起使用两种核酸内切酶(图6B)在时间范围上的比较。M是2-对数DNA梯序列和C是未消化的pUC19。“-N-”指示其中pUC19的带切口形式迁移。“-L-”指示其中pUC19的线性形式迁移。“-S-”指示其中pUC19的超螺形式迁移。
图6A显示分别使用产生切口酶MBP-Vvn核酸内切酶(Q69S)和MBP-T7Endo I突变体的随机双链切割。8μg pUC19与1.376TCA单位MBP-Vvn核酸内切酶在480μl反应中温育。在另一个新管中,8μgpUC19与5.6单位MBP-T7 Endo I突变体在480μl反应中温育。样品在37℃下温育。在0、5、10、15、20、30、40、和60分钟时,从每个温育混合物中移出30μl,且通过添加EDTA(终浓度15mM)使反应停止。具有相同温育时间的样品集中在一起并加样在对应于温育时间0至60分钟的从1至8泳道的0.8%琼脂糖凝胶上。
图6B显示一起使用MBP-T7Endo I突变体和MBP-Vvn核酸内切酶核酸内切酶(Q69S)的随机双链切割。16μg pUC与1.376T.C.A.单位/μl的MBP-Vvn核酸内切酶(Q69S)和5.6单位/μlMBP-T7 Endo I突变体(CB4V2)在480μl反应中温育。样品在37℃下温育。在0、5、10、15、20、30、40、和60分钟时,从每个温育混合物中移出60μl,且通过添加EDTA(终浓度15mM)使反应停止。样品加样在对应于温育时间0至60分钟的从1至8泳道的0.8%琼脂糖凝胶上。发现了MBP-T7 Endo I突变体和产生切口酶MBP-Vvn核酸内切酶(Q69S)对随机DNA片段产生的协同作用。
图7显示为核酸酶混合物确定合适单位比率的滴定。通过凝胶电泳确定T7 Endo I突变体对现有切口位点的特异性切割。连续2倍稀释酶且单个单位被定义为能够将90%底物转换成2个片段的酶量。从最浓(泳道1)到最稀(泳道9)显示连续稀释。T7内切酶突变体对现有切口位点——其在上述底物制备时由BsaI/Nt.BstNBI产生——的特异性切割将线性切口2.44Kb双链DNA(dsDNA)转化成2个片段(1.37Kb和1.07Kb)。因此,1单位T7核酸内切酶突变体被定义为用在20μl反应物中包含5单位E.coli连接酶、60μMNAD/20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、0.15%Triton X-100和50mM NaCl的缓冲液,在37℃下1个小时将90%(如在泳道5中所示)的2μg线性切口的2.44kb的dsDNA转化成2个片段(1.37kb和1.07kb)所需要的酶的量。泳道“M”是2-对数DNA梯序列(NEB,Ipswich,MA,#3200)。
图8显示与包含核酸内切酶混合物的产品一起运送的数据卡片。
实施方式详述
在本发明的实施方式中,提供组合物和方法,其依靠制剂中的酶混合物,产生具有大约均一大小——其中均一大小可根据需要而预先确定并通过例如,改变温育时间产生——双链DNA片段。与单独的非特异性核酸酶切割反应相比,酶制剂通过包括抵消-切口(counter-nicking)活性减少dsDNA片段中非生产性切口的数量。抵消-切口允许产生确定长度的突出端,其在正常解离条件下会解离,且其能修复成平端以用于随后的操作。修复可涉及回切(chewing back)3’突出端或者通过聚合酶的方式合成5’突出端的互补序列。具有平端或者单个核酸突出端的连接物可接着与修饰的片段连接。这些片段可接着用于各种测序平台。
现有技术中随机断裂方法产生突出端,但是这些是非离散大小的并至少产生两个问题。第一,因为解链温度取决于突出端的长度和碱基组成,末端的解离不均一。第二,存在超出片段解离需要的过多切口是在随后步骤中——包括扩增和/或者实际测序反应——需要的聚合作用的阻碍。涉及模板物理一致性的测序平台也会受到影响。
在本发明的一种实施方式中,制剂包含非特异性核酸酶和T7核酸内切酶I或其突变体。尽管可使用对于切割AT或者GC碱基对有偏好的核酸酶,但是优选地选择对于GC或者AT没有明显偏好的核酸酶。属于后者范畴的核酸酶的例子获得自嗜盐弧菌(Vvn)(GI:2625684 Wu,等人,Appl Environ Microbiol 67(1):82-8(2001)。
