发明内容
本发明目的在于公开片仔癀及其制剂在保护记忆功能方面的新用途,本发明的目的还在于公开片仔癀及其制剂在抗脑缺血方面的新用途。
其中,所述的片仔癀及其制剂的单位制剂量中含片仔癀为0.3-0.9克。
片仔癀作为传统的国家一级中药保护品种,现已加工制备成临床应用的多种常规剂型,片仔癀具有消炎、清凉解毒、消肿止痛等作用,对急性肝炎、眼炎、耳炎及一切炎症引起的疼痛、发热等症,都有很好疗效;此外,对消化系统癌细胞有明显的抑制作用。本发明公开了片仔癀及其制剂在保护记忆功能和抗脑缺血方面具有显著作用,另外,片仔癀及其制剂预防性的治疗能够减轻卒中的严重程度并延长卒中的生存时间,同时经过药效实现进行了证实。本发明还对片仔癀及其制剂的上述新用途进行了机理研究,从而使片仔癀及其制剂的上述新用途具有更为科学的依据。
下列实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1片仔癀及其制剂对小鼠急性脑缺血的影响
1.实验目的
利用颈总动脉结扎法使小鼠造成急性缺血,观察片仔癀胶囊对急性脑缺血的影响,了解片仔癀胶囊的抗脑缺血作用。
2.仪器和材料
(1)药品与试剂
受试药:片仔癀,由漳州片仔癀药业股份有限公司提供(市面可以购买)。规格:3g/粒,批号:0711050。实验前以蒸馏水溶解,并用去离子水溶解成混悬液,每次使用前用力混匀。
阳性对照药:1)中药阳性药:脑得生胶囊,通化东宝五药有限公司生产提供。规格:0.3g/粒,批号:071201,国药准字:Z19991109,实验前以去离子水溶解。2)西药阳性药:尼莫地平片,拜尔医药保健有限公司生产,北京医药股份有限公司提供。 规格:30mg/片,30mg*20片/盒。批号:113275,国药准字:H20003010,实验前以去离子水溶解。
水合氯醛:北方化学试剂公司提供,批号:050308。
(2)器材
秒表:3个
(3)动物
ICR小鼠品系、SPF级小鼠84只,体重20~22g,雌雄各半,购自维通利华实验动物技术有限公司。动物许可证号:SCXK(京)2007-0001。实验时在中国中医科学院中医基础研究动物室观察及饲养,实验动物使用许可证号:SYXK(京)2005-0024。
3.实验方法
(1)剂量设置与分组给药
灌胃给药容积均为0.1ml/10g,每日灌胃两次。受试药的给药剂量设置的依据是参照片仔癀的临床用量。
片仔癀:临床用量0.6g/次,3次/日,据此,推算出小鼠日服用的等效剂量为:0.234g/kg,小鼠的三个给药剂量分别为:0.702g/kg、0.234g/kg和0.078g/kg。则三个给药浓度分别为:0.0702g/ml,0.0234g/ml,0.0078g/ml。
尼莫地平片:120mg/次,1次/日。推算出小鼠日服用的等效剂量为:0.0156g/kg。
脑得生:给药剂量设置的依据是参照其临床用量:0.3g/粒,一次6粒,3次/天,5.4g/d。推算出小鼠日服用的等效剂两为:0.702g/kg/d。给药体积按0.1ml/10g计算,则给药浓度为0.0702g/ml。
(2)分组
小鼠适应性喂养3天后,按体重随机分为7组,每组12只,包括:
生理盐水组(NS);
片仔癀大剂量组(PZHH);
片仔癀中剂量组(PZHM);
片仔癀小剂量组(PZHL);
脑得生胶囊组(NDS);
尼莫地平组;
假手术组。
采用灌胃给药,各组均于测试前连续给药6天,第7天给药后40min造模。
(3)具体实验方法
各组动物末次灌胃给药40分钟后(生理盐水组和假手术组给予等体积生理盐水灌胃),10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,仰卧位固定于手术台上,切开颈部正中皮肤,钝性分离肌层,暴露两侧颈总动脉,分离双侧颈总动脉和迷走神经分离两侧颈总动脉,用0号手术线分别在近心端和远心端穿线并结扎,完全阻断大脑血流,此时开始计时,记录各组小鼠的存活时间(每分钟呼吸少于或等于5次作为死亡标准)。
4.测试指标
小鼠从双侧颈总动脉结扎到死亡的时间。(用秒表计时)
5.数据处理
