CN104189037A - 片仔癀及其制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用 - Google Patents
片仔癀及其制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中药制剂领域,具体涉及一种片仔癀及其制剂在制备抗肿瘤转移药物中的新用途。片仔癀能显著的抑制肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌的肿瘤细胞与纤维连接蛋白的粘附、抑制肿瘤细胞侵袭的能力、抑制肿瘤血管的生成。采用药效学研究方法证实了片仔癀在抗肿瘤转移中多途径、多靶点的优势,使片仔癀在抗肿瘤转移方面的临床应用具备科学依据。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域,具体涉及一种片仔癀及其制剂在制备抗肿瘤转移药物中的新用途。
背景技术
大多数肿瘤治疗失败的原因是因为均发生了不同程度和不同部位的肿瘤转移,60%以上肿瘤患者于初次就诊时已发现有肿瘤转移,这个肿瘤的治疗和治愈都造成了极大的困难。癌症患者经手术治疗、放化疗等综合治疗,可有效遏制主要部位肿瘤的发展,但无法遏制恶性肿瘤易发生转移的特性。肿瘤转移的机制是极为复杂的,至今仍有许多问题尚不清楚,给肿瘤的防治均带来极大困难。
中医认为肿瘤的发病机制为“毒、瘀、虚”的动态变化过程,其中毒、瘀在疾病发展中占主导地位,是预防及治疗肿瘤的关键。片仔癀是由牛黄、三七、蛇胆、麝香等多种名贵中药精制而成的锭剂,气微香,味苦、微甘,其清热解毒、活血化瘀、消肿止痛、祛邪扶正的功效臻于上乘,充分体现了中医治疗肿瘤的优势。
发明内容
为此,本发明所要解决的技术问题在于提供了片仔癀及其制剂的药物新用途。
本发明公开了片仔癀及其制剂在制备抗肿瘤转移药物中的新用途。
所述肿瘤包括肺癌、肝癌、胃癌或宫颈癌肿瘤。
所述抗肿瘤转移是指抑制肿瘤细胞与纤维连接蛋白的粘附。
所述抗肿瘤转移是指抑制肿瘤细胞侵袭的能力。
所述抗肿瘤转移是指抑制肿瘤血管的生成。
所述片仔癀选择性加入常规辅料,按照常规工艺制成临床上可接受的制剂。
所述制剂包括锭剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂或合剂。
所述片仔癀及其制剂日服用制剂量含片仔癀0.6_-1.8g。
本发明所述方案的药物新用途在现有片仔癀制剂的基础上,开发出其与原有疗效不同的新的治疗用途,发现现有片仔癀可用于制备抗肿瘤转移药物中的新用途,尤其是抗肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌肿瘤的转移功效。实验证明片仔癀及其制剂可显著的抑制肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌的肿瘤细胞与纤维连接蛋白的粘附、抑制肿瘤细胞侵袭的能力、抑制肿瘤血管的生成。不仅为现有片仔癀制剂的利用开发出新的用途,同时也为癌症病机复杂、治疗效果欠佳的疾病开辟了一种新的中药治疗方法,不仅有效率高且副作用低。
实验例
(一)片仔癀对肿瘤细胞粘附能力影响的研究
1.目的与原理
通过研究片仔癀对肿瘤细胞粘附能力的影响,考察片仔癀的抗肿瘤转移作用。细胞的粘附性在维持细胞外形、调节细胞分裂、运动的等功能中起十分重要的作用。肿瘤细胞通过表面受体粘附于基底膜及细胞外基质成分上。粘附是癌细胞侵袭的始动步骤。高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的异质性粘附能力通常增高,而肿瘤细胞间的同质性粘附能力会下降。上述特性有利于肿瘤细胞与肿瘤母体分离,并侵犯基底膜等正常组织。通过检测肿瘤细胞和细胞外基质蛋白(纤维粘连蛋白)的黏附率,检测片仔癀抗肿瘤细胞黏附的能力,粘附率越低,说明片仔癀抗肿瘤粘附能力越强。
