CN104195086B - 一种用于五种细菌的复合增菌培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌培养基及其制备方法,该培养基组分包括:牛脑浸出粉5‑10份,牛心浸出粉5‑15份,蛋白胨5‑15份,氯化钠2.5‑7.5份,葡萄糖1‑3份,磷酸氢二钠1.5‑3.5份,甘露醇1‑3份,丙酮酸钠1‑3份,甘氨酸1‑3份,七叶苷1‑3份,蒸馏水1000份,pH值为7.2‑7.5。制备方法包括:按照配方将各成分加入蒸馏水中,搅拌溶解,调节pH值,高压灭菌。五种细菌是我国食品卫生标准中需检测的主要致病菌。使用本发明所述复合增菌培养基,能够实现五种致病菌的快速增殖。增菌16小时,菌体浓度可由1 CFU/mL增至106 CFU/mL~109 CFU/mL,可直接用于多重PCR、基因芯片、微流控芯片等高通量检测,完成上述五种病原菌的筛查。
Description
技术领域
本发明属于致病菌的前增菌培养基,特别是涉及到一种同时对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌的培养基及其制备方法。
背景技术
食源性致病菌是食物中毒和食源性疾病暴发的重要因素,是食品安全的重要风险隐患。据世界卫生组织(World Health
Organization, WHO)报道,全球每年发生腹泻病的病例数高达1.5亿,其中70%病例与各种致病性微生物污染的食品有关。我国研究资料显示,微生物病原引起的食源性疾病占46.4%,严重危及人们的健康,造成重大经济损失。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌是食源性疾病的主要致病菌,是食品安全风险预测和危害评估中重要监测项目。
目前我国食品安全标准检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌时,需要经过前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定、和血清学鉴定等步骤。培养基品种繁多,操作麻烦,工作量大,耗时长,无法满足现代检测快速、高通量的要求,给食品生产企业和质检单位造成较大压力。所以在食品安全问题日益被人们所重视的今天,研制出满足快速检测的多种致病菌复合增菌培养基迫在眉睫。
关于多种致病菌复合增菌培养基的研究,近年来已受到国内外研究人员的广泛关注。Hyochin等研制的选择性营养肉汤( SEL),可同时富集沙门氏菌、大肠埃希氏菌和单增李斯特菌,当接种量为102CFU/mL,经过12h复合培养后,菌体浓度可达到106~108CFU/mL,可直接应用于多重PCR扩增(Hyochin Kim and Arun
K. Bhunia.SEL, a Selective Enrichment Broth for Simultaneous Growth of
Salmonella enterica, Escherichia coliO157H7, and Listeria monocytogenes[J].Applied
and Environmental Microbiology,2008,74(15):4853-4866. );翁思聪等研制的选择性增菌肉汤( SSSV),可同时富集沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌,当接种量为102CFU/mL,经过8h复合培养后,菌体浓度可达到105~106CFU/mL,可直接应用于多重PCR扩增(翁思聪,朱军莉,冯立芳,励建荣.1
种选择性富集沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌共增菌培养基SSSV研究[J].中国食品学报2013,13(1):19-28.);刘园园等研制的选择性增菌肉汤( SSL), 可同时培养沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌,当接种量为102CFU/mL,经过24h复合培养后,菌体浓度可达到107~108CFU/mL,可直接应用于荧光PCR扩增(刘园园,肖性龙,余以刚,陈谷,李晓凤,唐语谦,吴晖.一种能同时富集沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的培养基[J]. 微生物学报, 2009,49 (10) :1389 – 1396.)。此外,还有UPB(通用预增菌肉汤)、BPW(缓冲蛋白胨水)、NB(营养肉汤)等通用培养基,可同时增殖多种细菌,但还没有适用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌五种致病菌且组分简单、制备简便的复合增菌培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时培养沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌的培养基,适用于多重PCR、基因芯片、微流控芯片等高通量检测,用于所述五种病原菌的筛查。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
一种沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌培养基,以质量份数计,其原料配方组成为:牛脑浸出粉5-10份,牛心浸出粉5-15份,蛋白胨5-15份,氯化钠2.5-7.5份,葡萄糖1-3份,磷酸氢二钠1.5-3.5份,甘露醇1-3份,丙酮酸钠1-3份,甘氨酸1-3份,七叶苷1-3份,蒸馏水1000份,pH值为7.2-7.5。
一种沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌培养基,以质量份数计,其优选配方为:牛脑浸出粉7.5份,牛心浸出粉10份,蛋白胨10份,氯化钠5份,葡萄糖2份,磷酸氢二钠2.5份,甘露醇2份,丙酮酸钠2份,甘氨酸2份,七叶苷2份,蒸馏水1000份,pH值为7.4。
本发明的又一个目的是提供一种沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌培养基的制备方法,所述方法由以下步骤组成:
(1)按照配方将牛脑浸出粉、牛心浸出粉、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠、甘露醇、丙酮酸钠、甘氨酸和七叶苷加至蒸馏水中,搅拌溶解;
(2)用10 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2-7.5;
(3)121℃高压灭菌15-20min,4℃保存。
本发明提供一种沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌菌复合增菌培养基及其制备方法,所述五种细菌在该复合培养基中,能够实现同时快速增殖。增菌16小时,菌体浓度可由1 CFU/mL增至106
