CN104171294B - 一种固态发酵蛋白饲料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固态发酵蛋白饲料的制备方法，步骤如下：(1)首先配制PDA液体培养基，然后用牛皮纸封好后，灭菌，冷却后将黑曲霉孢子、产阮假丝酵母、植物乳酸杆菌分别放入PDA液体培养基中进行培养活化菌种；(2)以豆渣、啤酒渣和苹果渣为发酵底料，然后往发酵底料中加入水，料水比为60‑70％，然后以步骤(1)活化后的黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌为发酵菌，加入到发酵底料中进行发酵，发酵温度为30‑40℃，发酵时间为2‑5天；(3)发酵完成后，将样品取出，自然冷却后包装即可得到本发明的固态发酵蛋白饲料。本发明制备的固态发酵蛋白饲料具有蛋白质含量高，脂肪含量高，营养丰富的优点。

Description

一种固态发酵蛋白饲料的制备方法

技术领域

本发明涉及固态发酵饲料技术领域，尤其涉及一种固态发酵蛋白饲料的制备方法。

背景技术

我国是农业大国，畜牧养殖业产品产量居世界前列，目前全国养猪出栏4.5亿头、牛、羊等各1亿多头，鸡40多亿只，水产养殖、特种经济动物养殖等均需消耗数量巨大的饲料。但是粮食和饲料生产一直是我国国民经济的薄弱环节。由于受人口膨胀、耕地减少和肉食品消费增加的三重制约，我国粮食供需平衡十分脆弱，我国人均占有耕地不足1.3亩，占有粮食一直在400千克以下，其中粮食总产量的40％左右用于饲料生产，发达国家这个比例为70％-80％。在耕地和水资源长期紧缺的情况下，我国粮食产量己很难提高,发展高效饲料工业，提高粮食向畜牧产品的转化效率和饲料的利用率，开发非常规饲料特别是微生物发酵饲料，发展反色动物，提高肉食产品，是满足人民对肉、禽、鱼、蛋越来越大的需求量的最佳途径。

在开发新的蛋白饲料过程中，拓宽饲料资源是相当重要的课题。粮食作为常规饲料的供需缺口越来越大，过度地依赖粮食来用作饲料己不能满足畜牧业发展的需要。非常规饲料是一类畜禽可饲用的物质资源，如农作物秸秆、农副产品加工后废料、畜禽粪便等均为常见的非常规饲料。这些废弃资源除少量被利用外，绝大部分被遗弃，不但浪费掉巨大的资源，而且造成严重的环境污染。如能有效的利用这些废弃资源，将其转化为可利用的新型蛋白饲料，不仅可以代替部分常规饲料，降低饲料成本，获得可观的经济价值，而且减少废弃物质对环境的污染，提高经济效益。微生物发酵法处理饲料原料具有成本低、安全性高、残留少、营养损失少、设备简单、产物浓度高和抗营养因子脱毒率高等优点。因此其优越性显而易见，能在缓解我国优质蛋白质资源紧缺，提高饲料报酬，降低畜牧养殖业的生产成本等方面发挥一定的作用，是一条具有很好发展潜力的绿色途径。近年来，我国在固态发酵饲料原料方面已经有许多比较深入的研究，如李旋等研究了米曲霉、酵母菌和乳酸菌混菌固态发酵豆粕，结果表明豆粕经发酵后粗蛋白含量，有机酸含量都有较大提高，品质得到改善；吴伟伟，许赣荣研究了复合微生物固态发酵对棉籽饼粕脱毒及营养成分的影响，结果表明在优化条件下进行固态发酵，得到的产物的游离棉酚脱毒率达到95.5％，真蛋白及氨基酸特别是必需氨基酸中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸比发酵前都有大幅提高；辜旭辉，朱建航等研究了利用多种有益菌混合固态发酵菜籽粕及其饲用价值的改善；柳杰，张晖等筛选出了固态发酵花生粕生产高蛋白饲料最适的菌种组合。