2主要试剂
人工重构基底膜材料Matrigel(主要成分为层粘蛋白和IV型胶原)、纤维连接蛋白(FN)、小牛血清白蛋白BSA、噻唑蓝MTT。
3实验步骤
(1)包被基底膜:用不含血清的空白培养基配制浓度为10μg/ml的FN,以50μl/孔分别加入96孔培养板,4℃过夜包被。
(2)水化基底膜:吸出培养板中的残余液体,每孔加入50μl含10mg/mlBSA的无血清培养基,37℃,30min。吸出残余液体,用PBS洗两遍。
(3)接种细胞:用胰酶消化肿瘤细胞,用不同浓度的药液稀释细胞,调整细胞密度为105个/ml,分别将100μl细胞悬液接种于培养板中,每个浓度设5个平行样本。
(4)培养细胞:37℃,5%CO2条件下培养细胞3h。
(5)检测:培养结束后,吸出培养板中的液体,加入PBS轻轻洗一遍,洗去未黏附的细胞,然后用MTT比色法测定,测定波长570nm,参比波长650nm,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。
(6)实验数据统计:黏附抑制率=(1-给药组A值/空白组A值)×100%。
4结果与讨论
如表1所示,片仔癀在100~400μg/ml浓度范围内,对肝癌SMMC-7721、肺癌A549、胃癌SGC-7901、宫颈癌Hela细胞与纤维连接蛋白的粘附有一定的抑制作用,且抑制作用与浓度成正比。统计结果与对照组具有显著性差异,最高抑制率达65.78%。
表1片仔癀对各肿瘤细胞与纤维连接蛋白粘附的影响
注:1)P<0.05,2)P<0.01,与空白组比较有显著性差异。
(二)片仔癀对肿瘤细胞侵袭能力影响的研究
1目的与原理
本实验采用Transwell小室法检测片仔癀对肿瘤细胞侵袭的影响。基底膜是限制肿瘤细胞侵袭的天然屏障。恶性肿瘤细胞侵袭时,首先通过膜表面受体与基底膜成分粘附,然后释放和激活多种蛋白酶降解基底膜,继而定向运动穿越基底膜的缺损部位,突破基底膜屏障是肿瘤侵袭周边正常组织的其实步骤和重要环节。实验中,将matrigel胶铺在有微孔的滤膜上,体外重组形成基底膜。在膜的下室加入FBS或细胞趋化因子,肿瘤细胞加入到上室腔后,受下室腔趋化剂的作用而向下室运动,但只有通过侵袭降解覆盖膜孔的matrigel后,才能运动到膜的下室。计数下室的细胞可以定量的反应肿瘤细胞的侵袭能力。
2主要试剂
人工重构基底膜材料Matrigel(主要成分为层粘蛋白和IV型胶原)、小牛血清白蛋白BSA、结晶紫。
3实验步骤
包被基底膜:
加入50μl、50mg/L(50μg/ml)Matrigel1:8稀释液(空白培养基稀释)包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干。
(2)水化基底膜:
吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/L BSA的无血清培养液,37℃,30min。
(3)制备细胞悬液
①制备细胞悬液前先让细胞撤血清饥饿18-24h,进一步去除血清的影响。
②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗2遍,用无血清培养基重悬。调整细胞密度至1×105个/ml。
(4)接种细胞
取不同药物浓度的细胞悬液100μl加入Transwell小室。
24孔板下室加入500μl含10%NBS的培养基。要特别注意下层培养液和小室间不能有气泡。
培养细胞:常规培养20h。
(5)结果统计
取出小室,用PBS淋洗,90%乙醇固定10min后,用棉签擦去基质胶和上室内的细胞,用0.1%结晶紫染色。染色前将膜风干,用0.1%结晶紫常温染色10-30min。使用倒置显微镜进行观察和拍照,可清楚看到小室底膜下室侧附着的细胞。