其它可在制剂中利用的细胞外核酸酶包括来自霍乱弧菌(Vibriocholera)的Dns(Focareta and Manning Gene 53(1):31-40(1987);来自菊欧文菌(Erwinia chrysanthemi)的NucM(Moulard,等人,Mol Microbiol8(4):685-95(1993);来自大肠杆菌(E.coli)的Endo I(Jekel,et al Gene154(1):55-59(1995);来自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的Dns和DnsH(Chang等人,Gene 122(1):175-80(1992)和Dodd,等人,FEMS Microbiol Lett 173(1):41-6(1999);Wang,等人,Nucleic AcidsRes 35:584-94(2007);和Wang,等人,Nucleic Acid Res.35:584-594(2007))。
这里显示核酸酶的突变能导致提高的比活。例如,Vvn核酸内切酶的Q69突变产生具有增强比活的核酸酶。具体地,实施例利用Q69S。发现例如当基因与MBP的基因结合产生在周质空间中积聚的融合蛋白以改进突变体核酸内切酶突变体回收时,在宿主细胞中容易产生突变体核酸酶。
包含非特异性核酸的酶制剂添加T7 Endo I突变体对于具有期望性质的片段的产生具有重要的有益效果。在T7 Endo I突变体存在的情况下,由于它抵消-切口的活性,通过在变性条件下产生不同大小片段的非特异性核酸酶产生的切口有效地消失。抵消-切口活性产生具有末端的片段,其能容易地从切口位点优选地解离8个或者更少的核苷酸。酶混合物对于dsDNA的其它有益效果包括产生DNA片段,其具有可预知的突出端倾向(disposition)和长度,其适合于修复或者移除以允许连接有时候DNA测序平台需要的连接物。
在本发明的另一种实施方式中,许多核酸酶组合在反应混合物中,其中至少一种核酸酶是在任一条链上能够在整条DNA引入随机切口的类型和第二种核酸酶能够在该第一个切口的紧邻处抵消-切口,但是在DNA双螺旋的相对链上,因此,导致双链DNA断裂。
分别使用源自弧菌的非特异性核酸酶和在美国公开号2007-0042379中描述类型的突变体T7 Endo I,例如,在桥接区具有突变的T7 Endo I证实这种方法。预测酶片段沿着基因组分布。
使用上述酶制剂将质粒DNA和不同类型的基因组DNA(gDNA)酶切成大小适合测序方法的DNA片段。在DNA断裂后,DNA片段进行凝胶分离和处理用于下一代测序。
实施例2提供的试验可用于为任何具体DNA、选择的温育时间确定核酸酶合适的量,或者为所选择的核酸酶的比率确定合适的温育时间。
两种核酸酶(切口核酸内切酶比如Vvn核酸内切酶突变体∶抵消-切口核酸酶比如T7 Endo I突变体)的单位比率优选地小于1∶200例如,小于1∶100,例如,小于1∶10。范围可以是1∶2到1∶200。
1个单位T7 Endo I或者其突变体定义为在37℃下1个小时将90%的2μg线性切口的2.44kb的dsDNA转化成2个片段(1.37kb和1.07kb)所需要的酶的量。
1个单位Vvn核酸酶和其突变体定义为在37℃下30分钟释放1A260单位的酸性可溶寡核苷酸所需要的酶的量。
在本发明的一种实施方式中,根据DNA是否落在大于60%(高GC含量)、40%-60%GC(标准GC含量)、或者小于40%GC(低GC含量)的范围内可测定DNA断裂反应的最佳温育时间。例如,温育时间范围可典型地在10分钟至120分钟,例如,15分钟至60分钟范围内。
本文引用的所有参考文献,以及2009年2月3日提交的美国临时申请号61/149,675、2009年3月10日提交的61/158,815和2009年8月31日提交的61/275,531,通过引用并入本文。
实施例
“大”等同于具有为了测序需要断裂的大小的DNA。
T7 Endo I突变体指在两个催化结构域之间的桥接区具有突变的T7 Endo I。
MBP-T7 Endo I突变体与T7 Endo I起同样的作用。
MBP-Vvn核酸酶(WT或者突变体)与Vvn核酸酶(WT或者突变体)起同样的作用。