饲用微生物发酵工程技术和产品在解决饲料工业难题上有着无与伦比的优点和巨大的发展潜力，是当前国内外的研究重点和发展方向。通过微生物发酵技术和酶制剂创造新产品、新技术和新工艺，与饲料生产相关企业和养殖业结合，组成一条龙联合攻关队伍。微生物饲料开发能够有效利用农副产品加工业的废渣、废液和废弃物，大大减少了对环境的污染，达到了变废为宝的目的。同时经过微生物处理加工发酵过的饲料产品，或者将原来底物的毒性转化，更适于饲喂，或者大大提高蛋白含量，同时不仅含有动物可以利用的脂肪、粗蛋白、矿物质、维生素、多种高能量营养物质，并且含有活性和非活性有益微生物，改善饲喂动物肠胃微生物环境，提高动物的免疫能力和抗病能力。

微生物发酵生产蛋白饲料的条件相对恶劣，原有比较成熟的发酵蛋白饲料技术也因此搁浅。比如利用工业废弃物，像糟渣、果渣、豆饼等物质进行发酵生产蛋白饲料。本来可以将废弃物用微生物手段提高其蛋白含量，替代部分牲畜精料，成本低，济效益可观。但随着煤炭和交通价格的不断上涨，饲料烘干和运输费用增加，成本急剧增高，许多从事此行业的厂家都望而止步。因此，开发更高效更节约成本的微生物发酵产品成为该行业首选新的课题。

发明内容

本发明目的在于提供一种固态发酵蛋白饲料的制备方法。

本发明采取的技术方案是：

本发明的固态发酵蛋白饲料的制备方法的具体步骤如下：

(1)首先配制PDA液体培养基，然后用牛皮纸封好后，在110-140℃下灭菌10-30min，冷却后将黑曲霉孢子、产阮假丝酵母、植物乳酸杆菌分别放入灭菌后的PDA液体培养基中进行培养活化菌种，培养温度为25-35℃，培养时间为2-4天；

(2)以豆渣、啤酒渣和苹果渣为发酵底料，豆渣、啤酒渣和苹果渣的重量比为50-80:10-40:10，然后往发酵底料中加入水，料水比为60-70％，然后以步骤(1)活化后的黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌为发酵菌，加入到发酵底料中进行发酵，发酵菌的加入量是发酵底料总体积的5-10％，黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌的重量比为1-4:1-4:1，发酵温度为30-40℃，发酵时间为2-5天；

(3)发酵完成后，将样品取出，自然冷却后包装即可得到本发明的固态发酵蛋白饲料。

步骤(1)中，优选在121℃下灭菌20min。

步骤(1)中，优选培养温度为30℃，培养时间为3天。

步骤(2)中，豆渣、啤酒渣和苹果渣的重量比优选为60:30:10。

步骤(2)中，料水比优选为65％。

步骤(2)中，发酵菌的加入量优选是发酵底料总体积的8％

步骤(2)中，黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌的重量比优选为2:2:1。

步骤(2)中，优选发酵温度为37℃，发酵时间为4天。

本发明的积极效果如下：

本发明的固态发酵蛋白饲料的制备方法不仅可以从根本上解决农副产品加工后废弃物的高效、科学转化利用的难题，还可以为我国蛋白质资源缺乏的难题缓解压力。本发明制备的固态发酵蛋白饲料具有蛋白质含量高，脂肪含量高，营养丰富的优点。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

(1)首先配制PDA液体培养基，然后用牛皮纸封好后，在110℃下灭菌30min，冷却后将黑曲霉孢子、产阮假丝酵母、植物乳酸杆菌分别放入灭菌后的PDA液体培养基中进行培养活化菌种，培养温度为255℃，培养时间为4天；

(2)以豆渣、啤酒渣和苹果渣为发酵底料，豆渣、啤酒渣和苹果渣的重量比为50:10:10，然后往发酵底料中加入水，料水比为60％，然后以步骤(1)活化后的黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌为发酵菌，加入到发酵底料中进行发酵，发酵菌的加入量是发酵底料总体积的5％，黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌的重量比为1:4:1，发酵温度为30℃，发酵时间为5天；