染色后也可以用PBS洗净染料,用10%醋酸100μl每孔抽提10min脱色,将结晶紫完全洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上600nm测其OD值,间接反映细胞数。
抑制率(%)=(ODcontrol-ODtreated)/ODcontrol×100%。
4结果与讨论
实验结果如表2显示,侵袭至transwell小室底部的各肿瘤细胞随着药物浓度的增大而减少,表明药物有一定抑制肿瘤细胞侵袭的能力。片仔癀对各肿瘤细胞的侵袭能力有一定的抑制作用,高剂量的抑制率在29.71~58.60%,而对肝癌SMMC-7721细胞的抑制率最高,为58.60%。
表2片仔癀对各肿瘤细胞侵袭能力的影响
注:1)P<0.05,2)P<0.01,与空白组比较有显著性差异。
(三)片仔癀对血管生成抑制作用的研究
1目的
通过研究片仔癀对血管生成的影响,探索片仔癀是否对肿瘤细胞的生长有抑制作用。以鸡胚尿囊膜血管生成(CAM)实验,初步探索片仔癀对血管生成的抑制作用。
2试验方法
进行了鸡胚尿囊膜血管生成实验,取生长七天的新生鸡蛋,研究浓度分别为0.1,1.0,10.0,100.0,1000.0μg/ml的片仔癀对鸡胚血管生成的影响,每个药物浓度设10个重复(n=10)。具体步骤如下:
1)获取种蛋,于37℃,55%相对空气湿度下孵育,每天翻动3次;在照蛋灯下观察鸡胚,活胚可看到清晰的血管分布如蜘蛛网,颜色发红鸡胚胚头的暗影还可看到胚动。胚动呆滞或没有运动的血管昏暗模糊者,为将要死亡或己经死亡的鸡胚,随时剔除。在照蛋灯下沿气室的范围在蛋壳表面做好标记。
2)孵育至第七天,用酒精消毒蛋壳后,置于超净台内操作。在鸡胚气室中央开约1×1厘米的窗,用小刀切破壳膜,显露出尿囊膜,用透明胶带封口制成假气室。
3)开窗后的鸡胚在37℃恒温箱中继续孵育至次日第8天,通过开窗的假气室观察,剔除死亡的鸡胚。将鸡胚随机分成组,每组10只,用微量加样器分别在鸡胚尿囊膜表面离开尿囊膜血管的空白处给药(生理盐水配制),生理盐水组为阴性对照组,继续37℃孵育48小时。
4)小心揭开透明胶带,暴露加药区尿囊膜,滴加数滴1:1甲醛与丙酮配成的固定液,室温下固定约20分钟,待血管内血液凝固后。剪下鸡胚尿囊膜,平铺于滤纸上干燥后置于载玻片上,于光学显微镜相同物镜倍数倍下观察血管分支并摄片。同一倍数物镜下,随机取六个视野,描记视野内的尿囊膜血管一级与二级分支,记数血管分支点。比较各组血管分支数,作为评价血管密度的指标。
3结果与讨论
记录不同浓度片仔癀作用48h后鸡胚尿囊膜的一级血管数、二级血管数,并在显微镜下拍照。结果显示阴性对照组血管生长良好,呈树枝状分布,分支适中;加药组鸡胚血管数目明显少于对照组,且血管变细,血管形态异常(详见图1)。经浓度为0.1、1.0、10.0、100.0、1000.0μg/mL的片仔癀处理后,CAM血管生成受到了不同程度的抑制,且有显著性差异(P<0.01)。本实验浓度范围内的抑制率与药物剂量不成正比,0.1、1.0、10.0μg/mL时随着浓度的升高,抑制作用逐渐增强,10.0μg/mL时药物作用最强,对一级血管的抑制率为61.1%,对二级血管的抑制率为59.1%,100.0和1000.0μg/mL时药物的抑制作用又成下降趋势(详见图2)。
(四)总结
片仔癀抗肿瘤细胞粘附实验的研究表明,片仔癀在100~400μg/ml浓度范围内,对肝癌SMMC-7721、肺癌A549、胃癌SGC-7901、宫颈癌Hela细胞与纤维连接蛋白的粘附能力有显著的抑制作用,且抑制作用与药物剂量成正比,最高浓度下的片仔癀对各细胞的抑制率在63%左右,最高抑制率为65.78%,各数据均具有统计学意义(P<0.01)。