非特异性核酸酶指不识别特定DNA序列的任何DNA核酸酶。DNA序列至少由2个确定顺序的核苷酸组成。这不包括识别特定DNA序列的限制性核酸内切酶。
实施例1:包含Vvn或其突变体的酶混合物的制备
化学合成来自Vvn的编码周质核酸酶的基因。Vvn基因——缺少它的信号肽,对应于图5的氨基酸19至231(SEQ ID NO:5)。它使用一对引物1(5’-AAGGTTGAATTCGCGCCACCTAGCTCCTTCTCTGCC-3’)(SEQ ID NO:1)和2(5’-GGTAGAGGATCCTTATTGAGTTTGACAGGATTGC TG-3’)(SEQID NO:2)通过PCR扩增合成且片段克隆在pMALp4x载体(NEB,Ipswich,MA,#N8104)的EcoRI和BamHI之间。融合蛋白MBP-Vvn核酸内切酶在大肠杆菌的周质腔隙中表达并通过直链淀粉亲和柱纯化至同质性。MBP-Vvn核酸酶(WT)通过肝素柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)进一步纯化。通过Bradford试验(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)测定蛋白浓度。
产生突变体MBP-Vvn核酸内切酶(Q69S),其比MBP-Vvn核酸内切酶(WT)具有大5-10倍的比活(图4A-4B)。为产生MBP-Vvn核酸内切酶(Q69S)突变体,使用引物3(5’-CAAGTACGCAAAAGCCAAACTCGCGCAT CG-3’)(SEQ ID NO:3)和2(SEQ ID NO:2)以扩增Vvn基因的C末端部分,而使用引物1(SEQ ID NO:1)和引物4(5’-TGCGCGAGTTTGGCTTTTGCGTA CTTGGTA-3’)(SEQ ID NO:4)以扩增Vvn基因不包括信号肽序列的N末端部分。混合来自每个反应的PCR片段并使用引物1(SEQ ID NO:1)和2(SEQ ID NO:2)从完整的Vvn基因中再扩增。PCR产物用EcoRI和BamHI切割,接着为了蛋白表达的目的将其克隆入用相同的酶切割的pMAL-p4x载体。Vvn突变体核酸内切酶(Q69S)氨基酸序列示于图5中。融合蛋白MBP-Vvn核酸内切酶(Q69S)在E.coli的周质中表达并通过直链淀粉亲和柱纯化至同质性。通过Bradford试验(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)测定蛋白浓度。当Vvn突变体核酸内切酶与T7Endo I突变体(CB4v2)组合时,发现混合物以时间-依赖的方式有效地断裂不同来源和大小的基因组DNA(图4A和4B)。
实施例2:确定混合物中酶的单位比率
(a)确定T7 Endo I突变体活性
为了制备具有特异性切口位点的线性dsDNA,利用pNB1(2.44Kb)。pNB1是具有单个Nt.BstNBI和BsaI切割位点的质粒。用BasI切割使质粒线性化,而Nt.BstNBI在其识别位点引入位点-特定切口。质粒pNB1在50℃下用Nt.BstNBI和BsaI限制性酶消化1个小时。然后,添加小牛小肠碱性磷酸酶到线性-切口dsDNA中并在37℃下温育1个小时。这种处理防止在随后的试验中E.coli连接酶封闭Nt.BstNBI切口。使用Qiagen柱(Valencia,CA)将断裂的dsDNA与相关酶分离。
用T7 Endo I突变体处理断裂的pNBI DNA,在大约Nt.BstNBI切口的对面将抵消-切口引入DNA链以产生2个片段(1.37kb和1.07kb)(见图7)。1单位T7 Endo I突变体定义为使用包含5单位大肠杆菌连接酶、60μM NAD、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、0.15%TritonX-100和50mM NaCl的缓冲液在37℃下1个小时将2μg的2.44kb线性-切口dsDNA的90%转化成2个片段(1.37kb和1.07kb)所需的酶的量。图7的泳道5显示满足该限定的反应。
(b)确定突变体Vvn核酸内切酶的活性