(3)发酵完成后，将样品取出，自然冷却后包装即可得到本发明的固态发酵蛋白饲料。

实施例2

(1)首先配制PDA液体培养基，然后用牛皮纸封好后，在140℃下灭菌10min，冷却后将黑曲霉孢子、产阮假丝酵母、植物乳酸杆菌分别放入灭菌后的PDA液体培养基中进行培养活化菌种，培养温度为35℃，培养时间为2天；

(2)以豆渣、啤酒渣和苹果渣为发酵底料，豆渣、啤酒渣和苹果渣的重量比为80:40:10，然后往发酵底料中加入水，料水比为70％，然后以步骤(1)活化后的黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌为发酵菌，加入到发酵底料中进行发酵，发酵菌的加入量是发酵底料总体积的10％，黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌的重量比为4:1:1，发酵温度为40℃，发酵时间为2天；

(3)发酵完成后，将样品取出，自然冷却后包装即可得到本发明的固态发酵蛋白饲料。

实施例3

(1)首先配制PDA液体培养基，然后用牛皮纸封好后，在121℃下灭菌20min，冷却后将黑曲霉孢子、产阮假丝酵母、植物乳酸杆菌分别放入灭菌后的PDA液体培养基中进行培养活化菌种，培养温度为30℃，培养时间为3天；

(2)以豆渣、啤酒渣和苹果渣为发酵底料，豆渣、啤酒渣和苹果渣的重量比为60:30:10，然后往发酵底料中加入水，料水比为65％，然后以步骤(1)活化后的黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌为发酵菌，加入到发酵底料中进行发酵，发酵菌的加入量是发酵底料总体积的8％，黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌的重量比为2:2:1，发酵温度为37℃，发酵时间为4天；

(3)发酵完成后，将样品取出，自然冷却后包装即可得到本发明的固态发酵蛋白饲料。

实施例4

将本发明实施例1-3制备的固态发酵蛋白饲料用凯氏定氮法测定样品中的蛋白含量，用索式提取法提取样品中的油脂，测定灰分，用洗涤法测定中性纤维、酸性纤维含量。测定结果如表1所示：

测定方法

(1)凯氏定氮法测定样品中的蛋白含量

1.1样品的消化

准确量取0.2g左右的样品，移入干燥的100mL消化瓶中，加入6mL浓硫酸，稍摇匀后在瓶口放一小漏斗，并将瓶以45°角斜支于石棉网上，小心加热，待内容物完全炭化后逐步加大火力，保持瓶内液体微沸，至瓶内液体呈完全液体后加入1mL30％的H₂O₂再继续加热0.5h至澄清透明后，取下消化瓶，冷却至室温后移入25mL比色管中，用少量水分2-3次将消化瓶洗涤干净，洗液合并于容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。同样条件下做一空白试验。

连接好的定氮蒸馏装置。水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加玻璃珠数粒以防暴沸。调节好火力，煮沸水蒸气发生瓶内的水。吸取5.0mL样品消化稀释液沿小漏斗流入反应室中并用少量蒸馏水冲洗漏斗使之流入反应室，同时向漏斗中加入6mLNaOH溶液(ρ＝40％)使呈强碱性，将漏斗中加水，使之密封。取10mL硼酸溶液(40g/L)置于100mL锥形瓶中，加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2滴，将吸收瓶置于冷凝管下端，并使冷凝管下端插入液面下。.蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管下端后停止加热。