采用SPSS12.0统计软件管理,数据进行探索性分析,数据呈非正态分布,取对数转换,符合参数检验要求。计量资料描述用均数±标准差,计数资料用频数表示。采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法。
6.实验结果
假手术组小鼠无死亡,因此不做统计,其余组别分析统计结果如下表1所示。
*——P<0.05,**——P<0.01
与对照组(生理盐水组)比较
本实验对片仔癀抗脑缺血的作用进行了探讨,研究结果表明,片仔癀胶囊可显著延长小鼠双侧颈总动脉结扎后的存活时间,剂量依赖性的提高小鼠抗脑缺血能力,对小鼠急性脑缺血有保护作用。
实验例2片仔癀及其制剂对脑缺血和脑卒中的预防和治疗作用实验
一、实验方法:下述实验均采用如下实验方法:
将自发性高血压大鼠(SHR)随机分成:片仔癀预防组和片仔癀治疗组,相应的缺血对照组和假手术组。对片仔癀组大鼠和对照组大鼠行双侧颈总动脉阻断术造成脑缺血状态,片仔癀预防组大鼠在手术前连续给药3个月(每天一次,18mg/kg),片仔癀治疗组大鼠在手术后连续给药2周(每天一次,18mg/kg),相应的缺血对照组大鼠 则相应的给予生理盐水;假手术组大鼠除了不阻断颈总动脉以外,其他的手术过程与另外两组相同,而且不给予任何其他处理。在手术后两周,完成行为学测试(通过水迷宫实验)和功能性磁共振成像实验(fMRI)。
将易卒中型自发性高血压大鼠(SHRsp)随机分为2组:片仔癀预防组和对照组,片仔癀预防组大鼠从出生第7周开始给予片仔癀直到发生卒中(每天一次,18mg/kg),对照组给予生理盐水。
动物分组及实验方法概要见表2。
表2动物分组和实验方法概要
*在双侧颈总动脉阻断手术前给予片仔癀3给月(第6组除外),**在双侧颈总动脉阻断手术后给予片仔癀治疗2周(第6组除外)。
#给予片仔癀治疗直到脑卒中发生。
二、实验结果
1、水迷宫实验——对记忆功能的保护作用实验
应用水迷宫对SHR进行行为学测试,以评价其记忆能力。结果显示,与缺血对照组大鼠比较,片仔癀预防组大鼠训练5天后的逃避潜伏期显著改善(22.3±6.1秒:56.0±15.8秒,p<0.05)(附图1),这就提示片仔癀具有保护SHR由于脑缺血而引起的记忆功能受损的功能。结果表明,在训练5天后,与对照组相比,预防组大鼠的逃避潜伏期显著的降低(p<0.05)。所有数据均用均数±标准差表示。
2、功能性磁共振成像——脑缺血后对脑功能完整性的维护作用实验
应用功能性磁共振成像观察对SHR尾部给予500克重量刺激时脑功能的变化情况,结果发现与假手术组大鼠相比,片仔癀治疗组大鼠和对照组大鼠的脑激活体积显著增大(115.2±70.0:35.1±17.3;135.8±118.5:35.1±17.3,p<0.05)(附图2);而片仔癀治疗组大鼠和对照组相比,脑激活体积无明显改变。磁共振图像在大鼠尾部受到500克重量刺激时获得。所有数据均用均数±标准差表示。
3、易卒中型自发性高血压大鼠(SHRsp)的卒中观察
脑卒中通常发生在脑缺血之后,因此根据卒中评分量表(表3)比较了卒中预防组大鼠(6A组)和其对照组大鼠(6B组)卒中的严重程度。与对照组比较(6B),有更多的片仔癀预防组大鼠(6A)得分较低,反映出得卒中时的程度较低(p<0.05),提示片仔癀预防组大鼠的严重性显著低于对照组(表2A)。另外,片仔癀预防组大鼠与对照组大鼠相比从发生卒中到死亡的时间明显延长(2.36±1.45:0.94±0.56,p<0.05)(表2B),即片仔癀显著延长了卒中生存时间。这些结果提示,片仔癀预防性的治疗能够减轻卒中的严重程度并延长卒中的生存时间。
表3中(A)是通过大鼠卒中时的得分来判断其严重程度。与对照组(6B)比较,有更多的片仔癀预防组大鼠(6A)得分较低,反映出得卒中时的程度较低。(B)片仔癀预防组大鼠(6A)的严重程度评分、卒中发生时间和死亡时间与对照组(6B)无明显改变,而其卒中后生存时间则明显较对照组大鼠延长。
表3片仔癀预防组大鼠(6A)与对照组(6B)大鼠卒中发生情况比较。
(A)SHRsp卒中严重程度
评分# 1 2 3 4
数量
片仔癀预防组(6A)* 1 7 2 4
对照组(6B) 0 6 5 6
#卒中发生时的评分。
*Chi-square=2.5(p=0.0476)与6B比较.