超声处理的小牛胸腺基因组DNA用作底物以测定测定Vvn核酸内切酶的活性。5μlVvn核酸内切酶突变体在37℃下添加到3ml包含20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、0.15%Triton X-100、50mMNaCl、超声处理小牛胸腺gDNA(3mg)和BSA(0.1mg/ml)的反应混合物中,并继续在37℃下温育。移出500μl的反应混合物且核酸内切酶的活性用500μl 5%的TCA在10、20、30、40和50分钟时间间隔之后停止。这些TCA-猝灭的样品在冰上温育1个小时并在14000rpm下离心15分钟以沉淀完整的DNA。小心地从每管移出上清液并测量上清液在260nm的吸光度。1单位Vvn核酸内切酶突变体定义为在37℃下30分钟内释放1 A260单位酸性可溶寡核苷酸所需的酶的量。
(c)确定突变体Vvn核酸内切酶的和突变体T7 Endo I在核酸酶混合物中的单位比率
期望量的Vvn核酸酶和T7 Endo I突变体以各种比率在10mMTris-HCl(pH 7.5)、50mM NaCl、0.1mM EDTA、200μg/ml BSA和50%甘油的贮存缓冲液中组合。DNA断裂缓冲液包含20mM Tris-HCl(pH7.5)、50mM NaCl、10mM MgCl2、0.15%Triton X-100和0.1mg/mlBSA。
为了确定两种核酸内切酶合适的比率,利用TCA试验在其它类似反应条件下,一种核酸内切酶保持常量而另一种核酸酶改变浓度。
在这里所说明的核酸酶混合物中,MBP-T7 Endo I突变体:MBP-Vvn核酸内切酶(Q69S)突变体的单位比率大约是3∶1。当单位比率降低至2∶1时,DNA降解速度降低50%,如通过上述TCA试验所确定的。但是,当比率增加至8∶1时,速度仅增加14%。
实施例3:核酸酶与T7 Endo I突变体的组合在酶混合物中的协同作用
显示CB4以时间-依赖方式断裂不同来源和不同大小的基因组DNA(图2)。CB4是2体积MBP-T7 Endo I突变体(PA/A)(0.26mg/ml)和1体积MBP-Vvn(WT)(0.2mg/ml)的混合物。CB4也将100-1500bps大小的小片段的混合物转化成大小适合几种目前下一代测序平台的100至150bp的片段(图2)。
MBP-Vvn核酸酶(Q69S)和MBP-T7 Endo I突变体在混合物中协同作用以产生小的双链DNA片段。图6A和6B显示随温育时间增加用MBP-Vvn核酸酶(Q69S)或者MBP-T7 Endo I PA/A处理质粒如何导致切口环状DNA积聚增加,然后形成线性质粒和将该DNA降解成较小的片段。但是,当2种酶在同一反应混合物中存在时,与用相同浓度的单个酶所观察的(图6A)相比,超螺旋质粒转化成开环或者线性DNA及其降解大大增加(图6B)。例如,在组合样品中泳道6(即,图6B)没有离散的超螺旋、切口和线性质粒,而用与单个酶温育之后存在至少切口和线性质粒的大量剩余物(图6A,泳道6)。
任何具体DNA的期望的降解是起始DNA的大小、期望片段的大小和与混合物中选择比率的核酸酶的温育时间的函数。
Claims (8)
1.制剂,其包括:小于1∶200单位比率的非特异性核酸酶和T7Endo I突变体。
2.根据权利要1所述的制剂,其中非特异性核酸酶是Vvn核酸酶。
3.根据权利要求1或2所述的制剂,其中所述Vvn核酸酶在Q69具有突变。
4.从大的双链DNA产生适合测序的片段的方法,其包括:
(a)将大的DNA与根据权利要求1所述的制剂混合;和
(b)将所述大的DNA切割成大小适合测序的片段。
5.根据权利要求4所述的方法,其中非特异性核酸酶是Vvn核酸酶。
6.根据权利要求4或者5所述的方法,其中所述Vvn核酸酶在Q69具有突变。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法,还包括:在由(b)中切割产生的片段上产生平端。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法,还包括:将具有平端或者单核苷酸突出端的连接物与所述片段的一端或者两端连接。
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