1.2溜出液的滴定

溜出液立即用盐酸标准溶液(0.01mol/L)滴定至微红色为终点，同时做一空白试验。

1.3总氮含量的计算

根据滴定所消耗盐酸的量计算出蛋白质的含量。

1.4计算公式

X＝((V₁-V₂)*N*0.014)/(m*(10/100))*F*100％

X：样品中蛋白质的百分含量，g；

V₁：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

V₂：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；

N：盐酸标准溶液的当量浓度；

0.014：1N盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

m：样品的质量(体积)，g(ml)；

F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6％，按16％计算乘以6.25即为蛋白质。

(2)用索式提取法提取样品中的油脂

2.1包装和干燥

在上述已称重的滤纸包中装入1g左右研细的样品，封好包口，放入105±2℃的烘箱中干燥3h，移至干燥器中冷却至室温。按顺序号依次放入称量瓶中称重(记作b)。

2.2抽提

将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67倍的无水乙醚，使样品包完全浸没在乙醚中。连接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒温水浴中进行抽提，调节水温在70～80℃之间，使冷凝下滴的乙醚成连珠状(120～150滴/min或回流7次/h以上)，抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止(约需6～12h)。抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，在通风处使乙醚挥发(抽提室温以12～25℃为宜)。提取瓶中的乙醚另行回收。

2.3称重

待乙醚挥发之后，将滤纸包置于105±2℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重为止(记作c)。

2.4结果与计算

粗脂肪含量(％)＝(b－c)/(b－a)×100

式中：a：称量瓶加滤纸包重(g)

b：称量瓶加滤纸包和烘干样重(g)

c：称量瓶加滤纸包和抽提后烘干残渣重(g)

(3)测定灰分

3.1样品称量--以灰分量10-100mg来决定试样的采取量。

3.2样品处理--将样品粉碎均匀备用，称量时烘干至恒重。

3.3瓷坩埚处理--将坩埚用体积分数为20％的盐酸煮1-2h，洗净晒干后，用氯化铁与蓝墨水的混合液或铅笔在坩埚外壁、底部及盖上写上编号。置于马弗炉中，在600℃灼烧0.5h。取出，冷却至200℃以下时，移入干燥器内冷却至室温后称重。重复灼烧至恒重。

3.4称取样品1g左右于坩埚中；在电炉上小心加热，使样品充分炭化至无烟。然后将坩埚移至高温电炉中，在500-600℃灼烧至无炭粒(即灰化完全)。冷却到200℃以下时，移入干燥器中冷却至室温后称量，重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5mg为恒重。

3.5结果计算

X₁＝(m₁-m₀)/(m₂-m₀)*100％

式中x₁——样品中灰分的质量分数，％

m₀——坩埚的质量，g

m₁——坩埚和总灰分的质量，g

m₂——坩埚和样品的质量，g

(4)用洗涤法测定酸性纤维和中性纤维含量

4.1中性洗涤纤维含量的测定

分析天平准确称取0.5g经105℃烘干至恒重的样品两份，放入500mL锥形瓶中，加入100mL中性洗涤剂溶液(a.将9.31gNa2-EDTA和3.41g四硼酸钠用100mL水加热溶解；b.另将15g十二烷基硫酸钠和5g乙二醇乙醚溶于100L热水中，合并于a液中；c.把2.28g磷酸氢二钠溶于100mL热水中，并于a液中；用磷酸调节混合液pH至值为6.9-7.1，最后加水至500mL。)加入2滴正丁醇，连接好回流装置，于恒温水浴锅中加热，使之在5-20min内沸腾，准确微沸1h。取下，用滤纸过滤，用热水洗涤锥形瓶，将洗液过滤，用30-50mL沸水分3-5次洗涤残渣，将残渣全部转入锥形瓶中，最后用25mL丙酮洗涤残留物，待丙酮挥发殆尽。将滤纸与残留物置于105℃恒温干燥箱中干燥8h以上，移至干燥器中冷却至室温后称重，计算中性洗涤纤维的含量。计算公式：