(B)不同组别SHRsp卒中严重程度评分、卒中发生时间和死亡时间平均值。
**片仔癀预防组和对照组比较。
实验例3片仔癀及其制剂对脑缺血和脑卒中的预防和治疗作用的分子机制实验研究
将上述完成行为学测试实验的自发性高血压大鼠(SHR)处死,将脑组织取出分别做免疫组织化学、细胞死亡酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白质印迹实验(Western blot)和蛋白质组学等实验研究。主要集中在海马和小脑两个部位,具体的方法是:通过细胞死亡ELISA检测了脑细胞整体死亡情况;用Western blot检测凋亡相关蛋白的水平;用免疫组化法对凋亡相关蛋白进行定位。
一、细胞死亡的检测
检测了SHR(表2中的3C,3D and 3E组)、WKY大鼠(表2中的5C,5D and 5E组)和SHR-sp(表2中的6A and 6B组)三种大鼠海马在不同处理因素下的细胞死亡情况。首先,观察了SHR和WKY大鼠的结果。与假手术组大鼠相比,两种大鼠海马的细胞死亡量在缺血对照组显著升高(SHR,0.814±0.162:0.405±0.099,p<0.05;WKY,0.508±0.148:0.336±0.085,p<0.05)(附图3)。重要的是,SHR和WKY两种大鼠的片仔癀预防组的细胞死亡量(0.305±0.066和0.265±0.085)与各自的假手术组比较无明显改变(附图3A);即,片仔癀能够降低缺血海马的细胞死亡量,无论是否合并高血压,片仔癀都能保护SHR and WKY两种大鼠由于缺血导致的海马损伤。在小脑,SHR and WKY两种大鼠的片仔癀预防组、缺血对照组和假手术组细胞死亡量无明显改变(附图3B)。这种无意义的变化是由于结扎双侧颈总动脉对小脑的缺血影响不大,小脑可以通过椎基底动脉系统供血。
WKY and SHR两种大鼠的海马细胞死亡量缺血对照组明显高于假手术组大鼠(*p<0.05),而片仔癀预防组大鼠则明显低于缺血对照组(**p<0.05)。在WKY and SHR大鼠的小脑,3组大鼠的细胞死亡量无明显变化。
接着观察了SHRsp的实验结果。如附图4所示,在海马和小脑,片仔癀预防组(6A组)大鼠的细胞死亡量均显著低于各自的对照组(6B组)(海马,1.17±0.44: 2.16±0.54,p<0.05;小脑,0.63±0.30:0.92±0.37,p<0.05),这就提示片仔癀预防性治疗可以降低SHRsp卒中后海马和小脑组织的细胞死亡程度。6A组在发生卒中前每天给予片仔癀治疗,6B组则给予生理盐水。大鼠死亡后将海马和小脑组织取出。6A组大鼠海马和小脑的细胞死亡量均显著低于6B组大鼠(p<0.05)。
二、Western blot
应用Western blot的方法检测了海马和小脑组织中的Bax,Bcl-2 and caspase 3蛋白。结果发现1A和2A(3月龄SHR,片仔癀预防组及其缺血对照组),3A和3B(3月龄,SHR片仔癀治疗组及其缺血对照组),4A和4B(6月龄SHR,片仔癀预防组及其缺血对照组),5A和5B(3月龄WKY,片仔癀预防组及其缺血对照组)之间均无显著性变化,但有些组别的结果表现出一致的趋势。仅能提示如前所述的给予片仔癀预防性治疗后细胞死亡明显降低与凋亡无关,或者说凋亡在很大程度上不参与缺血诱导的细胞死亡。
三、免疫组化染色