片仔癀对抗肿瘤细胞侵袭实验的研究表明,片仔癀在100~400μg/ml浓度范围内,对肝癌SMMC-7721、肺癌A549、胃癌SGC-7901、宫颈癌Hela细胞的侵袭行为有较明显的抑制作用,且抑制作用与药物浓度成正比,最高浓度下的片仔癀对各细胞的抑制率在29.71~58.60%之间,最高抑制率为58.60%,各数据均具有统计学意义(P<0.01)。
以鸡胚尿囊膜血管生成(CAM)实验,初步探索片仔癀对新生血管生成的抑制作用,结果表明,片仔癀对鸡胚尿囊膜血管生成有显著的抑制作用,但抑制作用不成浓度依赖性。各剂量组间比较,10μg/mL的片仔癀作用最强,对一级血管的抑制率为61.1%,对二级血管的抑制率为55.0%,而100、1000μg/mL时的抑制率成下降趋势。推测这可能与该中药复方可能会导致一定的副作用有关。
片仔癀由三七、牛黄、麝香、蛇胆等组成,而这四味药单独使用不当或者过量也会产生毒副作用,但这四味药组成的片仔癀会不会因服用过量而产生副作用。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明,其中
图1为本发明实验例中不同浓度片仔癀对新生血管生成影响的形态图;
图2为本发明实验例中不同浓度片仔癀对新生血管生成影响的趋势图,**表示P<0.01。
具体实施方式
实施例1
取三七85重量份,蛇胆7重量份,牛黄5重量份,麝香3重量份,按照传统工艺制成锭剂,每粒0.6-3.0g,用于制备抗肿瘤转移药物。每日3次,每次0.3-0.9g。
实施例2
取实施例1中片仔癀锭剂粉碎成颗粒,加入常规辅料按照常规工艺制成片剂,每片制剂中含有片仔癀0.2-0.4g,用于制备抗肿瘤转移药物。每日3次,每次2-4片。
实施例3
取实施例1中片仔癀锭剂粉碎成颗粒,填充胶囊制成胶囊剂,每粒胶囊装0.2-0.4g,用于制备抗肿瘤转移药物。每日3次,每2-4粒。
实施例4
取实施例1中片仔癀锭剂粉碎成颗粒,加入常规辅料按照常规工艺制成颗粒剂,每袋颗粒剂中含有片仔癀0.3-0.9g,用于制备抗肿瘤转移药物。每日3次,每次1袋。
实施例5
取实施例1中片仔癀锭剂粉碎成颗粒,加入常规辅料按照常规工艺制成丸剂,每丸制剂中含有片仔癀0.05-0.2g,用于制备抗肿瘤转移药物。每日3次,每次3-6丸。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.片仔癀及其制剂在制备治疗抗肿瘤转移药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述肿瘤包括肺癌、肝癌、胃癌或宫颈癌肿瘤。
3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述抗肿瘤转移是指抑制肿瘤细胞与纤维连接蛋白的粘附。
4.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述抗肿瘤转移是指抑制肿瘤细胞侵袭的能力。
5.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述抗肿瘤转移是指抑制肿瘤血管的生成。
6.如权利要求1-5任一所述的用途,其特征在于,所述片仔癀选择性加入常规辅料,按照常规工艺制成临床上可接受的制剂。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述制剂包括锭剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂或合剂。
8.如权利要求1-7任一所述的用途,其特征在于,所述片仔癀及其制剂日服用制剂量含片仔癀0.6-1.8g。
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