$x=\frac{m_2-m_0}{m_1}\×100$

式中x--样品中中性洗涤纤维的质量分数，％；

m₂--滤纸与样品残留物干燥后的质量，g；

m₀--滤纸的质量，g；

m₁--样品的质量，g。

4.2酸性洗涤纤维的测定

酸性洗涤纤维含量的测定采用范氏纤维测定法

用分析天平准确称取1g经105℃烘干至恒重的样品两份，放入500mL锥形瓶中，加入100mL酸性洗涤剂溶液(加14mL浓硫酸于水中并稀释至500mL。用此溶液溶解5g十六烷基三甲基溴化铵，冷却至室温)，2mL食用植物油，连接好回流装置。于恒温水浴锅中加热，使之在3-5min内沸腾，维持微微沸腾1h。取下，用预先烘干至恒重的滤纸过滤，用热水洗涤锥形瓶，将洗液过滤，用30-50mL沸水分3-5次洗涤残渣，后用25mL丙酮洗涤残留物，待丙酮挥发殆尽后将滤纸与残留物置于105℃恒温干燥箱中干燥8h以上，移至干燥器中冷却至室温后称重，计算酸性洗涤纤维的含量。计算公式：

$x=\frac{m_2-m_0}{m_1}\×100$

式中x--样品中酸性洗涤纤维的质量分数，％；

m₂--滤纸与样品残留物干燥后的质量，g；

m₀--滤纸的质量，g；

m₁--样品的质量，g。

表1

由表1可以看出本发明制备的固态发酵蛋白饲料具有蛋白质含量高，脂肪含量高，营养丰富。

瘘管羊实验结果分析

取动物实验时间段为0h，6h，12h，24h，36h，48h，72h的样品进行粗蛋白含量测定，并计算其消化率，结果如表2，中性纤维和酸性纤维的测定结果如下表2所示。

表2

测定因素

0h

6h

12h

24h

36h

48h

72h

对照组蛋

13.56±0.55

11.24±0.31

10.33±0.78

9.86±0.31

8.41±0.23

8.11±0.65

6.19±0.73

蛋白含量

24.65±0.46

11.89±0.46

11.23±0.13

10.65±0.25

9.99±0.13

7.15±0.13

5.83±0.13

纤维素

12.03±1.78

9.98±0.82

9.49±0.32

8.44±0.24

7.83±0.36

7.69±0.08

7.57±0.25

对照组为未发酵的底料。表2的数据说明了发酵饲料的一个粗蛋白消化率优势。且其中含有的有益菌能够促进肠道的消化，减少动物的犯病几率。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种固态发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

(1) 首先配制PDA 液体培养基，然后用牛皮纸封好后，在110-140℃下灭菌10-30min，冷却后将黑曲霉孢子、产阮假丝酵母、植物乳酸杆菌分别放入灭菌后的PDA 液体培养基中进行培养活化菌种，培养温度为25-35℃，培养时间为2-4 天；

(2) 以豆渣、啤酒渣和苹果渣为发酵底料，豆渣、啤酒渣和苹果渣的重量比为50-80:10-40:10，然后往发酵底料中加入水，料水比为60-70％，然后以步骤(1) 活化后的黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌为发酵菌，加入到发酵底料中进行发酵，发酵菌的加入量是发酵底料总体积的5-10％，黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌的重量比为1-4:1-4:1，发酵温度为30-40℃，发酵时间为2-5 天；

(3) 发酵完成后，将样品取出，自然冷却后包装即可得到固态发酵蛋白饲料。

2.如权利要求1 所述的固态发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于：步骤(1) 中，在121℃下灭菌20min。

3.如权利要求1 所述的固态发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于：步骤(1) 中，培养温度为30℃，培养时间为3 天。

4.如权利要求1 所述的固态发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于：步骤(2) 中，豆渣、啤酒渣和苹果渣的重量比为60:30:10。

5.如权利要求1 所述的固态发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于：步骤(2) 中，料水比为65％。

6.如权利要求1 所述的固态发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于：步骤(2) 中，发酵菌的加入量是发酵底料总体积的8％。

7.如权利要求1 所述的固态发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于：步骤(2) 中，黑曲霉孢子、产阮假丝酵母和植物乳酸杆菌的重量比为2:2:1。

8.如权利要求1 所述的固态发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于：步骤(2) 中，发酵温度为37℃，发酵时间为4 天。