从Western blot的结果来看,仅完成了1B和2B组(SHR,片仔癀预防组及其缺血对照组)的Bax,Bcl-2和caspase 3蛋白的免疫组化染色。活化的caspase-3的表达在片仔癀预防组大鼠(1B组)的海马和小脑中显著低于缺血对照组(2B组)(海马,3.06±1.97:14.1±2.93mm2;小脑,7.97±1.38:10.7±1.44mm2,p<0.05)(附图5)。在2B组大鼠的小脑,caspase 3阳性细胞主要存在于浦肯野细胞层和其内测紧邻的颗粒细胞层,而在1B组大鼠的小脑则几乎没有阳性细胞表达(附图6a到6c)。同样,在2B组大鼠的海马,大量的caspase 3阳性细胞存在于分子层、锥体细胞层和多形细胞层,而在1B组大鼠则几乎没有阳性细胞表达或仅在锥体细胞层看到(附图6d和6e)。尽管片仔癀预防组和其缺血对照组在Western blot的结果上没有明显区别,但是免疫组化染色可以反映出片仔癀对细胞类型的影响以及它们的位置,提示片仔癀可以明显的预防由于缺血而引起的海马和小脑的细胞凋亡,并能判断这些细胞的特定位置和功能。
四、蛋白质组学
组1B和2B间,海马和小脑检测有9个和14个差异表达蛋白(表4)。与对照组比较,片仔癀处理组缺血后海马和小脑上调的一个蛋白为细胞色素b-c1复合体亚单位(NP_00100691)(QCR2)。DAVID和GOTM分析显示,从两个列出的蛋白可知海马和小脑最重要的关联是线粒体膜。海马和小脑的DAVID(表5)和GOTM(表6)的完全聚类分析结果和海马(附图7a、图7b)和小脑(附图8a、图8b、图8c)GOTM聚类结果的有向 无环图(DAG)。QCR2,泛醇:细胞色素c氧化酶复合体11种蛋白的其中一种,是电子传递链的核心。因此,bc1复合物是真核细胞呼吸链的一个组成部分,主要参与线粒体催化电子从泛醇向细胞色素c传递,这是与质子从基质空间穿越线粒体膜的转载相偶联的。因此,bc1复合物参与电化学质子梯度的建立,进而驱动腺苷三磷酸合成。然而,bc1复合物的活性能导致活性氧自由基(ROS)的产生,继而导致线粒体结构和DNA的破坏。这就提示活性氧自由基的产生可能是一些生理和病理情况下损伤的主要来源。QCR2作为bc1复合物的核心蛋白,在片仔癀显著降低细胞损伤时会减缓活性氧产生和细胞死亡。提示片仔癀能减少活性氧自由基的负效应和损伤,从而在缺血和脑卒中的情况下起关键作用。
表42D胶电泳和基质辅助激光质谱分析解析/电离飞行时间质谱
(MALDI-TOF)/TOF差异蛋白表达分析结果,(A)海马和(B)小脑样品。
(A)海马
(B)小脑
*与缺血对照组比较,这些蛋白在片仔癀预防组是下调的。
注明:2D胶电泳和基质辅助激光质谱分析解吸/离子化行时间质谱(MALDI-TOF)/TOF蛋白质分析结果在主文中按照功能进行命名。两种方法分别对PTH处理缺血组和缺血对照组比较,发现在海马和小脑检测出9个和14个差异性表达蛋白。功能命名结果的更详细描述在表5、表6和表7及附图7a、图7b和附图8a、图8b、图8c中将展示。
注明它与GO(gene ontology)是一致的,应用DAVID和GOTM以及PIR检测海马和小脑的蛋白,发现最重要的相关是线粒体或它的膜部分。这就强烈提示缺血后片仔癀处理主要作用于线粒体,从而对缺血造成的损伤产生保护作用。海马和小脑GOTM聚类结果的有向无环图(DAG)分别在图7a、图7b和图8a、图8b、图8c展示。
五、结论:
片仔癀及其制剂能够保护SHR和WKY大鼠海马因缺血引起的细胞死亡,免疫组化的结果提示片仔癀及其制剂能够显著的预防海马和小脑中特定位置和特定功能的细胞凋亡。在以后的研究中需要阐明这些细胞的特征。蛋白质组学的结果提示片仔癀及其制剂能够将脑缺血和卒中引起的氧化应激损伤降到最低程度。