CFU/mL~109 CFU/mL,即可直接用于多重PCR、基因芯片、微流控芯片等高通量检测,用于上述五种病原菌的筛查。
具体实施方式
实施例1
称取牛脑浸出粉5g,牛心浸出粉15g,蛋白胨5g,氯化钠2.5g,葡萄糖3g,磷酸氢二钠1.5g,甘露醇1g,丙酮酸钠1g,甘氨酸3g,七叶苷1g,蒸馏水1000ml,搅拌溶解后,用10 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2,121℃高压灭菌15min,4℃保存。
将菌体浓度均为109 CFU/mL的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌培养液分别稀释107倍,然后分别取100 µL,接入10 mL制备好的用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌培养基,使培养基中各菌体浓度为1 CFU/mL,37℃培养16h,取增菌培养后的增菌液100 µL,适当稀释后分别涂布到沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌选择性培养基平板,进行分离培养。根据五种病原菌在平板上的特征菌落进行计数,结果见表1。
表1复合增菌培养基增菌效果
菌种名称 | 接菌浓度(CFU/mL) | 16h培养物菌体浓(CFU/mL) |
大肠杆菌 | 1 | 2.3×109 |
沙门氏菌 | 1 | 2.1×109 |
副溶血性弧菌 | 1 | 1.9×108 |
单增李斯特菌 | 1 | 1.7×106 |
金黄色葡萄球菌 | 1 | 1.3×106 |
从表1中可知,经过16h的增菌,五种菌的菌体浓度由1 CFU/mL增至106
CFU/mL~109 CFU/mL,满足后期检测需要。
实施例2
称取牛脑浸出粉10g,牛心浸出粉5g,蛋白胨15g,氯化钠7.5g,葡萄糖1g,磷酸氢二钠3.5g,甘露醇3g,丙酮酸钠3g,甘氨酸1g,七叶苷3g,蒸馏水1000ml,搅拌溶解后,用10 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.5,121℃高压灭菌17 min,4℃保存。
将菌体浓度均为109 CFU/mL的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌培养液分别稀释107倍,然后分别取100 µL,接入10 mL制备好的用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌培养基,使培养基中各菌体浓度为1 CFU/mL,37℃培养16h,取增菌培养后的增菌液100 µL,适当稀释后分别涂布到沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌选择性培养基平板,进行分离培养。根据五种病原菌在平板上的特征菌落进行计数,结果见表2。
表2复合增菌培养基增菌效果
菌种名称 | 接菌浓度(CFU/mL) | 16h培养物菌体浓度(CFU/mL) |
大肠杆菌 | 1 | 2.0×109 |
沙门氏菌 | 1 | 1.9×109 |
副溶血性弧菌 | 1 | 2.3×108 |
单增李斯特菌 | 1 | 2.2×106 |
金黄色葡萄球菌 | 1 | 1.8×106 |
从表2中可知,经过16h的增菌,五种菌的菌体浓度由1 CFU/mL增至106
CFU/mL~109 CFU/mL,满足后期检测需要。
实施例3
称取牛脑浸出粉7.5g,牛心浸出粉10g,蛋白胨10g,氯化钠5g,葡萄糖2g,磷酸氢二钠2.5g,甘露醇2g,丙酮酸钠2g,甘氨酸2g,七叶苷2g,蒸馏水1000ml,搅拌溶解后,用10 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4,121℃高压灭菌20min,4℃保存。
将菌体浓度均为109 CFU/mL的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌培养液分别稀释107倍,然后分别取100 µL,接入10 mL制备好的用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌培养基,使培养基中各菌体浓度为1 CFU/mL,37℃培养16h,取增菌培养后的增菌液100 µL,适当稀释后分别涂布到沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌选择性培养基平板,进行分离培养。根据五种病原菌在平板上的特征菌落进行计数,结果见表3。
表3复合增菌培养基增菌效果
菌种名称 | 接菌浓度(CFU/mL) | 16h培养物菌体浓度(CFU/mL) |
大肠杆菌 | 1 | 2.8×109 |
沙门氏菌 | 1 | 2.3×109 |
副溶血性弧菌 | 1 | 2.6×108 |
单增李斯特菌 | 1 | 2.7×106 |
金黄色葡萄球菌 | 1 | 2.5×106 |
从表3中可知,经过16h的增菌,五种菌的菌体浓度由1 CFU/mL增至106
CFU/mL~109 CFU/mL,满足后期检测需要。
Claims (3)
1.用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌的培养基,其特征在于,以质量份数计,其原料配方组成为:牛脑浸出粉5-10份,牛心浸出粉5-15份,蛋白胨5-15份,氯化钠2.5-7.5份,葡萄糖1-3份,磷酸氢二钠1.5-3.5份,甘露醇1-3份,丙酮酸钠1-3份,甘氨酸1-3份,七叶苷1-3份,蒸馏水1000份,pH值为7.2-7.5。
2.根据权利要求1所述的用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌的培养基,其特征在于:以质量份数计,其配方为牛脑浸出粉7.5份,牛心浸出粉10份,蛋白胨10份,氯化钠5份,葡萄糖2份,磷酸氢二钠2.5份,甘露醇2份,丙酮酸钠2份,甘氨酸2份,七叶苷2份,蒸馏水1000份,pH值为7.4。
3.根据权利要求1所述用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌复合增菌的培养基的配制方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)按照配方将牛脑浸出粉、牛心浸出粉、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠、甘露醇、丙酮酸钠、甘氨酸和七叶苷加至蒸馏水中,搅拌溶解;
(2)用10mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2-7.5;
(3)121℃高压灭菌15-20min,4℃保存。
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